牦牛lncFAM200B的克隆鑒定、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

趙麗玲，王 會(huì)，柴志欣，王吉坤，王嘉博，武志娟， 信金偉，鐘金城，姬秋梅

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041； 2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850000)

牦牛(Bosgrunniens)作為高原地區(qū)的特有牛種，耐粗飼，抗病能力強(qiáng)，能夠在氧氣稀缺，氣候寒冷，牧草生長(zhǎng)季短的高寒草地環(huán)境下生存繁衍[1]。牦牛獨(dú)特的生存環(huán)境使其肉質(zhì)具有高蛋白和低脂肪的特點(diǎn)，但由于脂肪含量低，導(dǎo)致牦牛肉口感較差。因此，研究影響牦牛肌肉和脂肪發(fā)育的分子機(jī)制對(duì)改善牦牛肉品質(zhì)具有重要意義。

lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200 nt且多數(shù)不具有蛋白編碼能力的RNAs[2]，其物種間保守性差，可在不同層面發(fā)揮調(diào)控作用，主要作用機(jī)制：參與基因印記[3]，通過(guò)染色質(zhì)重塑[4]和組蛋白修飾[5]等方式從表觀遺傳水平調(diào)控基因表達(dá)；在轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)順式作用影響鄰近基因表達(dá)[6]，作為誘餌分子招募轉(zhuǎn)錄因子[7]或RNA聚合酶Ⅱ[8]從而促進(jìn)或抑制基因表達(dá)；lncRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)招募蛋白質(zhì)或與miRNA結(jié)合，從而影響靶基因的可變剪接、mRNA穩(wěn)定性以及翻譯過(guò)程[9-11]。Billerey等[12]采用RNA-seq技術(shù)在利木贊牛肌肉中鑒定出584個(gè)lncRNAs，預(yù)測(cè)這些lncRNAs在肌肉發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用。Sun等[13]發(fā)現(xiàn)，lncMD與秦川牛骨骼肌分化相關(guān)，過(guò)表達(dá)lncMD促進(jìn)肌細(xì)胞分化，抑制其表達(dá)則導(dǎo)致肌細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志基因MHC和MyoG表達(dá)量下降，進(jìn)而影響肌肉發(fā)育。Li等[14]發(fā)現(xiàn)一個(gè)在胎牛和成年牛骨骼肌中差異表達(dá)的lncRNAMDNCR，MDNCR可通過(guò)吸附miR-133a促進(jìn)牛成肌細(xì)胞分化并抑制細(xì)胞增殖。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，lncKBTBD10可通過(guò)影響其鄰近基因KBTBD10表達(dá)，參與牛骨骼肌形成過(guò)程。Liang等[11]構(gòu)建了一個(gè)影響牛乳脂肪合成的lncRNA-miRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，其中涉及41個(gè)lncRNA和11個(gè)miRNA。在牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，lncRNAADNCR作為ceRNA與miR-204結(jié)合，促進(jìn)miR-204靶基因Sirt1表達(dá)，從而抑制脂肪細(xì)胞分化[15]。目前的研究主要關(guān)注牦牛繁殖性能[16]及乳腺發(fā)育[17]相關(guān)lncRNA，而對(duì)牦牛脂肪和肌肉發(fā)育相關(guān)lncRNA的報(bào)道較少。

研究發(fā)現(xiàn)，lncFAM200B在不同年齡秦川牛的肌肉和脂肪組織中差異表達(dá)，其第一內(nèi)含子區(qū)域存在一個(gè)SNP位點(diǎn)，該多態(tài)位點(diǎn)與其體高、體斜長(zhǎng)等生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)[18]。然而，對(duì)于牦牛lncFAM200B序列特征的研究尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)基因克隆和原核表達(dá)試驗(yàn)分析并鑒定了牦牛lncFAM200B的序列特征和蛋白編碼能力；RT-qPCR檢測(cè)lncFAM200B在牦牛不同組織中的表達(dá)水平，最后通過(guò)TargetScan 7.1和miRanda軟件預(yù)測(cè)與lncFAM200B具有潛在相互作用miRNA的靶基因。為進(jìn)一步解析該lncRNA在肌肉和脂肪發(fā)育過(guò)程中的功能及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

