致病性海洋弧菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥傳遞機(jī)制初步研究

王瑞旋, 王江勇, 李韻萍, 郭子晗, 李 炳, 李 云, 朱 慧

致病性海洋弧菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥傳遞機(jī)制初步研究

王瑞旋1, 王江勇2, 李韻萍3, 郭子晗4, 李 炳2, 李 云1, 朱 慧1

(1. 韓山師范學(xué)院, 廣東 潮州 521041; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣東 廣州 510300; 3. 華南師范大學(xué), 廣東 廣州 510631; 4. 加尼福利亞浸會(huì)大學(xué), 美國(guó) 加利福尼亞 92504)

隨著抗菌藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用量的增加及混合使用現(xiàn)象的出現(xiàn), 水產(chǎn)病原菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性甚至是多重耐藥性, 大大增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性病害防治的難度。細(xì)菌耐藥性最常見(jiàn)的傳遞方式是耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)對(duì)多個(gè)水產(chǎn)致病弧菌質(zhì)粒上新霉素及卡那霉素的耐藥基因(′)進(jìn)行檢測(cè)分析, 并利用電穿孔法將篩選得到的3個(gè)受試菌株上的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌中, 結(jié)果從3個(gè)轉(zhuǎn)化子中檢測(cè)到目的基因。進(jìn)一步的藥敏測(cè)試結(jié)果顯示, 3個(gè)轉(zhuǎn)化子的最小抑菌濃度(MIC值)以及最小殺菌濃度(MBC值)均明顯上升?？梢?jiàn), 在特定條件下, 水生致病性弧菌對(duì)氨基糖苷類(新霉素和卡那霉素)的耐藥質(zhì)?？赊D(zhuǎn)移至大腸桿菌并參與介導(dǎo)其耐藥性, 大大降低了受體菌對(duì)新霉素和卡那霉素的敏感性。本研究將為環(huán)境弧菌與臨床細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物的抗性傳遞研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

致病弧菌; 耐藥質(zhì)粒; 新霉素; 卡那霉素; 耐藥機(jī)制

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展, 病害問(wèn)題愈演愈烈。其中, 弧菌病作為最早被發(fā)現(xiàn)且危害最嚴(yán)重的水生傳染性疾病之一, 已日漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。迄今為止, 已發(fā)現(xiàn)的病原弧菌有哈維弧菌、溶珊瑚弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、燦爛弧菌、殺鮭弧菌、創(chuàng)傷弧菌等。其中, 在海水養(yǎng)殖病害事件中, 哈維弧菌已成為出現(xiàn)頻率最高的致病菌之一[1-2], 或以病原的身份存在, 或扮演“幫兇”角色引起海水動(dòng)物包括魚(yú)、蝦、貝類的感染[3-9], 給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失, 同時(shí)也是人類的條件致病菌[10], 其中有大約5%的哈維弧菌可同時(shí)引起人類感染發(fā)病[11]。溶珊瑚弧菌是海水中的正常菌群之一, 其數(shù)量居于海洋弧菌之首, 它廣泛分布于世界各地海水及河口處, 同時(shí)還大量分布于多種海洋動(dòng)物中, 是多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物的條件致病菌。塔氏弧菌也是典型的條件致病菌, 廣泛分布于養(yǎng)殖環(huán)境中, 可引起牡蠣、象拔蚌、蛤蜊等軟體動(dòng)物甚至珊瑚等暴發(fā)疾病[12-14], 如Hasegawa等發(fā)現(xiàn)塔氏弧菌可使太平洋牡蠣幼蟲(chóng)致死[15], 而Séré等則發(fā)現(xiàn)西印度洋中珊瑚所患的白斑綜合征由塔氏弧菌所導(dǎo)致[16]。目前抗菌藥物治療仍是防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性病害的主要措施。而養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中, 漁藥的使用存在亂用、濫用等現(xiàn)象[17], 藥物殘留及藥物的選擇壓力致使細(xì)菌基因突變或耐藥基因轉(zhuǎn)移從而產(chǎn)生耐藥性, 最終導(dǎo)致抗菌藥物的治療效果減弱甚至無(wú)效[18], 抗生素的不科學(xué)使用正是導(dǎo)致耐藥性的主要原因[19]。菌株的耐藥性不僅能通過(guò)基因水平傳播, 還能在相同或不同種屬的細(xì)菌之間傳播, 從而增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類細(xì)菌性病害的防治難度, 并可能使得水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類細(xì)菌性病害面臨藥物治療無(wú)效的結(jié)果。細(xì)菌的耐藥性不僅對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖戶造成經(jīng)濟(jì)損失, 而且對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的威脅。研究表明, 水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌有將耐藥性傳遞給人類細(xì)菌的可能性, 耐藥質(zhì)粒的傳遞作用使得水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類病原菌與大腸桿菌可相互傳遞耐藥質(zhì)粒, 威脅著人類健康[20]。此外, 食源性病原菌耐藥同樣威脅著人類健康, 且已有研究表明水產(chǎn)品中食源性致病菌廣泛存在耐藥現(xiàn)象[21]。

