髓源性抑制細(xì)胞在靶向肝再生磷酸酶-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫中的表達(dá)

呂娟 黃昊 趙燕田

[摘要] 目的 觀察髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）在靶向肝再生磷酸酶-3（PRL-3）小鼠乳腺腫瘤基因免疫中的表達(dá)，探討MDSC的數(shù)量與腫瘤生長的關(guān)系。 方法 將40只雌性BALB/c小鼠分為5大組（8小組），空載對(duì)照組[pVAX1（-）組]、無佐劑組PRL-3組（K-PRL3組）、佐劑-PRL-3融合蛋白組（K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組）及MDSC對(duì)照抗體刪除組（K-T-PRL3+Ab control組和K-PRL3-MT+Ab control組），MDSC特異性抗體刪除組（K-T-PRL3+Gr-1Ab組和K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組），通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫表型CD45、Gr-1及CD11b，分析MDSC在各免疫組外周血、腫瘤、脾臟中的表達(dá)水平，觀察MDSC與腫瘤生長的相關(guān)性。 結(jié)果 荷瘤后第28天K-PRL3組、K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組腫瘤體積均小于pVAX1（-）組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;K-PRL3-MT組和K-T-PRL3組與K-PRL3組腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。佐劑-PRL-3融合蛋白組小鼠外周血或腫瘤組織中MDSC表達(dá)均高于K-PRL3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。MDSC特異性抗體刪除組（K-T-PRL3+Gr-1 Ab組和K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組）與MDSC對(duì)照抗體刪除組（K-T-PRL3 + Ab control組和K-PRL3-MT+Ab control組）腫瘤體積大小比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;MDSC特異性抗體刪除組、MDSC對(duì)照抗體刪除組腫瘤體積均大于無佐劑組PRL-3組和佐劑-PRL-3融合蛋白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;MDSC特異性抗體刪除組脾臟、外周血MDSC表達(dá)均低于對(duì)照抗體刪除組，而腫瘤組織中MDSC表達(dá)與MDSC對(duì)照抗體刪除組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），且均大于佐劑-PRL-3融合蛋白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 在靶向PRL-3的小鼠乳腺腫瘤基因免疫中佐劑-PRL-3融合蛋白組腫瘤組織中MDSC與腫瘤生長相關(guān)，為進(jìn)一步優(yōu)化靶向PRL-3的抗腫瘤免疫治療方案及MDSC相關(guān)作用研究提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 髓源性抑制細(xì)胞;肝再生磷酸酶-3;腫瘤免疫抑制微環(huán)境;流式細(xì)胞術(shù)

[中圖分類號(hào)] R735.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）09（b）-0079-08

[Abstract] Objective To observe the expression of myeloid suppressor cells （MDSC） in targeted phosphatase of regeneratiing liver-3 （PRL-3） mouse breast tumor gene immunity， and to explore the relationship between the number of MDSC and tumor growth. Methods Forty female BALB/c mice were divided into five groups （eight groups）： no-load control group （pVAX1 [-] group）， adjuvanted PRL-3 group （K-PRL3 group）， adjuvanted PRL-3 fusion protein group （K-T-PRL3 group and K-PRL3-MT group）， and MDSC control antibody deletion group （K-T-PRL3+Ab control group and K-PRL3-MT+Ab control group）. In the MDSC specific antibody deletion group （K-T-PRL3+ GR-1AB group and K-PRL3-MT+ GR-1 Ab group）， immunophenotypes CD45， GR-1 and CD11b were detected by flow cytometry to analyze the expression levels of MDSC in peripheral blood， tumor and spleen of each immune group， and the correlation between MDSC and tumor growth was observed. Results On the 28th day after tumor-bearing， the tumor volume of K-PRL3 group， K-T-PRL3 group and K-PRL3-MT group was all smaller than pVAX1 （-） group， with statistically significant differences （all P < 0.05）.There was no significant difference in tumor volume between the K-PRL3-mt group and K-T-PRL3 group and K-PRL3 group （P > 0.05）. The expression of MDSC in peripheral blood or tumor tissues of the adjuvant -PRL-3 fusion protein group was higher than that of the K-PRL3 group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in tumor volume between MDSC specific antibody deletion group （K-T-PRL3 + GR-1 Ab group and K-PRL3-mL + GR-1 Ab group） and MDSC Control group （K-T-PRL3 +Ab control group and K-PRL3-MT +Ab control group） （P > 0.05）. The tumor volume of the MDSC specific antibody deletion group and the MDSC control antibody deletion group were all larger than those of the adjuvant-free PRL-3 group and the adjuvant-PRL-3 fusion protein group， with statistically significant differences （P < 0.01）. The expression of MDSC in spleen and peripheral blood of the MDSC specific antibody deletion group was lower than that of the control antibody deletion group， while the difference between the expression of MDSC in tumor tissues and that of the MDSC control antibody deletion group was not statistically significant （P > 0.05）， and was greater than that of the adyuvanted-PRL-3 fusion protein group， with statistically significant difference （P < 0.01）. Conclusion MDSC in tumor tissues in the adjuvant-PRL-3 fusion protein group is correlated with tumor growth in breast tumor by DNA vaccination against PRL-3， providing a theoretical basis for further optimization of anti-tumor immunotherapy against PRL-3 and research on the related effects of MDSC.

