肝細胞癌中CCT4 基因的表達及其臨床意義

俞旭東 錢葉本（通訊作者）

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽 合肥 230022）

肝細胞癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率排名第六的癌癥，并且是導(dǎo)致患者死亡的第四大最常見原因，其特點是高度增殖、異質(zhì)性和侵襲性[1]。肝癌治療方法多樣，主要包括根治性切除術(shù)、肝移植術(shù)、射頻消融術(shù)及放療和化療等方法。但其臨床療效有限，復(fù)發(fā)率高，肝癌患者的生存率較低[2,3]。目前肝癌缺乏特異性預(yù)后標(biāo)志物。TCP1 環(huán)復(fù)合物是一種ATP 依賴性分子伴侶蛋白，其由八個不同的亞基（命名為CCT1 至CCT8）組成。TCP1 環(huán)復(fù)合物可以折疊肌動蛋白和微管蛋白，參與癌細胞的增殖，遷移[4-5]。作為TCP1 環(huán)復(fù)合物的亞基，CCT4 在惡性腫瘤中的作用鮮有報道。本文基于癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共數(shù)據(jù)庫肝癌組織標(biāo)本數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析CCT4 在肝癌中的表達并使用PCR 和免疫組化驗證；同時還分析了其異常表達在肝癌患者中的臨床意義和其潛在機制。本文旨在闡明CCT4 在評估肝癌患者預(yù)后中的價值。

1.資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和處理

從TCGA 數(shù)據(jù)庫 (https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) 下載374 個HCC 組織和50 個正常肝組織樣品的mRNA seqV2 表達譜數(shù)據(jù)和377 例HCC 患者的臨床病理數(shù)據(jù)。下載的臨床數(shù)據(jù)包括的指標(biāo)為生存期、生存狀態(tài)、年齡、性別、分級和TNM 分期。

1.1.1 差 異 表 達 分 析 使 用limma 包(http：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html)分析CCT4 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中所包含的374 個HCC 組織和50 個正常肝組織樣品中的表達差異。

1.1.2 生存曲線 剔除TGCA 數(shù)據(jù)里中肝癌樣本中生存數(shù)據(jù)不全的患者，剩余370 例患者。以CCT4 在這些組織中表達的中位值為截斷值，將患者分為CCT4 高表達組和低表達組。使用survival 包(https：//cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html)分析兩組患者的總生存率。

1.1.3單因素和多因素Cox分析 剔除任意指標(biāo)不全的患者，剩余235 例患者。使用survival 包(https：//cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html)行單因素和多因素Cox分析。

1.1.4 臨床相關(guān)性分析 剔除指標(biāo)不全的患者，剩余370 例年齡信息齊全的患者，371 例性別信息齊全的患者，367 例分級信息齊全的患者，353 例TNM 分期信息齊全的患者，分析各指標(biāo)與CCT4 的表達關(guān)系。

1.1.5 GSEA富集 使用GSEA 軟件(software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)和全基因表達數(shù)據(jù)進行GSEA 富集分析。根據(jù)CCT4 表達中位值將患者分為高表達組和低表達組，比較兩組患者的其他基因表達差異，根據(jù)KEGG 富集要求對差異表達基因進行通路富集。Nom p-val ＜0.05 和FDR q-val ≤0.25 視作有意義。

1.1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 檢索數(shù)據(jù)庫String (https：//string-db.org/)和，Genemania (http：//genemania.org/)以篩選人體內(nèi)和CCT4的互作蛋白。String篩選的基因截斷值為0.4，大于0.4 表示相關(guān)性較強。使用cytoscape 軟件繪圖。

1.2 臨床樣本

我們收集了2015 年-2019 年安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科收治的肝癌患者中的60 例肝細胞癌患者，所有病例經(jīng)手術(shù)后病理資料證實為肝癌患者，對于臨床資料的完善與否不作特殊性要求。另收取60 例取自遠離癌組織中心5cm 以上的癌旁正常組織作為對照，所有患者術(shù)前均均未行放、化療。選取2019 收集的肝癌組織中的15 例，經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，4μm 厚切片保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA 提取和qRT-PCR