目前有28種以上抗菌藥物被允許使用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 幾乎囊括了所有抗菌素類藥物。作為廣譜抗生素, 氨基糖苷類抗菌藥物除了應(yīng)用于人類疾病的治療, 還常被應(yīng)用于家畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。隨著應(yīng)用的增多, 水生細(xì)菌對(duì)這類藥物也產(chǎn)生了廣泛的耐藥性。有研究表明, 來(lái)源于河口水體、沉積物或養(yǎng)殖魚(yú)類的水生弧菌對(duì)慶大霉素和鏈霉素等氨基糖苷類藥物表現(xiàn)耐藥性[22]。水生細(xì)菌耐藥現(xiàn)象已不容忽視, 由于水環(huán)境中微生物的復(fù)雜性及水流的動(dòng)力, 更利于細(xì)菌之間的接觸從而使其更易于互相傳遞耐藥性。耐藥質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移是自然界中細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性最主要、最常見(jiàn)的方式, 由耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性正朝著多重耐藥方向發(fā)展。本文通過(guò)對(duì)致病弧菌的氨基糖苷類耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)和分析, 并將相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中使其對(duì)氨基糖苷類藥物的敏感性大大降低, 本研究將為環(huán)境弧菌與臨床細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物的抗性傳遞研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

菌株來(lái)源: 7株受試菌由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所漁病室分離保存, 均為革蘭氏陰性菌, 具體如下: 編號(hào)BBX1: 致使方斑東風(fēng)螺患“腫吻癥”而急性死亡的哈維弧菌[23-24], 編號(hào)BV2和9H7: 均是引起鮑膿皰癥的哈維弧菌[8]; 編號(hào)B2D: 引起鮑肌肉萎縮癥的哈維弧菌[25]; 編號(hào)BBXP1: 使方斑東風(fēng)螺死亡的塔氏弧菌; 編號(hào)NA0301: 使雜色鮑鮑苗大規(guī)模脫落死亡的溶珊瑚弧菌[26]; 編號(hào)TO1: 引起卵形鯧鲹結(jié)節(jié)病的美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種subsp.[27]; 受體菌株: 大腸桿菌ATCC25922。同時(shí)以大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923為質(zhì)控菌株。

培養(yǎng)基: 水解酪蛋白(Mueller-Hinton, 簡(jiǎn)稱MH)瓊脂培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖(Thiosulfate citrate bile salts sucrose, 簡(jiǎn)稱TCBS)瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Luria-Bertani, 簡(jiǎn)稱LB)液體培養(yǎng)基(購(gòu)自環(huán)凱生物科技有限公司)。

抗生素紙片: 青霉素(10 U/片)、呋喃唑酮(300 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)、多西環(huán)素(30 μg/片)、利福平(5 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、恩諾沙星(10 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)、復(fù)方新諾明(10 μg/片)均購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司; 卡那霉素藥粉、新霉素藥粉均購(gòu)自廣州威佳科技有限公司。

試劑盒及PCR試劑及引物: 高純質(zhì)粒 DNA微量提取試劑盒(離心柱法)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱法)和DNA純化試劑盒(離心柱法)(購(gòu)自廣州吉瑞基因科技有限公司), 6×buffer、PCRmix、ddH2O和Marker(購(gòu)自寶生物工程有限公司)。