[Key words] Myeloid-derived suppressor cells; Phosphatase of regenerating liver-3; Tumor immunosuppressive microenvironment; Flow cytometry

髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）是一群具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的異質(zhì)性細(xì)胞群，與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）等細(xì)胞群體一起構(gòu)成腫瘤細(xì)胞對(duì)抗免疫系統(tǒng)的屏障，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤免疫逃逸，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，在癌癥、慢性炎癥、感染、自身免疫病、哮喘等發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵性作用[1-5]。研究顯示[6-8]腫瘤患者及荷瘤鼠中MDSC的表達(dá)與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，MDSC不僅能夠抑制免疫反應(yīng)，也能促進(jìn)腫瘤生長，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。

肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3）是非跨膜型酪氨酸磷酸酶成員之一，在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、白血病等多種癌癥中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，且與預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)[9-14]，已成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[15-18]。本研究前期工作首次從DNA免疫的角度闡述了以PRL-3為靶點(diǎn)的抑瘤效果，通過基因槍免疫方法介導(dǎo)PRL-3相關(guān)的DNA來發(fā)揮針對(duì)高表達(dá)PRL-3的小鼠D2F2/PRL-3乳腺腫瘤生長的預(yù)防或治療作用[19]。但是，其中佐劑-PRL-3融合基因DNA免疫（該處佐劑分子為“結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白TBhsp、結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞刺激表位MT”等）與無佐劑PRL-3DNA免疫組相比并未表現(xiàn)出明顯的抑瘤作用。這一結(jié)果提出機(jī)體是否在以PRL-3為靶點(diǎn)的不同配伍的DNA免疫反應(yīng)中建立了腫瘤免疫抑制微環(huán)境促進(jìn)腫瘤生長。

因此，本研究以腫瘤免疫抑制微環(huán)境中細(xì)胞群之一MDSC為著眼點(diǎn)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其免疫表型Gr-1及CD11b[8]，分析MDSC在各組小鼠外周血、腫瘤、脾臟中的表達(dá)水平，并進(jìn)一步采用注射Gr-1單克隆抗體特異性刪除小鼠MDSC細(xì)胞，觀察聯(lián)合免疫對(duì)腫瘤生長的影響，為MDSC作為腫瘤潛在的診斷、療效監(jiān)測(cè)指標(biāo)等提供一定的理論依據(jù)，為MDSC進(jìn)一步的抑制功能試驗(yàn)探索奠定基礎(chǔ)，從腫瘤免疫抑制微環(huán)境的角度闡述靶向PRL-3的抑瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

過表達(dá)PRL-3的小鼠乳腺癌細(xì)胞系D2F2/PRL3及相關(guān)基因免疫所用質(zhì)粒為北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡（合格證號(hào)1100112011003039）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，由北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院動(dòng)物室飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)科研課題倫理審批（編號(hào)13-科-50）。

