魚類疫苗浸泡免疫策略優(yōu)化的研究現(xiàn)狀

姚海靜, 韓高尚, 高迎莉, 2, 3

魚類疫苗浸泡免疫策略優(yōu)化的研究現(xiàn)狀

姚海靜1, 韓高尚1, 高迎莉1, 2, 3

(1. 江蘇海洋大學(xué) 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院, 江蘇 連云港 222000; 2. 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222000; 3. 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222000)

疫苗是一種針對(duì)特定疾病并改善免疫者免疫力的生物制劑。疫苗能刺激免疫者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng), 提高免疫者的抗病能力, 達(dá)到免疫保護(hù)的效果。浸泡免疫是魚類特有的免疫接種方法, 該方法能簡(jiǎn)化人工操作、減少工作強(qiáng)度、降低魚體應(yīng)激、刺激魚體的黏膜系統(tǒng), 可在短時(shí)間內(nèi)完成大量的免疫工作。正確的疫苗使用有助于提高疫苗的效果。作者對(duì)魚類黏膜免疫機(jī)制、魚類疫苗浸泡免疫方式、浸泡免疫策略優(yōu)化的方法、浸泡免疫面臨的問題以及浸泡免疫的發(fā)展趨勢(shì)等進(jìn)行綜述, 以期為魚類病害防治和魚體免疫增強(qiáng)的研究提供新思路和新策略。

魚類; 疫苗; 浸泡免疫; 策略優(yōu)化

1796年, 英國內(nèi)科醫(yī)生愛德華·詹納給一個(gè)男孩接種牛痘預(yù)防天花, 開啟疫苗接種(vaccination)預(yù)防傳染性疾病的歷史。疫苗免疫在哺乳動(dòng)物應(yīng)用中蓬勃發(fā)展, 而在魚類應(yīng)用中發(fā)展緩慢。1938年, Snieszko[1]等用波蘭語發(fā)表第一篇關(guān)于鯉魚()免疫腸型點(diǎn)狀氣單胞菌()后獲得免疫保護(hù)力的文章, 由于語言限制, 影響力較小。1942年, Duff[2]發(fā)表第一篇英文報(bào)道的魚類疫苗免疫的文章, 克拉克大馬哈魚()長期(>64 d)飼喂含有殺鮭氣單胞菌()疫苗的飼料后進(jìn)行浸泡攻毒, 其死亡率降低。1976年, 第一個(gè)漁用疫苗在美國注冊(cè)生產(chǎn), 后期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該疫苗能預(yù)防魯克氏耶爾森菌()導(dǎo)致的虹鱒()腸道疾病[3]。1986年, 中國研制出第一個(gè)漁用疫苗——草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗, 此后, 漁用疫苗的研制在中國迅速開展起來[4]。與抗生素相比, 疫苗具有提高免疫者的免疫水平、無殘留和無污染等優(yōu)點(diǎn), 因此, 利用疫苗對(duì)魚類進(jìn)行有效的疾病防控已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展的重要因素[5]。

目前漁用疫苗的主要免疫方式有注射免疫、口服免疫和浸泡免疫。注射免疫是漁用疫苗的最主要免疫方式, 可以確保每尾魚接種準(zhǔn)確的疫苗劑量, 激活魚體的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng), 使得魚體獲得的免疫保護(hù)率可達(dá)到50%(肌肉注射)[6]或100%(腹腔注射)[7]。但是, 注射免疫也有其自身的局限性: 20 g以下的魚苗無法使用注射免疫[8]、工作強(qiáng)度大、勞動(dòng)力成本過高且會(huì)對(duì)魚體產(chǎn)生一定的應(yīng)激性; 注射免疫可能會(huì)給魚體帶來副作用, 比如影響魚類的生長等, 注射部位發(fā)生局部纖維性腹膜炎、肉芽腫、黑化等反應(yīng)[9]。口服免疫是指采取投喂和口灌的方式, 將疫苗送入魚體的消化道以刺激魚體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究結(jié)果顯示, 口服免疫使魚體獲得較好的免疫保護(hù), 操作方式簡(jiǎn)單, 避免對(duì)魚體產(chǎn)生應(yīng)激性, 適合任何大小的魚體[9]。但是, 口服免疫無法保證魚體攝入適當(dāng)?shù)囊呙鐒┝? 而且疫苗在進(jìn)入腸道以后, 通常會(huì)被胃和前腸中的消化酶等破壞, 從而降低疫苗自身的免疫原性[10]。最簡(jiǎn)單和直接的魚類免疫方式是浸泡免疫, 即魚體表面(鰓、皮膚和消化道)暴露于稀釋的疫苗溶液中, 魚體通過鰓、皮膚、側(cè)線和腸道攝取抗原, 直接刺激魚體的黏膜免疫系統(tǒng)[11]。中國水產(chǎn)養(yǎng)殖的工廠集約化養(yǎng)殖程度逐漸提高, 需要深入研發(fā)魚類浸泡疫苗種類以及優(yōu)化浸泡免疫方式。作者將對(duì)魚類疫苗的浸泡免疫相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述, 以期為魚類病害防治和機(jī)體免疫增強(qiáng)的研究提供新思路和新策略。