1.2 藥敏測(cè)試

以實(shí)驗(yàn)室保存的受試菌為研究對(duì)象, 采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer, 簡(jiǎn)稱K-B法), 根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行操作[28-29]。用無(wú)菌生理鹽水洗脫于斜面培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)24 h的菌苔, 稀釋至菌懸液濃度約為1×108CFU/mL, 吸取100 μL菌懸液均勻涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基上(培養(yǎng)皿直徑9 cm, 培養(yǎng)基厚度約4 mm), 涂布后在室溫下放置15~30 min, 待菌液被吸收, 用無(wú)菌鑷子夾取抗生素紙片貼在培養(yǎng)基表面, 每個(gè)平板放置5張藥敏紙片, 紙片與培養(yǎng)皿邊界距離>1.0 cm, 相鄰紙片距離≥2.0 cm, 然后將平板在28℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h, 測(cè)量抑菌圈直徑, 根據(jù)表1和表2判斷不同菌株對(duì)不同抗菌藥物的敏感程度: 敏感(S)、中度耐藥(I)、耐藥(R)。

1.3 耐藥基因的檢測(cè)

挑取活化的受試菌單菌落分別接種于含有2% NaCl的35 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中, 28℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜, 分別按照高純質(zhì)粒DNA微量提取試劑盒和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行操作, 分別獲得質(zhì)粒DNA和基因組DNA, 進(jìn)一步回收DNA后用純化試劑盒進(jìn)行純化。根據(jù)GENBANK中′的堿基序列進(jìn)行耐藥基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì), 并采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法對(duì)耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表3, PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表4。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性2 min, 94℃變性50 s, 60℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán), 72℃保持5 min, 4℃保存。

表1 非苛養(yǎng)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株紙片擴(kuò)散法抗微生物藥物敏感性實(shí)驗(yàn)抑菌環(huán)直徑質(zhì)控允許范圍

表2 藥敏實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

表3 耐藥基因擴(kuò)增引物及相關(guān)信息

表4 PCR反應(yīng)體系

1.4 耐藥質(zhì)粒的電擊轉(zhuǎn)化

將大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的新鮮菌落接種于10 mL的 LB培養(yǎng)基中, 搖床200 r/min、37℃培養(yǎng)過(guò)夜。按照1︰20的比例, 將過(guò)夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接于100 mL的LB液體中, 搖床200 r/min、37℃培養(yǎng)3~5小時(shí), 至OD600吸光值為0.5~0.8, 將菌液放置于冰上冷卻10 min。將冷卻后的菌液于4℃轉(zhuǎn)速5 000×離心10 min, 棄上清, 用35 mL預(yù)冷的ddH2O重懸細(xì)菌沉淀。將細(xì)菌懸液于4℃轉(zhuǎn)速5 000×離心10 min, 棄上清, 用35 mL預(yù)冷的甘油重懸細(xì)菌沉淀。將細(xì)菌懸液于4℃轉(zhuǎn)速5 000×離心10 min, 棄上清, 加入1 mL 10%甘油, 用1.5 mL離心管分裝成100 μL/管, 由此獲得大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞, 置于–80℃保存?zhèn)溆谩?.4 mL電擊杯放于冰上預(yù)冷, 凍存的感受態(tài)細(xì)胞于冰上凍融。在冰上將5 μL質(zhì)粒(4 ng/μL)加入到30 μL感受態(tài)細(xì)胞中, 并在冰上培育5 min。將質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞的混合液加入到預(yù)冷的電擊杯中, 去除電擊杯中的氣泡, 冰浴10 min。擦干電擊杯外壁上的水, 電擊。電擊條件: 2.5 kV, 200Ω, 25 μF。聽(tīng)到蜂鳴聲后迅速將1 mL 37℃保溫的LB培養(yǎng)基加入到電擊杯中(1 min之內(nèi)), 并在無(wú)菌操作臺(tái)中將混合液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中(室溫進(jìn)行)。將混合液于220 r/min搖床37℃培養(yǎng)2 h, 吸取100 μL轉(zhuǎn)化液均勻涂布在加入新霉素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上(新霉素濃度: 10 ng/mL, 室溫放置待液體吸收后, 在37 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