1.2 動(dòng)物分組

靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫分為5大組（8小組，5只/組），共40只小鼠：空載對(duì)照組[pVAX1（-）組]，無佐劑PRL-3組（K-PRL3組），佐劑-PRL-3融合蛋白組（K-PRL3-MT組和K-T-PRL3組），MDSC對(duì)照抗體刪除組（K-T-PRL3+Ab Control組、K-PRL3-MT+Ab Control組），MDSC特異性抗體刪除組（K-T-PRL3+Gr-1 Ab組、K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組）。

1.3 靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫造模

基因槍免疫方法參照前期工作進(jìn)行[19]。上述基因免疫各組別基因槍子彈制備包被質(zhì)粒分別為：pVAX1（-）組包被質(zhì)粒pVAX1，K-PRL3組包被質(zhì)粒pVAX1-Igκ-PRL3，K-PRL3-MT組包被質(zhì)粒pVAX1-Igκ-PRL3-MT，K-T-PRL3組包被質(zhì)粒pVAX1-Igκ-TBhsp-PRL3。MDSC對(duì)照抗體刪除組及MDSC特異性抗體刪除組根據(jù)佐劑類型包被上述相對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒。

BALB/c小鼠腹部備皮，基因槍免疫2次，間隔2周，各組別每只小鼠每次免疫2發(fā)包裹有相應(yīng)分組質(zhì)粒的子彈，每只小鼠每次免疫量為2.4 μg DNA，第2次免疫后2周，行D2F2/PRL3左側(cè)脂肪墊注射，每只小鼠細(xì)胞注射量2×105個(gè)細(xì)胞（100 μL PBS介質(zhì)）。D2F2/PRL3細(xì)胞脂肪墊注射后14 d每隔3～6 d觀察瘤體生長狀況，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長短徑，按公式V=XY2/2計(jì)算腫瘤體積（mm3，X長徑，Y短徑），繪制腫瘤生長曲線;在荷瘤后第26～28天取外周血、脾細(xì)胞及腫瘤組織進(jìn)行MDSC流式檢測(cè)。

1.4 免疫小鼠脾臟及腫瘤組織分離

參照小鼠脾消化試劑盒（德國美天旎，Lot：130-095-926）說明書提取脾細(xì)胞，參照小鼠腫瘤消化試劑盒（德國美天旎，Lot：130-096-730）說明書提取腫瘤細(xì)胞。按照說明書配置裂解酶混合液，脾臟或腫瘤組織剝離后剪碎放置混合液中碾磨，37℃溫浴 15 min或2～3 h，過濾30 μm或70 μm濾膜后收集至15 mL管中，300 g（半徑r = 18 cm），離心7～10 min，棄上清，流式緩沖液重懸細(xì)胞至適當(dāng)體積待測(cè)

1.5 外周血、脾臟、腫瘤組織內(nèi)MDSC流式檢測(cè)

熒光標(biāo)記流式抗體：CD45-FITC（mouse，clone：30-F11，BD，Lot：553079），CD11b-PE（human and mouse，clone：M1/70.15.11.5，德國美天旎，Lot：130-091-240），Gr-1-APC（mouse，clone：RB6-8C5，德國美天旎，Lot：130-102-385），Rat IgG2b-FITC（BD，Lot：553988），Rat IgG2b-PE（clone：ES26-5E12.4，德國美天旎，Lot：130-102-663），Rat IgG2b-APC（clone：ES26-5E12.4，德國美天旎，Lot：130-102-664）。流式染色緩沖液（Ebioscience，00-4222-26），10×紅細(xì)胞裂解液（BD 555899）。BD Accuri C6分析型流式細(xì)胞儀。

