環(huán)狀RNA與腫瘤研究進展

宋東強，史冬敏，張順財

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032 2.復旦大學附屬中山醫(yī)院消化科，上海 200032

近期，Science、MolecularCell雜志分別報道了環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)的最新研究成果[1-2]，使circRNA重新受到廣泛關(guān)注。circRNA是一類普遍存在于真核細胞基因組中，具有基因調(diào)控作用的內(nèi)源性RNA。20世紀70年代，circRNA首次在病毒中被發(fā)現(xiàn)[3]，隨后在酵母線粒體中被找到[4]。在過去近30年內(nèi)，circRNA被證實存在于病毒、古生菌、植物和人體細胞等多種生物體內(nèi)[5-9]。但其一直被認為是在轉(zhuǎn)錄過程中錯誤剪接而形成的副產(chǎn)物，無重要生物學功能。

近年來，隨著生物物理學、RNA測序技術(shù)和生物信息學等技術(shù)的快速發(fā)展，高通量、長讀段為特征的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)被發(fā)現(xiàn)，生物體中越來越多的 circRNA隨之被發(fā)現(xiàn)。Memczak等[10]通過RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)合人白細胞數(shù)據(jù)庫，在人類、小鼠及線蟲中分別鑒定出1 950種、1 903種和724種circRNA(其中小鼠與人類有81種circRNA相同)，并成立了1個circRNA數(shù)據(jù)庫(http://www.circbase.org/)，可在線查詢。Liu等[11]通過檢測464例人RNA-seq樣本的全轉(zhuǎn)錄組，鑒定了circRNA的表達譜(包含已知和新發(fā)現(xiàn)的circRNA)，并在此基礎(chǔ)上建立了目前第1個提供組織特異性的circRNA表達譜以及circRNA-miRNA基因調(diào)節(jié)通路的公共數(shù)據(jù)庫，即CircNet Database (http://circnet.mbc.nctu.edu.tw/)。上述研究使人們認識到基因外顯子可3′端和5′端共價連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的circRNA在真核細胞內(nèi)表達豐富且穩(wěn)定，這種結(jié)構(gòu)能抗RNA外切酶降解。

1 circRNA的形成

關(guān)于circRNA的形成機制尚無定論，目前主要有2種機制。(1)在轉(zhuǎn)錄過程中，前體mRNA(pre-mRNA)中的外顯子轉(zhuǎn)錄本被非線性地反向剪接形成circRNA，分為套索驅(qū)動的環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化(圖1A,1B)。這種circRNA被稱為外顯子來源的circRNA[12-13]。(2)另外一種理論認為內(nèi)含子也可以形成circRNA。Zhang等[14]提出了內(nèi)含子自身環(huán)化(圖1C)，這類由內(nèi)含子自身環(huán)化形成的circRNA被稱為內(nèi)含子circRNA。

圖1 環(huán)狀RNA形成示意圖

A：內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化[15]；B：套索驅(qū)動的環(huán)化[15]；C：內(nèi)含子自身環(huán)化[14]

2 circRNA的特征

circRNA的主要特征包括：(1)circRNA廣泛存在于多種真核生物中，包括人類[16-18]；(2)主要位于細胞質(zhì)，少數(shù)位于細胞核[14]，非常穩(wěn)定，不易被核酸外切酶RNaseR降解[10,16,19]；(3)大部分circRNA具有高度保守序列[16,18]；(4)circRNA主要來源于外顯子，內(nèi)含子來源circRNA及由外顯子和內(nèi)含子共同組成的 circRNA則較少[10,16,19-20]；(5)有些circRNA具有微小RNA(microRNA，miRNA)結(jié)合位點，能與miRNA相互結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達[6,16]；(6)大部分通常不編碼蛋白，屬于非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[16]；(7)主要在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用[14,19]；(8)少量circRNA可以翻譯成蛋白質(zhì)[21]。