選取0.5，4.5歲健康的類烏齊母牦牛各3頭，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀肌和臀脂組織，用錫箔紙包裹并標(biāo)記，迅速置于液氮中保存。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

分別稱取0.05～0.10 g牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀肌、臀脂組織于液氮中研磨，采用TRIzol法提取各組織總RNA，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純度。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time))說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成。簡(jiǎn)要步驟： ①去除基因組DNA，反應(yīng)體系為5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 800 ng，加RNase Free H2O至10 μL，42 ℃反應(yīng)2 min； ②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為第①步反應(yīng)液10 μL，RNase Free H2O 4 μL，5×Prime Script Buffer 2(for Real time)4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，總體系20 μL。反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。所得cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 lncFAM200B克隆

采用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)張思?xì)g[18]研究所得lncFAM200B序列設(shè)計(jì)克隆引物，克隆引物在牦?；蚪M中的位置如圖1所示。以克隆所得全長(zhǎng)序列為模板設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，內(nèi)參基因選擇GAPDH(NM_001034034.2)、UXT(NM_001037471.2)和RPS9(NM_001101152.2)，引物序列如表1所示。所有引物由北京擎科生物科技有限公司(成都分公司)合成。

橫線.牦?；蚪M;橙色矩形.上游引物;藍(lán)色矩形.下游引物。 The horizontal line represents the yak genome; The orange rectangle indicates forward primer; The blue rectangle indicates reverse primer.

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

以牦牛臀肌cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：2×Dream Taq Green PCR Master Mix 12.5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54.8 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段，按照膠回收試劑盒說(shuō)明書回收目的片段。將膠回收產(chǎn)物連接至pGEM-T載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 lncFAM200B ORF及編碼能力預(yù)測(cè)

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Open Reading Frame Finder工具分析lncFAM200B全長(zhǎng)序列，預(yù)測(cè)其開放閱讀框。借助Coding Potential Calculator(CPC)網(wǎng)站(http://cpc.cbi.pku.edu.cn/)和Coding Potential Assessment Tool(CPAT)(http://lilab.research.bcm.edu/cpat/)在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)其編碼潛能，以蛋白編碼基因GAPDH和已被驗(yàn)證的長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19作為參照。

1.5 lncFAM200B原核表達(dá)

根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，使用Primer Premier 5.0分析lncFAM200B的酶切位點(diǎn)，選取pET-28a作為原核表達(dá)載體，將lncFAM200B全長(zhǎng)序列亞克隆至pET-28a載體上。陽(yáng)性對(duì)照選擇青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的CSN3-28a原核表達(dá)質(zhì)粒。

含BamHⅠ和HindⅢ 2個(gè)酶切位點(diǎn)的lncFAM200B片段與pET-28a質(zhì)粒同時(shí)雙酶切，酶切體系：10×K Buffer 2 μL，BamHⅠ/HindⅢ各1 μL，pET-28a/lncFAM200B8 μL，加ddH2O至20 μL，37 ℃水浴3 h。酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收，采用T4DNA連接酶連接膠回收產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒lncFAM200B-28a表達(dá)菌種，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。

經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定的陽(yáng)性菌液，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，以CSN3-28a為陽(yáng)性對(duì)照，空載pET-28a為陰性對(duì)照，各加入終濃度為0.5，0.8，1.0 mmol/L IPTG溶液，誘導(dǎo)表達(dá)6 h。取1.5 mL誘導(dǎo)后的菌液沉淀，500 μL PBS緩沖液重懸沉淀，取12 μL菌液懸浮液與3 μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer于沸水中煮沸10 min，菌體完全裂解后，取12 μL用于SDS-PAGE分析。凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色，脫色液脫色，凝膠成像。