重組質(zhì)粒的鑒定: 挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落接種到35 mL含有新霉素的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中, 37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。取1~7 mL菌懸液于2 mL EP管中, 10 000×離心1 min, 收集菌體沉淀。使用高純質(zhì)粒DNA微量提取試劑盒獲得質(zhì)粒DNA并保存于–20℃?zhèn)溆?。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)重組質(zhì)粒新霉素耐藥基因′進(jìn)行擴(kuò)增以鑒定, 反應(yīng)體系同表5。

表5 特異片段(677 bp)檢出結(jié)果對(duì)比

1.5 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定

以新霉素對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, 簡(jiǎn)稱MIC)和最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration, 簡(jiǎn)稱 MBC)為對(duì)照組, 分別測(cè)定新霉素對(duì)三株受試菌(BBX1、BBXP1、NA0301)的MIC值和MBC值, 設(shè)平行組。方法如下: 取無(wú)菌2 mL EP管13支排成一排, 依次編號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。向每支EP管中加入1 mL MHA液體培養(yǎng)基, 在1號(hào)管中加入濃度為256 μg/mL新霉素1 mL混勻, 然后吸取1 mL勻液至2號(hào)管中, 混勻后再吸取1 mL勻液l至3號(hào)管中, 以此類推, 連續(xù)倍比稀釋至11號(hào)管, 且從11號(hào)管吸取1 mL勻液棄去。12號(hào)管為不含新霉素的生長(zhǎng)對(duì)照管, 13號(hào)管為陰性對(duì)照管。此時(shí), 1—11號(hào)管的藥物濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。然后在1—12號(hào)管加入濃度約為107CFU/mL的菌液10 μL, 使各管最終菌液濃度約 105~106CFU/mL。將各管放置在200 r/min搖床37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。測(cè)定卡那霉素對(duì)受試菌的MIC的方法同上。然后, 取出肉眼觀察到無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)最低3個(gè)濃度(包括MIC)的EP管, 用移液槍吹打EP管中的培養(yǎng)液使其混勻, 并吸取100 μL培養(yǎng)液均勻涂布在MH瓊脂平板上, 在常溫下放置5~10 min待培養(yǎng)液被培養(yǎng)基完全吸收, 將平板在37 ℃下恒溫倒置培養(yǎng)24 h, 對(duì)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù), 并與對(duì)照組比較, 以與對(duì)照組平板菌落數(shù)差異顯著的藥物梯度濃度判定為受試藥物對(duì)相應(yīng)測(cè)試菌株的MIC值, 以無(wú)菌生長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的藥物梯度濃度判定為受試藥物對(duì)相應(yīng)測(cè)試菌株的MBC值。

2 結(jié)果分析

2.1 水產(chǎn)致病性弧菌的耐藥率及質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)表2的藥敏實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn), 對(duì)7株受試菌針對(duì)8類共14種抗菌藥物的敏感性進(jìn)行判斷, 7株受試菌均表現(xiàn)耐藥(如圖1), 其中編號(hào)B2D的菌株對(duì)受試的14種藥物均表現(xiàn)為耐藥(即對(duì)受試藥物耐藥比例為100%), 7株受試菌均對(duì)3類以上抗生素表現(xiàn)耐藥, 多重耐藥率為100%; 且7個(gè)菌株均對(duì)受試的氨基糖苷類藥物(包括慶大霉素、新霉素和卡那霉素)表現(xiàn)中度耐藥和完全耐藥。

圖1 水產(chǎn)致病菌藥物耐藥率分析

將藥敏實(shí)驗(yàn)所篩選得到的耐藥菌通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒的處理, 分析質(zhì)粒攜帶情況(如圖2)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 7株受試菌均攜帶質(zhì)粒, 質(zhì)粒攜帶率為100%, 每株受試菌攜帶質(zhì)粒大小約為1 kb, 均為小型質(zhì)粒。