3 circRNA與腫瘤的相關(guān)性

circRNA的miRNA海綿作用使其能通過競爭性吸附內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控基因表達[10, 22]，具體表現(xiàn)為circRNA通過結(jié)合miRNA來阻斷其對特異靶mRNA的抑制作用，從而調(diào)控miRNA靶基因的表達水平[23]。此外，circRNA還能夠作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，調(diào)控RNA表達[23]、蛋白質(zhì)活性[10, 22]等功能。

3.1 ciRS-7/CDRlas作用機制 circRNA可以通過多個途徑影響腫瘤的進程。ciRS-7/CDRlas是目前研究較多的一種circRNA，其miR-7結(jié)合位點超過70個；ciRS-7/CDRlas通過結(jié)合miR-7抑制miR-7的活性[10]，進而調(diào)控miR-7靶基因的表達[22]。而miR-7涉及多種生物學通路，可直接作用于腫瘤發(fā)生的相關(guān)靶基因，調(diào)控腫瘤因子的表達。

大量研究[24]表明，miR-7對腫瘤具有明顯的抑制作用。在腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移研究中，miR-7通過靶向作用于黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)的3′非編碼區(qū)，負向調(diào)節(jié)其表達水平，阻斷乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程，進而抑制了癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[24]。PAX6是表達于結(jié)直腸癌細胞的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，其通過激活ERK/PI3K信號通路，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達水平，促進結(jié)直腸癌的進展；PAX6也是miR-7的直接靶標，兩者表達負相關(guān)，miR-7能下調(diào)PAX6的表達，抑制結(jié)直腸癌的生長、增殖、轉(zhuǎn)移[25]。Fang等[26]發(fā)現(xiàn)，miR-7可以靶向作用于蘇氨酸激酶(Akt)，負性調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路，從而將肝癌細胞周期阻斷在G0/G1期。在舌鱗癌中，miR-7促使胰島素生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) 下調(diào)，從而削弱IGF1誘導Akt活化的能力，進而阻斷細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡[27]。在乳腺癌MDA-MB-468、肺癌A549細胞及膠質(zhì)母細胞瘤DU145中，miR-7能顯著降低表皮生長因子受體( epidermal growth factor receptor protein，EGFR)的表達水平，從而抑制腫瘤細胞周期,基因芯片進一步發(fā)現(xiàn)，癌基因Raf1、蛋白激酶B(PKB)及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)的下降[28]。但是，miR-7也有促癌作用。如病毒致癌基因E6/E7在HPV陽性的HeLa細胞系中的表達水平與miR-7正相關(guān)[29]。Nakagawa等[30]發(fā)現(xiàn)，miR-7在人結(jié)直腸癌組織中的表達水平顯著高于正常黏膜。因此，ciRS-7/CDRlas通過調(diào)控miR-7水平而調(diào)節(jié)腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移等。

3.2 消化道惡性腫瘤 Bachmayr-Heyda等[31]通過對31對人結(jié)腸癌組織和相應的癌旁組織進行RNA測序，發(fā)現(xiàn)circRNA的豐度顯著低于對應的正常結(jié)腸組織。Li等[32]通過檢測101對胃癌及癌旁組織標本中hsa_cir_002059的表達水平及其與臨床病理學特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)該circRNA在胃癌組織中表達下調(diào)，且與TNM分期以及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示hsa_cir_002059可作為胃癌診斷的一個潛在分子標志物。另外，Li等[33]分別對358、326對人食管癌和對應的癌旁組織進行qRT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cir-ITCH在食管癌的表達水平顯著低于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計學意義。cir-ITCH通過海綿吸附miR-216b、miR-17、miR-214、miR-7和miR-128，間接提高miRNA靶基因ITCH的表達水平，而高表達的ITCH能夠促進磷酸化Dvl2的泛素化和降解，通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路抑制腫瘤細胞的增殖[33]。