1.6 lncFAM200B組織表達(dá)譜

分別取0.5，4.5歲牦牛6個(gè)組織的cDNA，通過(guò)Real-time PCR反應(yīng)檢測(cè)lncFAM200B在牦牛各組織中的表達(dá)水平，反應(yīng)體系：TB Premix Ex TaqTMⅡ5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase-Free ddH2O 3.2 μL，總體系10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，39個(gè)循環(huán)后制作溶解曲線，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)。

1.7 lncFAM200B靶基因預(yù)測(cè)

利用miRDB(http://mirdb.org/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選與lncFAM200B存在相互作用的miRNAs。結(jié)合生物學(xué)功能，選擇在線預(yù)測(cè)軟件TargetScan 7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)和miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)分別篩選與lncFAM200B存在相互作用miRNAs的靶基因，利用在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取2個(gè)預(yù)測(cè)軟件靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果交集，通過(guò)DAVID在線軟件(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)交集靶基因進(jìn)行GO富集和KEGG信號(hào)通路分析；利用RBPDB(http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能與lncFAM200B結(jié)合的靶蛋白。

1.8 數(shù)據(jù)分析

選擇GAPDH、UXT和RPS9幾何平均值校正內(nèi)參基因表達(dá)量[19]，采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncFAM200B在各組織中的相對(duì)表達(dá)量，用SPSS 18.0軟件中的One-Way ANOVA方法進(jìn)行顯著性分析，并用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 lncFAM200B克隆

以牦牛臀肌cDNA為模板，PCR擴(kuò)增后經(jīng)電泳檢測(cè)獲得單一目的條帶(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明，lncFAM200B全長(zhǎng)大小為531 bp。

M.DNA Marker DL2000；1.lncFAM200B基因；2.陰性對(duì)照。 M.DNA Marker DL2000;1.lncFAM200B gene;2.Negative control.

2.2 lncFAM200B序列分析

采用DNAMAN軟件進(jìn)行牦牛、普通牛lncFAM200B序列相似性分析，發(fā)現(xiàn)牦牛lncFAM200B序列與普通牛序列的83～142 bp(約59 bp)存在差異(圖3)，共存在6個(gè)堿基差異位點(diǎn)。

利用NCBI-Open Reading Frame Finder預(yù)測(cè)lncFAM200B開放閱讀框，得到35條預(yù)測(cè)結(jié)果，其中最長(zhǎng)的開放閱讀框包含174個(gè)堿基，編碼57個(gè)氨基酸，小于一般編碼基因的氨基酸數(shù)(100 aa)，而該lncRNA長(zhǎng)度大于200 nt，說(shuō)明lncFAM200B可能是長(zhǎng)鏈非編碼RNA。利用在線編碼能力預(yù)測(cè)工具CPC、CPAT對(duì)lncFAM200B、已知lncRNAH19和編碼基因GAPDH的編碼能力進(jìn)行分析，如表2，3所示，lncFAM200B的注釋結(jié)果均為非編碼，進(jìn)一步說(shuō)明lncFAM200B可能為非編碼RNA(表2，3)。

Bos grunniens lncFAM200B.牦牛lncFAM200B；Bos taurus lncFAM200B.普通牛lncFAM200B。

表2 CPC網(wǎng)站編碼能力預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.2 Coding capability prediction results of CPC

表3 CPAT網(wǎng)站編碼能力預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.3 Coding capability prediction results of CPAT

2.3 lncFAM200B原核表達(dá)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證lncFAM200B是否具有編碼能力，本研究構(gòu)建了lncFAM200B原核表達(dá)載體，根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取重組質(zhì)粒lncFAM200B-28a，使用BamHⅠ、HindⅢ酶進(jìn)行雙酶切鑒定。由圖4可知，除5 369 bp載體片段外，lncFAM200B-28a還檢測(cè)出一條531 bp大小的條帶，通過(guò)測(cè)序確認(rèn)成功構(gòu)建lncFAM200B原核表達(dá)載體。