圖2 耐藥菌質(zhì)粒電泳圖

注: 1: TO1, 2: BBXP1, 3: BBX1, 4: NA0301, 5: BV2, 6: B2D, 7: 9H7, 8: DNA Marker(10 000 bp)

用ddH2O代替質(zhì)粒DNA作為陰性對(duì)照, 以質(zhì)粒DNA和基因組DNA作為模板, 對(duì)氨基糖苷類耐藥基因′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。質(zhì)粒DNA耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果如圖 3所示, 受試菌BBX1、BBXP1、NA0301、9H7均分別擴(kuò)增出677 bp的特異性片段且無(wú)其他雜帶出現(xiàn)。以相應(yīng)菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行耐藥基因的擴(kuò)增, 如圖4所示, 上述4株菌中的BBX1、BBXP1和NA0301未擴(kuò)增出耐藥基因片段。677 bp的耐藥基因在受試菌的質(zhì)粒DNA及基因組DNA檢出結(jié)果如表5所示。

圖3 質(zhì)粒DNA耐藥基因aph(3′)-Ⅱa PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

注: 1: DNA Marker (2 000 bp), 2: BBX1, 3: BBXP1, 4: TO1, 5: NA0301, 6: BV2, 7: B2D, 8: 9H7, 9: 空白對(duì)照)

對(duì)在質(zhì)粒DNA上檢測(cè)出特異片段同時(shí)在相應(yīng)基因組DNA上未檢出特異片段的3株受試菌(BBX1、BBXP1和NA0301)進(jìn)行耐藥基因測(cè)序, 用DNAstar MegAlign軟件對(duì)耐藥基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析, 結(jié)果表明BBX1、BBXP1、NA0301中的′耐藥基因與GenBank中的序列(登錄號(hào): AY222814)同源性分別為99.1%、99.5%、99.5%, 表明引物特異性較高, 所擴(kuò)增到的片段為′基因(圖4), 提示受試菌′耐藥基因位于質(zhì)粒DNA上, 參與介導(dǎo)受試菌對(duì)新霉素的抗性。

圖4 基因組DNA耐藥基因aph(3′)-Ⅱa PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

注: 1: DNA Marker (2 000 bp), 2: BBX1, 3: BBXP1, 4: TO1,5: NA0301, 6: BV2, 7: B2D, 8: 9H7, 9: 空白對(duì)照

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將3株受試菌的耐藥質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)移進(jìn)受體菌大腸桿菌中, 形成轉(zhuǎn)化子。以弧菌質(zhì)粒DNA為模板作為陽(yáng)性對(duì)照, 以大腸桿菌質(zhì)粒DNA為模板作為陰性對(duì)照, 以ddH2O代替質(zhì)粒DNA作為空白對(duì)照, 以轉(zhuǎn)化子(分別命名為BBX1-大腸、BBXP1-大腸、NA0301-大腸)的質(zhì)粒DNA 作為模板, 對(duì)氨基糖苷類耐藥基因′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示, 3株轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出677 bp的特異性片段。通過(guò)DNAstar MegAlign軟件對(duì)耐藥基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析, 結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子BBX1-大腸、BBXP1-大腸、NA0301-大腸中的′耐藥基因與GenBank中的序列(登錄號(hào): AY222814)同源性分別為95.5%、99.2%、99.2%, 可表明擴(kuò)增到的片段為′基因。而以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株質(zhì)粒DNA為模板的陰性對(duì)照未擴(kuò)增出特異性片段(如圖5), 說(shuō)明受體菌大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株不含有耐藥基因′,即 3株受試菌中的耐藥質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)移到受體菌大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株中。

圖5 耐藥質(zhì)粒電轉(zhuǎn)產(chǎn)物電泳結(jié)果

注: 1: DNA Marker(2 000 bp), 2: BBX1, 3: BBXP1, 4: NA0301, 5: BBX1-大腸, 6: BBXP1-大腸, 7: NA0301-大腸, 8: 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株, 9: 空白對(duì)照