根據(jù)Biotech RNA 提取試劑盒說明書提取60 對癌與癌旁組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成互補的脫氧核糖核酸（cDNA）。試用Nanodrop 2000 分光光度計（Thermo Scientific，美國）測量RNA 的濃度及純度。使用SYBER Green I Master Mix 方案行qRT-PCR，反應(yīng)體系為10μ L,反應(yīng)條件為：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 20s，40 個循環(huán)；95℃，5s，65℃，1min。CCT4 正向引物：5′-ATGCCCGAGAATGTGGCAC-3′；反向引物：5′-GCTTGTCGCGGTCCTGATAG-3′。使用β-actin 為內(nèi)參，β-actin 正向引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′；β-反向引物：5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。

1.4 免疫組化

將組織切片脫蠟，水合，通過檸檬酸鹽抗原修復(fù)溶液（用PBS 稀釋）在微波條件下修復(fù)，CCT4 單克隆抗體（中國 Proteintech 公司，貨號：21524-1-AP）以1 ∶100 稀釋，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的二抗(購買自美國Jakson 公司)以1 ∶200 的比例稀釋。顯微鏡下拍照，觀察肝臟組織中的CCT4 蛋白表達強度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

用Wilcox 秩和檢驗分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中CCT4 在不配對肝癌和正常組織中的差異表達。使用t檢驗分析qRT-PCR 檢測的CCT4在配對癌和癌旁組織中表達。使用χ2檢驗分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中CCT4 表達水平與肝癌患者的臨床病理特征關(guān)系；Log-Rank 法檢驗行單因素和多因素Cox分析。以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 CCT4 在肝癌中的表達水平

我們首先比較了CCT4 mRNA 在TCGA 數(shù)據(jù)庫里374 個肝癌和50 個正常組織中的表達(圖1A)，同時使用qRT-PCR 檢測CCT4 mRNA 在60 例配對癌和癌旁組織中表達以驗證TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)果(圖1B)。結(jié)果表明,CCT4mRNA 在肝癌組織中的表達顯著高于其在癌旁的表達(圖1A/B)(P=1.085e-23,P＜0.001)。進一步，我們使用免疫組化檢測CCT4 蛋白在15 例配對癌和癌旁組織中表達(圖1C)。結(jié)果提示在癌組織中CCT4 蛋白表達較高?？傊珻CT4 mRNA 和蛋白在癌組織中高表達。

圖1 注：A.在TCGA 公共數(shù)據(jù)庫中CCT4 在癌旁與肝癌組織中的表達差異；B.在60 對標(biāo)本中CCT4 在癌旁和肝癌組織的表達差異；C.CCT4 在肝組織的免疫組織化學(xué)染色（左邊配對癌旁組織，右邊配對肝癌組織）

2.2 CCT4 在肝癌中的預(yù)后價值

為了探討CCT4 在肝癌中的預(yù)后價值，我們使用Kaplan-Meier 法繪制了生存曲線，同時使用log-Rank 法行單因素和多因素cox 回歸分析。如圖2 所示，CCT4 高表達組患者的1 年-，3 年-和5 年總生存率分別約為75.1%，52.5%和41.7%；CCT4 低表達組患者的1 年-，3 年-和5 年總生存率分別約為89.7%，70.2%和53.6%。CCT4 高表達組患者的總生存率更低 (P=0.005)。見表1 所示，單因素Cox 分析結(jié)果提示TNM 分期 (HR[95%CI]=1.86[1.46 ～2.39]) (P＜0.01)、T 分 期 (HR[95%CI]=1.8[1.43 ～2.27]P＜0.01)、M 分 期(HR[95%CI]=3.85[1.21 ～12.28]P＜0.01) 及CCT4 表 達(HR[95%CI]=1.02[1.01 ～1.03]P＜0.01)與患者預(yù)后相關(guān)。多因素Cox 分析結(jié)果提示，CCT4 mRNA 表達（HR[95%CI]=1.02[1.01～1.03]P＜0.01）是肝癌患者的獨立危險因素。總之，CCT4是肝癌獨立不良預(yù)后因子。

圖2 在TCGA 數(shù)據(jù)中CCT4 的表達與肝癌患者的生存分析

表1 TCGA 中CCT4 的單因素和多因素Cox 回歸分析

2.3 CCT4 表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

如圖3 所示，CCT4 表達與患者的性別無關(guān)。但是與患者的年齡(P＜0.022)、病理分級(P＜0.001)及TNM 分期呈正相關(guān) (P＜0.001)。