經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示(圖5)，lncFAM200B-28a與陰性對(duì)照，即空載pET-28a表達(dá)情況一致，相同試驗(yàn)條件下，陽(yáng)性對(duì)照CSN3-28a成功表達(dá)25.32 ku左右的蛋白(CSN3表達(dá)21.58 ku蛋白，載體可表達(dá)3.74 ku蛋白)。綜合生物信息學(xué)分析結(jié)果及原核表達(dá)結(jié)果，確定lncFAM200B為長(zhǎng)鏈非編碼RNA。

M.Marker Ⅲ；1.未酶切l(wèi)ncFAM200B-28a載體； 2.lncFAM200B-28a雙酶切結(jié)果。 M.Marker Ⅲ;1.Undigested lncFAM200B-28a vector; 2.lncFAM200B-28a double digestion results.

2.4 lncFAM200B組織表達(dá)結(jié)果分析

采用RT-qPCR技術(shù)分別檢測(cè)lncFAM200B在0.5，4.5歲牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀肌和臀脂中的相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR結(jié)果(圖6)顯示，lncFAM200B在0.5歲牦牛各組織中均存在表達(dá)，在肺臟中的表達(dá)水平顯著高于其他組織(P<0.05)，但在4.5歲牦牛中，肺臟、肝臟表達(dá)量與臀肌、臀脂表達(dá)量差異顯著(P<0.05)；lncFAM200B在4.5歲牦牛心臟、肝臟、脾臟3個(gè)組織中的表達(dá)量顯著高于0.5歲，在肺臟中的表達(dá)量顯著低于0.5歲，臀肌和臀脂中的表達(dá)量在2個(gè)年齡之間差異不顯著(P>0.05)。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-3.IPTG濃度0.5 mmol/L；4-6.IPTG濃度0.8 mmol/L；7-9.IPTG濃度1 mmol/L；1,4,7.空載體pET-28a；2,5,8.lncFAM200B-28a；3,6,9.CSN3-28a；藍(lán)色箭頭代表陽(yáng)性對(duì)照CSN3-28a表達(dá)的25.32 ku蛋白位置。

字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；小寫字母不同表示同年齡不同組織間差異顯著(P<0.05)；大寫字母表示lncFAM200B表達(dá)量在2個(gè)年齡之間差異顯著。

2.5 靶基因預(yù)測(cè)分析

利用miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出24個(gè)可能與lncFAM200B存在相互作用的miRNAs，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)8個(gè)可能與肌肉及脂肪發(fā)育相關(guān)的miRNAs，分別是miR-411-5p[20]、miR-212-5p[21]、miR-138-5p[22]、miR-429[23]、miR-200b-3p[24]、miR-200c-3p[25]、miR-3613-3p[26]、miR-628-3p[27]。其中，miR-411-5p與lncFAM200B的結(jié)合位點(diǎn)位于101 bp處(圖7)，處于牦牛lncFAM200B相較于普通牛多出的59 bp內(nèi)(圖3)。采用TargetScan 7.1和miRanda分別對(duì)上述8個(gè)miRNAs篩選出1 626，1 575個(gè)潛在靶基因，其中包括與脂肪代謝相關(guān)的沉默信息調(diào)節(jié)因子基因(Sirt1)、肌鈀蛋白基因(MYPN)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因(KLF9)、硬脂酰輔酶5基因(SCD5)、磷酸酶基因及張力蛋白同源蛋白基因(PTEN)等。結(jié)合miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)及2個(gè)預(yù)測(cè)軟件的分析結(jié)果，借助Cytoscape軟件構(gòu)建lncFAM200B-miRNA-mRNA靶向關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖(圖8)。

藍(lán)色字體序列為miR-411-5p與lncFAM200B結(jié)合位點(diǎn)。 The blue font sequence is miR-411-5p and lncFAM200B binding sites.