2.3 肉湯稀釋法測(cè)定MIC及MBC

用肉湯稀釋法測(cè)定MIC及MBC, 結(jié)果如圖6所示, 新霉素對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及轉(zhuǎn)化子(BBX1-大腸, BBXP1-大腸, NA0301-大腸)的MIC分別為2 ng/μL、4 ng/μL、4 ng/μL、4 ng/μL, 新霉素對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及轉(zhuǎn)化子(BBX1-大腸, BBXP1-大腸, NA0301-大腸)的MBC分別為4 ng/μL、16 ng/μL、6±2 ng/μL、8 ng/μL; 卡那霉素對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及其轉(zhuǎn)化子(BBX1-大腸, BBXP1-大腸, NA0301-大腸)的MIC分別為8 ng/μL、16 ng/μL和32 ng/μL、16 ng/μL, 卡那霉素對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及轉(zhuǎn)化子(BBX1-大腸, BBXP1-大腸, NA0301-大腸)的MBC分別為16 ng/μL、32 ng/μL、32 ng/μL、32 ng/μL。結(jié)果顯示, 新霉素和卡那霉素對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的MIC及MBC均低于3株轉(zhuǎn)化子對(duì)相應(yīng)抗菌藥物的MIC及MBC。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和3株轉(zhuǎn)化子對(duì)新霉素抗性的差異表明3株受試菌中的耐藥質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)移到大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株中, 且介導(dǎo)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)新霉素及卡那霉素的耐藥機(jī)制, 使大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)新霉素及卡那霉素的敏感性降低。

圖6 大腸桿菌電轉(zhuǎn)前后對(duì)新霉素和卡那霉素抗性的對(duì)比

3 討論

海水養(yǎng)殖環(huán)境源的弧菌群的耐藥狀況不容忽視, 部分地區(qū)海水弧菌對(duì)單種藥物的耐藥率最高達(dá)到90%以上[30], 部分養(yǎng)殖貝類中弧菌的多重耐藥率高達(dá)70%以上[29]。眾所周知, 海洋弧菌屬于條件致病菌, 廣泛存在于水環(huán)境中及養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)。有研究表明弧菌基因組上隱藏著隨時(shí)可被插入耐藥基因片段的整合子[31], 加上水體環(huán)境非常利于微生物之間的接觸, 更利于菌群間互相交換傳遞耐藥因子[32], 從而使弧菌更易表現(xiàn)多重耐藥性。而致病菌的耐藥性傳播和擴(kuò)散不僅嚴(yán)重影響多種藥物在獸醫(yī)臨床的治療效果, 且耐藥菌群很可能借助動(dòng)物宿主通過(guò)食物鏈、環(huán)境或直接接觸等與人類臨床病原菌進(jìn)行傳遞, 特別是人畜/人魚(yú)共患致病菌的耐藥性, 更給人類醫(yī)療帶來(lái)壓力[33]。本研究中來(lái)源于重要養(yǎng)殖貝類的7株弧菌均表現(xiàn)多重耐藥, 4株弧菌對(duì)6類及以上抗菌藥物耐藥, 1株弧菌對(duì)8類共14種抗菌藥物耐藥, 多重耐藥率為100%。

耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移不僅使得耐藥菌的數(shù)量在世界范圍急劇增加, 更介導(dǎo)著耐藥菌往多重耐藥方面發(fā)展。已有研究表明僅通過(guò)混合培養(yǎng)即可將耐藥質(zhì)粒從大腸桿菌向水生病原弧菌轉(zhuǎn)移, 且可使四環(huán)素對(duì)受體弧菌的MIC值大大提高[34]。本研究中仍以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株為受體菌, 以質(zhì)粒上攜帶氨基糖苷類耐藥基因′的哈維弧菌、溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌為供體菌, 采用電擊轉(zhuǎn)化的方法實(shí)現(xiàn)耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移, 所測(cè)得轉(zhuǎn)化子的MIC值和MBC值均提高了2~4倍, 顯示3株轉(zhuǎn)化子對(duì)新霉素及卡那霉素敏感性均低于大腸桿菌對(duì)相應(yīng)抗菌藥物的敏感性, 且在轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒上檢測(cè)到了目的片段, 表明3株供體菌的耐藥質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)移到受體菌中, 且質(zhì)粒參與介導(dǎo)受體菌對(duì)新霉素和卡那霉素的抗性。然而, 轉(zhuǎn)化子并未到達(dá)完全耐藥的表型?？赡苡捎谑茉嚲鷮?duì)氨基糖苷類抗菌藥物耐藥性除了耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)之外, 還存在其他耐藥機(jī)制的共同作用。另一方面, 也可能是對(duì)受體菌做電轉(zhuǎn)化后, 未進(jìn)行持續(xù)的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn), 使得耐藥質(zhì)粒上的耐藥基因未能對(duì)作用底物(抗菌藥物)產(chǎn)生修飾作用, 抗菌藥物仍能與細(xì)菌細(xì)胞中16S rRNA上的A位點(diǎn)相結(jié)合, 從而抑制細(xì)菌蛋白的合成,使細(xì)菌對(duì)抗菌藥物仍存在一定敏感性, 可通過(guò)基因敲除、耐藥質(zhì)粒消除等手段進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。本研究中雖以電擊轉(zhuǎn)化方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以縮短反應(yīng)時(shí)間, 而筆者也曾通過(guò)混合培養(yǎng)方法(接合反應(yīng))將鮑病原哈維弧菌的耐質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中, 使受體菌由初始對(duì)磺胺類藥物高度敏感轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆退? 并獲得對(duì)應(yīng)耐藥質(zhì)粒的全序列(全長(zhǎng)10 940 bp)[35], 提示水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌耐藥株攜帶的耐藥基因向大腸桿菌傳遞的過(guò)程中, 轉(zhuǎn)化方式不受限制。而已有報(bào)道在對(duì)志賀菌屬細(xì)菌質(zhì)粒的研究中發(fā)現(xiàn)了多重耐藥的廣宿主接合質(zhì)粒, 該質(zhì)粒可介導(dǎo)大腸桿菌與志賀菌屬細(xì)菌之間耐藥性的水平傳遞, 且具有頭孢類及單環(huán)內(nèi)酰類的耐藥基因[36]。相關(guān)研究表明能傳遞耐藥基因的質(zhì)粒中, 存在能夠在不同種類的細(xì)菌之間傳遞的廣宿主接合質(zhì)粒[37-38]。值得關(guān)注的是, 大腸桿菌常被作為模式菌株, 與弧菌的生長(zhǎng)條件差異較大, 但二者之間可通過(guò)質(zhì)粒傳遞耐藥性, 該結(jié)果提示環(huán)境菌群很可能在特定條件下將自身的耐藥性傳遞至臨床菌種, 甚至包括部分人類病原菌。近年來(lái), 氨基糖苷類藥物尤其是新霉素和卡那霉素被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是臨床極其重要的藥物[39]。筆者在前期的耐藥分析中發(fā)現(xiàn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌對(duì)新霉素和卡那霉素存在較強(qiáng)的耐藥性(7個(gè)受試株均存在不同程度的耐藥性), 而氨基糖苷磷酸酶基因′主要抑制卡那霉素和新霉素的活性, 雖然APH (′)-IIa的主要氨基糖苷底物是卡那霉素和新霉素, 但這種磷酸轉(zhuǎn)移酶在體外也能滅活阿米卡星, 即使其轉(zhuǎn)化速度較慢[40], 依然存在耐藥傳播風(fēng)險(xiǎn)。以往的研究表明,′最初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)座子Tn5的組成部分[41], 由于Tn5不攜帶傳遞功能信息, 因此通常遵循垂直遺傳模式[40],后期的研究認(rèn)為氨基糖苷類修飾基因具有通過(guò)水平轉(zhuǎn)移進(jìn)行傳播的潛力[43]。然而, 國(guó)內(nèi)外對(duì)這種磷酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)重要基因′的研究很不足, 國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道甚少, 仍有很多問(wèn)題未明晰。本研究不僅明確了′基因存在于受試水生病原弧菌的質(zhì)粒上并參與介導(dǎo)菌株對(duì)新霉素和卡那霉素的耐藥性, 且首次確認(rèn)了特定條件下(如通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化)該基因可由水產(chǎn)病原菌傳遞至大腸桿菌, 因此, 本研究結(jié)果可為耐藥菌中耐藥質(zhì)粒的消除提供依據(jù), 為預(yù)防水生環(huán)境病原菌與臨床病原菌株之間耐藥性的傳遞機(jī)制研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)多個(gè)水產(chǎn)致病弧菌(包括引起方斑東風(fēng)螺、鮑發(fā)病的哈維弧菌、塔氏弧菌、溶珊瑚弧菌及卵形鯧鲹結(jié)節(jié)病病原美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種)質(zhì)粒上新霉素和卡那霉素對(duì)應(yīng)耐藥基因′進(jìn)行檢測(cè)分析, 并利用電穿孔法將篩選得到的哈維弧菌、塔氏弧菌和溶珊瑚弧菌3個(gè)受試病原菌株上的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株中, 進(jìn)一步的藥敏測(cè)試結(jié)果顯示, 3株轉(zhuǎn)化子對(duì)新霉素及卡那霉素敏感性均明顯低于受試大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)相應(yīng)抗菌藥物的敏感性(轉(zhuǎn)化子的MIC值和MBC值均提高了2~4倍),且在轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒上檢測(cè)到了目的片段。本研究明確了′基因存在于受試水生病原弧菌的質(zhì)粒上并參與介導(dǎo)菌株對(duì)新霉素和卡那霉素的耐藥性, 且首次確認(rèn)了特定條件下該基因可由水產(chǎn)病原菌傳遞至大腸桿菌。