脾臟與腫瘤細(xì)胞調(diào)整濃度至1×107個(gè)/mL，流式管底加入5～10 μL MDSC相應(yīng)抗體，與100 μL上述細(xì)胞懸液或100 μL EDTA-K2抗凝外周血混勻，室溫避光孵育20 min;每管中加入1×紅細(xì)胞裂解工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）2 mL，混勻后避光孵育10 min;1500 r/min離心5 min后棄上清;加入2 mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，1500 r/min離心5 min后棄上清;加500 μL PBS重懸，待流式分析。收集105個(gè)細(xì)胞，以CD45+設(shè)門，檢測(cè)CD11b+Gr-1+所占比例，進(jìn)而得出MDSC表達(dá)量。

1.6 MDSC刪除實(shí)驗(yàn)

MDSC刪除用抗體：Purified NA/LE Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C（Anti Gr-1）（BD PMG 553122）;對(duì)照抗體：Purified NA/LE Rat IgG2b，κ isotype Control（BD PMG 553985）。按“1.3”項(xiàng)下靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫流程及DNA用量，選取佐劑-PRL-3融合蛋白組K-PRL3-MT和K-T-PRL3（10只小鼠/組）進(jìn)行MDSC刪除實(shí)驗(yàn)，先分別行相應(yīng)質(zhì)粒包被的基因槍免疫2次，間隔2周，第2次免疫后2周，行D2F2/PRL3左側(cè)脂肪墊注射，從接種腫瘤細(xì)胞當(dāng)天起，將每組10只小鼠進(jìn)一步分成兩組（5只小鼠/組），腹腔注射特異性刪除抗體（Gr-1 Ab）或?qū)φ湛贵w（Ab Control），100 μg/只，后續(xù)間隔1～2 d，一共7次抗體注射。每隔3～6 d觀察瘤體生長狀況，繪制腫瘤生長曲線;在荷瘤后第26～28天取外周血、脾細(xì)胞及腫瘤組織進(jìn)行MDSC流式分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用軟件Graphpad Prism 5（Graphpad software Inc.，San Diego，CA，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間腫瘤體積比較及MDSC細(xì)胞數(shù)用多因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計(jì)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫腫瘤生長及MDSC表達(dá)

2.1.1 靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫腫瘤生長情況 ?pVAX1（-）組腫瘤生長最快，荷瘤后第28天 K-PRL3組、K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組腫瘤體積均小于pVAX1（-）組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;K-PRL3-MT組和K-T-PRL3組與K-PRL3組腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.1.2 靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫各組織中MDSC表達(dá)變化 ?各組脾臟組織中MDSC表達(dá)，pVAX1（-）組、K-PRL3組、K-T-PRL3和K-PRL3-MT組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）（圖2A、D）。

各組外周血中MDSC表達(dá)，K-T-PRL3組及K-PRL3-MT組均大于pVAX1（-）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。K-T-PRL3組大于K-PRL3組和K-PRL3-MT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。其他組別之間外周血中MDSC表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（圖2B、D）。

各組腫瘤組織中MDSC表達(dá)，K-T-PRL3組大于K-PRL3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。其他組別之間腫瘤中MDSC表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（圖2C、D）。

2.2 K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組MDSC刪除實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤生長及MDSC表達(dá)變化

2.2.1 K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組MDSC刪除實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤生長 ?荷瘤后21 d及23 d，K-T-PRL3+Ab control組及K-T-PRL3+Gr-1 Ab組腫瘤體積均大于K-PRL3組和K-T-PRL3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;荷瘤后23～28 d，K-T-PRL3+Gr-1 Ab組小鼠由于體外實(shí)驗(yàn)及自然死亡缺失統(tǒng)計(jì)，K-T-PRL3+Ab control組腫瘤體積大于K-PRL3組和K-T-PRL3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。K-T-PRL3+Ab control組和K-T-PRL3+Gr-1 Ab組間，K-PRL3和K-T-PRL3組間比較，荷瘤后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤大小差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。（圖3A）。

荷瘤后23 d，K-PRL3-MT+Ab control組和K-PRL3-MT+Gr-1Ab組腫瘤體積均大于K-PRL3-MT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;荷瘤后28 d，K-PRL3-MT+Ab control組腫瘤體積大于K-PRL3組和K- PRL3-MT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。K-PRL3-MT+Ab control組和K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組間、K-PRL3和K- PRL3-MT組間比較，荷瘤后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤大小差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）（圖3B）。