圖8 lncFAM200B與靶基因調(diào)控關(guān)系圖Fig.8 Relationship between lncFAM200B and target gene

利用TargetScan 7.1和miRanda 2個(gè)工具對(duì)與lncFAM200B相互作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并取交集(圖9)，共獲得433個(gè)靶基因。對(duì)靶基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，靶基因參與80個(gè)功能分類，注釋到生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能3大類，其中生物學(xué)過(guò)程主要注釋到RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移的負(fù)調(diào)控、小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞質(zhì)、核、核質(zhì)、核染色質(zhì)、粘著斑等，分子功能主要涉及染色質(zhì)結(jié)合、核苷酸結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、mRNA結(jié)合等(圖10)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，靶基因共富集到9個(gè)通路上，其中富集程度最高的通路是癌癥中的microRNAs(圖11)。利用RBPDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出55個(gè)可能與lncFAM200B結(jié)合的靶蛋白(表4)，具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的靶蛋白包括EIF4B、RBMX、SFRS1、KHDRBS3、ELAVL1等蛋白，其中HNRNPA1[28]、FUS[29]、Pum2[30]、MBNL[31]4個(gè)靶蛋白可能與肌肉和脂肪發(fā)育相關(guān)。

圖9 miRanda與Targetscan靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果韋恩圖Fig.9 The target gene Vienn diagram of miRanda and Targetscan

圖10 靶基因GO功能富集分析結(jié)果圖Fig.10 GO functional enrichment analysis of target gene

圖11 靶基因KEGG通路富集分析Fig.11 KEGG pathway enrichment analysis of target gene

3 討論與結(jié)論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和對(duì)非編碼RNA研究的不斷深入，大量lncRNA被挖掘且功能和作用機(jī)制也逐漸被闡明。本研究獲得牦牛lncFAM200B全長(zhǎng)531 bp，較張思?xì)g[18]的秦川牛lncFAM200B全長(zhǎng)多59 bp，經(jīng)原核表達(dá)試驗(yàn)驗(yàn)證，牦牛lncFAM200B也不具備編碼蛋白的能力，在牦牛中也是一個(gè)真正的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。

3.1 lncFAM200B組織表達(dá)分析

本研究中，lncFAM200B在0.5，4.5歲牦牛的臀肌、臀脂中的表達(dá)量差異不顯著，與張思?xì)g[18]發(fā)現(xiàn)lncFAM200B在成年牛肌肉中的表達(dá)水平顯著高于犢牛的研究結(jié)果不同。首先，牦牛lncFAM200B序列與普通牛lncFAM200B序列存在差異，可能導(dǎo)致與其結(jié)合的靶基因發(fā)生變化；其二，lncRNA作為非編碼RNA，在各物種間的保守性較差，表達(dá)豐度低[2]，可能導(dǎo)致其在各組織中的表達(dá)水平發(fā)生變化；其三，與牦牛肉脂肪含量低相關(guān)，研究表明，牦牛肉的脂肪含量小于秦川牛[32]，脂肪沉積是影響肉質(zhì)風(fēng)味的重要因素之一。而本研究中l(wèi)ncFAM200B在0.5歲牦牛肺臟中的表達(dá)量顯著高于其他組織，牦牛作為高原地區(qū)的特有牛種，在長(zhǎng)期的自然選擇下，其肺臟已形成特定的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)適應(yīng)高壓低氧環(huán)境，如肺微動(dòng)脈管壁和肺血-氣屏障均薄于低海拔地區(qū)的哺乳動(dòng)物[33]，這種特點(diǎn)在低齡牦牛中表現(xiàn)更為明顯。因此，lncFAM200B在牦牛肺臟組織中高表達(dá)，可能與牦牛的高原低氧適應(yīng)性相關(guān)。

表4 lncFAM200B靶蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.4 lncFAM200B target protein prediction results