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Primary research on the transmission mechanism of resistance to aminoglycoside for pathogenic marinestrains

WANG Rui-xuan1, WANG Jiang-yong2, LI Yun-ping3, GUO Zi-han4, LI Bing2, LI Yun1, ZHU Hui1

(1. Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Guangzhou 510300, China; 3. South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 4. California Baptist University, California 92504, USA)

The growing number of antimicrobial agents in aquaculture and the development of multi-antibiotics use have led to significant antibiotic-resistances and multi-resistance, which has increased the prevention and control of bacterial diseases in aquaculture. The most effective way for bacteria to spread antibiotic resistance is through the transfer of resistant plasmids. In the present study, theaminoglycoside-resistant gene located on plasmid DNA was amplified by polymerase chain reaction and then three resistant plasmids were sequenced and transformed intoby electroporation. It has been shown that the target gene sequence of three mutants was detected. The result of resistance analysis suggested that the minimal inhibitory concentration (MIC) and the minimal bactericidal concentration (MBC) of three transformants were all much higher than the MIC and the MBC of standard strain. It suggested that drug-resistant plasmids in vibrio spp. could be transferred to, and the resistant plasmid had participated in the resistance mechanism to control the resistance of strains to aminoglycosides, such as neomycin and kanamycin. This study will provide important data and be a reference for the study on the transmission of resistance to aminoglycoside between environmental vibrios and clinical bacteria.

pathogenic vibrio; antibiotic-resistant plasmid; neomycin; kanamycin; drug resistance mechanism

Dec. 21, 2019

Q931

A

1000-3096(2020)10-0081-10

10.11759/hykx20191221002

2019-12-21;

2020-03-01

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2017A030313112); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31902416); 廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位專家(粵財(cái)農(nóng)[2019]73號(hào)); 國(guó)家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位專家(CARS-49); 廣東省教育廳特色創(chuàng)新科研項(xiàng)目(2016KTSCX086)

[Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2017A030313112; National Natural Science Foundation of China, No. 31902416; Modern Agricultural Industry Technical System Post Expert of Guangdong, Province, No. 2019-73; National Shellfish Industry Technical System Position Expert, No. CARS-49; the Innovative Scientific Research Project of Education Department of Guangdong Province, No. 2016KTSCX086]

王瑞旋(1979- ), 女, 廣東揭陽(yáng)市人, 副研究員, 博士, 主要從事海洋細(xì)菌耐藥性研究, E-mail: wangruixuan@scsfri.ac.cn; 朱慧, 男,通信作者, 教授, 主要研究方向: 生理生態(tài)學(xué), E-mail: gdzhuhui@126.com

(本文編輯: 楊 悅)