2.2.2 K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組MDSC刪除實(shí)驗(yàn)中MDSC表達(dá)變化 ?各組脾臟組織中MDSC表達(dá)，K-PRL3-MT+Ab control組大于K-PRL3組、K-PRL3-MT組、K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。其余不同組別間MDSC表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（圖4）。

各組外周血中MDSC表達(dá)，K-T-PRL3組大于K-T-PRL3+Ab control組、K-T-PRL3+Gr-1 Ab組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。K-PRL3-MT大于K-PRL3-MT+Gr-1 Ab，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。其余不同組別間MDSC表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（圖4）。

各組腫瘤組織中MDSC表達(dá)，K-T-PRL3+Gr-1 Ab組大于K-PRL3組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。K-PRL3-MT+Gr-1 Ab大于K-PRL3組及K-PRL3-MT組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。其余不同組別間MDSC表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（圖4）。

組間兩兩比較，K-T-PRL3組與K-PRL3-MT組經(jīng)Gr-1特異性抗體刪除后（K-T-PRL3+Gr-1Ab與K-PRL3-MT+Gr-1Ab），脾臟、外周血MDSC表達(dá)均低于刪除抗體對(duì)照組（K-T-PRL3+Ab Control、K-PRL3-MT+Ab control），而腫瘤組織中MDSC與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），且均大于K-PRL3組（P < 0.01）（圖4B）。

3 討論

腫瘤免疫抑制微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞利用機(jī)體免疫系統(tǒng)自身的負(fù)調(diào)控機(jī)制，在腫瘤微環(huán)境中建立的全方位免疫抑制網(wǎng)絡(luò)，對(duì)促進(jìn)腫瘤發(fā)展和抵抗腫瘤治療效應(yīng)起到關(guān)鍵作用[20-22]。該微環(huán)境誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞分化、增殖并向腫瘤部位聚集，包括CD4+CD25+ Treg、Gr-1+CD11b+ MDSC、M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）等[8，23-24]。MDSC是近二十年來的腫瘤免疫研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。MDSC是一群異質(zhì)性細(xì)胞，來源于骨髓祖細(xì)胞。在正常個(gè)體，骨髓祖細(xì)胞迅速分化為成熟的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。相反在病理?xiàng)l件下，如癌癥、敗血癥、創(chuàng)傷、移植等，分化為成熟髓樣細(xì)胞受阻，導(dǎo)致MDSC大量產(chǎn)生[4]。

本研究在前期工作中將相關(guān)病原體源性小肽——TBhsp和MT分別與PRL-3結(jié)合構(gòu)建融合表達(dá)基因，以期機(jī)體的免疫系統(tǒng)假借識(shí)別病原體來對(duì)目的蛋白產(chǎn)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生“1+1≥2”的抑瘤增強(qiáng)效應(yīng)。但是，機(jī)體免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性使得對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫力的同時(shí)也伴隨著對(duì)自身免疫的調(diào)節(jié)作用，佐劑增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自身抗原免疫反應(yīng)能力越強(qiáng)，限制Ⅰ型免疫反應(yīng)的自身免疫耐受發(fā)生的可能性就越大，佐劑產(chǎn)生的這種免疫抑制效應(yīng)可限制疫苗的效力[25]。已有研究顯示[26]，腫瘤自身產(chǎn)生的免疫抑制微環(huán)境及免疫抑制分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的激活成為腫瘤免疫治療潛藏的最大障礙。如手術(shù)后的復(fù)發(fā)腫瘤和引流淋巴結(jié)中有大量M2型巨噬細(xì)胞TAM（CD11b+F4/80hiCD206hi和CD11b+F4/80hiCD124hi）和 CD4+Foxp3+Treg 浸潤，導(dǎo)致腫瘤免疫抑制微環(huán)境的改變解釋了術(shù)后常規(guī)免疫治療與術(shù)前相比失敗的原因[24]。又如由于腫瘤組織內(nèi)浸潤有大量免疫抑制類細(xì)胞，這一腫瘤免疫抑制微環(huán)境的存在抑制了CD8+T細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)劑IL-15R/IL-15融合蛋白與 HER2/neu單抗的聯(lián)合治療的抑瘤免疫效應(yīng)[27]。