3.2 lncFAM200B-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析

本研究借助miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出8個(gè)可能與lncFAM200B調(diào)控肌肉和脂肪發(fā)育相關(guān)的miRNA，包括miR-411-5p、miR-212-5p、miR-138-5p等。其中miR-411屬于miR-379家族，位于人類14號(hào)染色體[34]上DLK-DIO3區(qū)的miR-379/miR-656簇中。Harafuji等[35]研究發(fā)現(xiàn)，miR-411在面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(FSHD)成肌細(xì)胞中的表達(dá)與正常成肌細(xì)胞相比顯著上調(diào)，此外，過(guò)表達(dá)miR-411可抑制YAF2基因及肌源性標(biāo)記基因MYOD、MYOG和MYH1的表達(dá)。miR-411-5p在橫紋肌肉瘤(RMS)中可作為分化誘導(dǎo)因子，miR-411-5p可通過(guò)直接下調(diào)SPRY4表達(dá)來(lái)促進(jìn)p38MAPK活化[20]。而miR-411與lncFAM200B的結(jié)合位置位于比張思?xì)g[18]研究中增加的59 bp內(nèi)，推測(cè)存在差異的59 bp可能導(dǎo)致lncFAM200B在牦牛和普通牛中的功能存在差異。在經(jīng)氧化的低密度脂蛋白處理的THP-1型巨噬細(xì)胞中，miR-212通過(guò)靶向Sirt1來(lái)抑制與脂質(zhì)代謝和膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的ATP結(jié)合盒式運(yùn)載蛋白A1(ABCA1)表達(dá)，從而促進(jìn)脂質(zhì)積累和減少膽固醇外流[21]。Guo等[36]的研究結(jié)果顯示，亮氨酸缺乏會(huì)顯著增加miR-212在肝中的表達(dá)水平，miR-212-5p通過(guò)與脂肪酸合酶(FAS)和乙酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)的3′UTR結(jié)合來(lái)抑制酶活，此外，過(guò)表達(dá)miR-212可顯著降低甘油三酸酯(TG)積累。上述研究表明，miR-212在脂質(zhì)代謝和積累過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Liu等[37]通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告分析發(fā)現(xiàn)，miR-138可直接與磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)的3′UTR結(jié)合，從而抑制PDK1表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-138可降低ASMCs的增殖，抑制miR-138表達(dá)則得到相反的結(jié)果。在另一研究中，miR-138可通過(guò)抑制Sirt1表達(dá)而促進(jìn)db/db小鼠平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[22]。推測(cè)lncFAM200B可能通過(guò)直接與這些miRNAs結(jié)合或與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合靶基因，從而調(diào)控牦牛肌肉和脂肪的發(fā)育過(guò)程。

整合TargetScan 7.1和miRanda 2個(gè)靶基因預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)結(jié)果，獲得433個(gè)靶基因，包括Sirt1、MYPN、KLF9、SCD5、PTEN等。Sirt1是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白脫乙酰酶，該基因可通過(guò)抑制PPARγ促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞中脂肪動(dòng)員，并通過(guò)下調(diào)肌細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)來(lái)抑制成肌細(xì)胞分化[38]。MYPN作為肌肉的結(jié)構(gòu)組分，其功能是保持肌節(jié)完整性以及調(diào)節(jié)Z線結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，該基因的多態(tài)性會(huì)影響豬肉肉質(zhì)、胴體性狀[39]。KLF9屬于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在脂肪發(fā)生中期，KLF9通過(guò)C/EBPα調(diào)控PPARγ2的表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪分化進(jìn)程[40]。SCD5是硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)的異構(gòu)體，是催化飽和脂肪酸去飽和化的關(guān)鍵酶，可影響肌內(nèi)脂肪沉積[41]。研究發(fā)現(xiàn)，在牛脂肪細(xì)胞中，干擾PTEN基因表達(dá)可顯著抑制Caspase-3蛋白和提高p-Akt蛋白的表達(dá)，揭示PTEN基因可通過(guò)AKT信號(hào)通路抑制脂肪細(xì)胞凋亡[42]。