圖3 A.以中位值為界限將肝癌患者中不同的年齡分為高低兩組，CCT4 的表達與年齡的相關(guān)性；B.根據(jù)肝癌患者的性別進行分組，CCT4 的表達與性別的相關(guān)性；C.CCT4 的表達與肝癌患者中不同病理分級的關(guān)系；D.CCT4 的表達與肝癌患者中不同的病理分期的關(guān)系

2.4 GSEA 富集分析結(jié)果

我們使用GSEA 軟件對HCC 中CCT4 進行GSEA 富集分析,以探索CCT4 調(diào)控的基因集。我們分析了CCT4 對178 個富集通路的影響。如圖4 所示分析結(jié)果提示與細胞周期及WNT 信號通路,MAPK信號通路和VEGF通路途徑有關(guān)的基因組在CCT4的高表型中上調(diào)。

圖4 示：使用GSEA 軟件對CCT4 在肝癌中進行GSEA 富集分析,所得到的4個與癌癥關(guān)系密切相關(guān)由CCT4 高表型所富集到的通路.

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

我們檢索了String 和Genemania 兩個數(shù)據(jù)庫以分析CCT4 在人體的互作蛋白。結(jié)果如圖5 所示這些蛋白主要包括PFDN 復(fù)合物中多個亞基（PFDN1,PFDN2,PFDN4,PFDN5,PFDN6）及CDC20 蛋白,SPHK1 蛋白等。

圖5 示：通過使用String,Genemania 兩個數(shù)據(jù)庫預(yù)測CCT4 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

3.討論

CCT 復(fù)合物屬于分子伴侶蛋白，其可通過折疊肌動蛋白及微管蛋白而參與細胞的分裂和遷移[12]。此外，在腫瘤中，CCT4 還可通過折疊癌基因或抑癌基因而調(diào)控腫瘤進展。這些基因包括VHL、P53、STAT3、cyclin E和CDC20等[6-10]。作為CCT家族的一員，CCT4 的丟失可抑制食道鱗狀細胞癌的增殖、侵襲和遷移[11]。但是目前CCT4 在HCC 的作用仍不清楚。

本研究比較TCGA 數(shù)據(jù)庫中CCT4 mRNA 在肝癌中的表達并通過qRT-PCR和免疫組化在肝癌患者標(biāo)本中驗證TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)CCT4 在肝癌組織中高表達。進一步通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫中肝癌患者行生存分析、單因素和多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)高表達的CCT4 的患者預(yù)后較差，且CCT4 是肝癌的獨立預(yù)后因子。這提示CCT4 在肝癌中表達上調(diào)，且充當(dāng)預(yù)后標(biāo)志物。

此外我們通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及GSEA 富集分析初步討論了CCT4 在肝癌中的潛在機制。GSEA 的結(jié)果表明細胞周期、VEGF 信號通路、MAPK 信號通路和Wnt 信號通路的相關(guān)基因在CCT4 高表型中表達上調(diào)。MAPK 信號通路通過多種級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮作用，MAPK/ERK 信號通路的異常激活在肝癌中發(fā)揮重要作用[12]。Wnt信號通路參與細胞增殖、存活、自我更新和分化等[13-14]。在肝癌中Wnt/β-catenin 信號通路的活化與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[15]。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，CCT4 與PFDN 蛋白中的數(shù)個亞基互作。PFDN 亞基可以在HepG2 肝癌細胞中以高親和力與癌基因HDAC1互作而促進肝癌細胞的增殖[16]。CDC20 是細胞周期調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵分子[17]。chu 等研究表明CDC20 可能通過Wnt /β-catenin 信號傳導(dǎo)通路促進皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)展[18]。綜上CCT4 可通過與PFND 的亞基及CDC20 互作而參與調(diào)控肝癌進展。

但是，我們的研究仍然存在一些局限性。（1）組化樣本不足。（2）沒做細胞功能學(xué)和裸鼠體內(nèi)實驗。（3）未驗證GSEA 富集和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)所得出的結(jié)果。這些不足正是我們下一步的研究重點。盡管存在局限性，我們的研究表明CCT4 是肝癌預(yù)后有價值的標(biāo)志物.