3.3 肝細胞肝癌 Qin等[34]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001649在肝癌細胞中明顯下調(diào)，其表達與腫瘤大小明顯負相關(guān)(P=0.045)，同時發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001649的表達與癌栓形成相關(guān)。在細胞實驗中，用siRNA下調(diào)肝癌細胞系HCC-LM3和MHCC-97L中的hsa_circ_0001649，MMP9、 MMP10和MMP13的mRNA表達水平顯著上升，表明hsa_circ_0001649可能與肝癌轉(zhuǎn)移密切有關(guān)。Huang等[35]應用基因芯片技術(shù)分別檢測了肝癌及癌旁組織circRNA的表達差異，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，肝癌組織中有226個circRNA的表達有明顯差異，其中189個上調(diào)、37個下調(diào)；通過qRT-PCR進一步驗證發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_104075和 hsa_circRNA_100338明顯上調(diào)。Huang等[35]進一步在臨床上選擇了80例乙肝相關(guān)的肝細胞肝癌患者的肝癌組織樣本，選擇表達明顯升高的hsa_circRNA_100338作為檢測目的基因，發(fā)現(xiàn)癌組織及癌旁組織均有circRNA_100338表達，且circRNA_100338低表達組的累計生存率(72%)明顯高于高表達組(42.9%)；circRNA_100338表達與TNM分期、血管侵襲和肺轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，circRNA_100338可以作為乙肝相關(guān)肝癌預后評價的生物標志物。

circRNA還有可能通過調(diào)控肝癌細胞細胞周期促進腫瘤進展。Ren等[36]應用Arraystar Human circRNA Array 和Arraystar Human mRNA Array芯片分析肝癌組織的circRNA和mRNA，發(fā)現(xiàn)127個circRNA(113上調(diào)、14下調(diào))和3 235個mRNA(1 923個上調(diào)、1 312個下調(diào))的表達有顯著差異。通過KEGG Pathway分析和GO 分析3 235個mRNA發(fā)現(xiàn)，表達上調(diào)的mRNA主要參與細胞周期及細胞分裂，而下調(diào)基因與各種代謝過程有關(guān)。該研究選擇了5個上調(diào)最顯著的circRNA作為研究對象，通過miRNA數(shù)據(jù)庫預測circRNA與miRNA 的相互作用，構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，這些mRNA參與腫瘤相關(guān)信號通路，如p53信號通路、血管生成和細胞周期信號通路。為了驗證預測結(jié)果的準確性，Ren等[36]進一步在40例肝癌組織樣本中，應用qRT-PCR分析這5 個circRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，肝癌組織中circZFR、circFUT8和circPO11表達水平顯著升高，與芯片分析結(jié)果一致，說明circZFR、circFUT8和circPO11可作為腫瘤診斷及治療新的生物標志物。

3.4 其他腫瘤 類似的生物信息學技術(shù)同樣在其他腫瘤[37-39]中得到廣泛應用。越來越多的腫瘤，如肺癌[40]、口腔鱗癌[41]中發(fā)現(xiàn)了circRNA的表達，且參與多種信號通路的調(diào)控，為腫瘤的早期診斷及治療提供新的依據(jù)及治療靶點。

4 問題與展望

腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的惡性疾病。由于癌癥的復雜性，人們對癌癥發(fā)生和發(fā)展機制的認識還不能滿足對其防、診、治的需求。因此，深入解析癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機制和調(diào)控規(guī)律，進而研發(fā)癌癥的早期檢測、分子分型和預后預測方法及新型治療藥物等，是生物醫(yī)學研究的重要任務(wù)。隨著新一代RNA測序技術(shù)和生物信息學技術(shù)的發(fā)展，circRNA在越來越多的腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，且對各種腫瘤中circRNA的結(jié)構(gòu)、功能有了更深入的理解。circRNA表達穩(wěn)定、半衰期長，同時在不同腫瘤中特異表達等特點，使其可能成為新的腫瘤標志物應用于腫瘤的早期診斷和篩查。同時，circRNA表達與腫瘤生物學特性密切相關(guān)，使其可能成為腫瘤個體化治療及靶向治療等新藥研發(fā)的新靶點,將來可以通過人工合成circRNA的方式將其應用于腫瘤的靶向治療。但circRNA仍有很多未知功能有待進一步研究，其臨床適用性也需要進一步探索。