本研究中TBhsp和MT佐劑分子的加入，與單純PRL-3免疫組相比并未表現(xiàn)出明顯的抑瘤優(yōu)勢(shì)，其中MDSC在K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組小鼠外周血或腫瘤組織中的表達(dá)均高于無佐劑的K-PRL3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而脾臟中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果初步提示MDSC在靶向PRL-3的抗腫瘤免疫中發(fā)揮抑制作用。腫瘤免疫抑制微環(huán)境具有顯著的異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)變化的特征，對(duì)同一腫瘤的不同干預(yù)，腫瘤免疫抑制微環(huán)境也會(huì)隨之發(fā)生變化。

腫瘤免疫治療的主要目標(biāo)是誘發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，包括促進(jìn)腫瘤抗原特異的CTL反應(yīng)、產(chǎn)生腫瘤特異的抗體、促進(jìn)CD4+ Th細(xì)胞反應(yīng)、自然殺傷細(xì)胞的非抗原特異性反應(yīng)，引起Treg或MDSC等抑制性細(xì)胞的減少，或者產(chǎn)生一些促免疫反應(yīng)細(xì)胞因子等[28]。增強(qiáng)抗腫瘤免疫的同時(shí)，需要改善或解除腫瘤免疫抑制反應(yīng)方有望取得良好的治療效果[20]。因此，基于上述結(jié)果，本研究用Gr-1單抗以期將K-T-PRL3和K-PRL3-MT組中MDSC特異性刪除，脾臟、外周血MDSC表達(dá)均低于刪除抗體對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而腫瘤組織中MDSC與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示腹腔注射抗體的方式對(duì)刪除腫瘤內(nèi)的MDSC作用不明顯。特異性抗體刪除組與對(duì)照抗體刪除組、未刪除組相比均無明顯抑瘤優(yōu)勢(shì)，反而有加速腫瘤生長趨勢(shì)。進(jìn)一步提示腫瘤組織中的MDSC在靶向PRL-3的抗腫瘤基因免疫中對(duì)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成有一定作用，也提示我們下一步在腫瘤局部抑制MDSC的生成來優(yōu)化靶向PRL-3的抗腫瘤免疫治療方案。

本研究結(jié)果尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證，需要值得注意的是具有和MDSC相同表型卻沒有免疫抑制活性的細(xì)胞群命名為未成熟髓樣細(xì)胞（immature myeloid cells，IMC），這就需要做體外抑制試驗(yàn)和真正具有免疫抑制功能的MDSC相鑒別[8]，也提示我們?cè)诎邢騊RL-3的抗腫瘤研究需進(jìn)一步提取脾臟、外周血及腫瘤組織中MDSC進(jìn)行更多免疫標(biāo)志物的篩選和功能驗(yàn)證，以期更全面地揭示MDSC在機(jī)體不同部位組織中的功能。

綜上所述，本研究前期工作的基礎(chǔ)上，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和一系列體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，明確以PRL-3為靶點(diǎn)的腫瘤模型基因免疫中外周血及腫瘤免疫微環(huán)境內(nèi)MDSC的表達(dá)變化，在此基礎(chǔ)上，實(shí)施特異性細(xì)胞刪除以期達(dá)到免疫預(yù)防優(yōu)化目的，從而為全面認(rèn)識(shí)PRL-3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用、提高和發(fā)展新的腫瘤治療方案奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也有可能為研發(fā)針對(duì)PRL-3的靶向藥物提供一定的理論依據(jù)，擴(kuò)展了PRL-3的研究領(lǐng)域，對(duì)于MDSC細(xì)胞的相關(guān)研究也具有理論參考價(jià)值。此次初步探索有助于進(jìn)一步闡述MDSC與惡性克隆、抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞間的相互關(guān)系，為免疫治療提供新靶點(diǎn)，開拓新思路。

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（收稿日期：2020-06-07）