對(duì)篩選出的433個(gè)靶基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)注釋到生物學(xué)過(guò)程的靶基因主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程、細(xì)胞分化過(guò)程、細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控過(guò)程等，也涉及白色脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程，肌細(xì)胞的分化和增殖調(diào)控過(guò)程，這可能與lncFAM200B基因參與牦牛肌肉和脂肪發(fā)育調(diào)控有關(guān)。在細(xì)胞組成部分，除了富集程度較高的細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、細(xì)胞骨架、核染色質(zhì)等常規(guī)富集類別外，在對(duì)單個(gè)miRNA靶基因進(jìn)行分析時(shí)，還包括肌動(dòng)蛋白骨架、核膜等類別。在分子功能類別中，靶基因主要富集在RNA及DNA結(jié)合、酶的結(jié)合與活性中，lncFAM200B可能通過(guò)影響靶基因與其他分子的結(jié)合活性或酶活性來(lái)調(diào)控靶基因功能。KEGG信號(hào)通路分析顯示，與lncFAM200B相互作用的miRNAs的靶基因主要富集到癌癥中的miRNA、Focal adhesion信號(hào)通路，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、腫瘤的轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)等。該結(jié)果提示，lncFAM200B可能通過(guò)Focal adhesion信號(hào)通路影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，還可能影響癌癥形成過(guò)程中miRNAs的功能，從而參與癌癥的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。

3.3 lncFAM200B靶蛋白分析

靶蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，lncFAM200B靶蛋白參與RNA剪切和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過(guò)程，HNRNPA1、FUS、Pum2、MBNL1 4個(gè)靶蛋白被證明與肌肉和脂肪發(fā)育相關(guān)。HNRNPA1屬hnRNPs家族成員，敲除HNRNPA1基因的小鼠存在肌肉發(fā)育缺陷，出現(xiàn)了胚胎致死現(xiàn)象。RT-qPCR結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，該基因敲除小鼠中肌肉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)存在顯著差異，如MEF2C、USP28、ABCC9等，推測(cè)該基因在胚胎肌肉發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用[28]。FUS蛋白是hnRNP復(fù)合物的多功能蛋白組分之一，該基因在剪接過(guò)程發(fā)生突變可能導(dǎo)致肌萎縮側(cè)索硬化癥[29]。Pum2蛋白是胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化過(guò)程中的翻譯抑制劑，被認(rèn)為是脂肪干細(xì)胞中細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)因子[30]。MBNL1蛋白是一種C3H型鋅指蛋白，該基因可調(diào)控肌肉相關(guān)基因Trim55和INSR的選擇性剪接，從而抑制肌肉細(xì)胞分化[31]。由此推測(cè)lncFAM200B可能通過(guò)與HNRNPA1、FUS、Pum2、MBNL1相互作用，從而影響肌肉和脂肪的發(fā)育。

本研究成功克隆了牦牛lncFAM200B的全長(zhǎng)序列531 bp，相較于普通牛該lncRNA，其長(zhǎng)度多59 bp，通過(guò)生物信息學(xué)分析和原核表達(dá)結(jié)果證明牦牛lncFAM200B為長(zhǎng)鏈非編碼RNA。RT-qPCR結(jié)果顯示，lncFAM200B在肌肉和脂肪肺臟中的表達(dá)量較高。對(duì)lncFAM200B可能結(jié)合的miRNAs及靶蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示牦牛lncFAM200B與普通牛差異的59 bp區(qū)段存在miR-411-5p的結(jié)合位點(diǎn)，相互作用miRNA的潛在靶基因(Sirt1、MYPN、KLF9、PTEN和SCD5)及靶蛋白(HNRNPA1、FUS、Pum2和MBNL1)與肌肉和脂肪發(fā)育相關(guān)。本研究為進(jìn)一步探索lncFAM200B在牦牛肌肉和脂肪發(fā)育過(guò)程中的功能及分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。