1 魚類黏膜免疫機(jī)制

魚類生存于微生物較豐富的水中, 黏膜系統(tǒng)最先接觸水。黏膜系統(tǒng)雖是微生物入侵的主要入口, 但是黏膜系統(tǒng)表面覆蓋的黏液中富含抗菌物質(zhì)、補(bǔ)體、免疫球蛋白等, 且黏膜系統(tǒng)內(nèi)具有抗原呈遞細(xì)胞(Antigen presetation cells, APCs), 所以當(dāng)病原微生物入侵魚體時(shí), 黏膜系統(tǒng)可以充分發(fā)揮其屏障作用, 同時(shí)黏膜系統(tǒng)的非特異性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)還具有殺死入侵病原的能力[12]。

1.1 魚類皮膚黏膜免疫機(jī)制

魚類皮膚黏膜是抵擋病原微生物入侵的第一道防線, 魚類皮膚黏膜的免疫保護(hù)機(jī)制有4種途徑: (1) 分泌大量黏液, 這些黏液中包含蛋白酶、抗菌肽、溶菌酶、補(bǔ)體、凝集素、C反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白和堿性磷酸酶等抗菌物質(zhì), 這些物質(zhì)能夠阻止或殺死病原微生物。金頭鯛()皮膚黏液中的過氧化物酶、酯酶以及蛋白酶活性高于血清, 且黏液殺菌能力也高于血清[13]; (2) 黏液中的防御素能夠降解并中和入侵的病原微生物。研究者發(fā)現(xiàn), 魚體免疫滅活的殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌()或魯克氏耶爾森菌的全菌疫苗后, 虹鱒或鯉魚的血清或黏液中的溶菌酶活力顯著提高[14-16]; (3) 吞噬細(xì)胞對(duì)黏附在皮膚表面的病原微生物進(jìn)行吞噬。魚類皮膚中已經(jīng)鑒定出多種吞噬細(xì)胞, 如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等[17-18], 這些細(xì)胞可以對(duì)入侵的病原微生物進(jìn)行吞噬; (4) APCs攝入并呈遞抗原, 激活獲得性免疫系統(tǒng)。研究表明, 魚類皮膚黏液中發(fā)現(xiàn)新的免疫球蛋白IgT[19]以及抗體分泌細(xì)胞[20], 說明魚類皮膚可以參與獲得性免疫反應(yīng)。鰻鱺()[21]和牙鲆()[22]分別浸泡免疫創(chuàng)傷弧菌()疫苗和遲緩愛德華氏菌()疫苗后, 皮膚黏液中特異性抗體出現(xiàn)的時(shí)間早于血清, 說明疫苗經(jīng)過皮膚黏膜呈遞后, 迅速激活皮膚黏膜免疫系統(tǒng)的獲得性免疫反應(yīng), 皮膚內(nèi)的抗體分泌細(xì)胞分泌特異性抗體, 加強(qiáng)魚體的免疫保護(hù)。

1.2 魚類鰓黏膜免疫機(jī)制

和皮膚黏膜類似, 魚類鰓黏膜具有類似的免疫保護(hù)機(jī)制。首先, 鰓黏膜層是防御素的載體, 如黏蛋白、補(bǔ)體、抗菌肽、和抗體等, 這些防御素在非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17]。其次, 鰓中含有巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞, 參與抗原攝入和免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外, 鰓絲基部的鰓間隔中聚集淋巴細(xì)胞, 說明魚類患鰓部疾病時(shí), 這些淋巴細(xì)胞參與免疫監(jiān)視[23]。最后, 鰓黏膜參與機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng), 鰓黏膜中具有B淋巴細(xì)胞, 免疫球蛋白的種類多(IgM、IgD、IgT)[24]; 此外, 一些研究者在虹鱒[25]、石斑魚()[26]和鯽魚()[27]鰓黏膜中發(fā)現(xiàn)了活化的CD4 T淋巴細(xì)胞和CD8 T淋巴細(xì)胞。同時(shí), 魚類浸泡免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí), 鰓是牙鲆攝入疫苗的主要途徑[28]。

1.3 魚類腸道黏膜免疫機(jī)制

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是最復(fù)雜的與抗原接觸最多的黏膜免疫系統(tǒng)。魚類的腸道免疫系統(tǒng)可以分為先天性免疫和獲得性免疫兩部分。魚類腸道黏液中含有抗菌肽、補(bǔ)體因子和免疫球蛋白等物質(zhì), 腸道中具有APCs, 包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[29]、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞[19]以及M樣細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[30]。研究證明, 中腸是口服疫苗的主要攝入部位, 因?yàn)橹心c內(nèi)的APCs數(shù)量最多[30]。但是由于疫苗會(huì)在胃和前腸中發(fā)生降解, 導(dǎo)致口服疫苗效果不佳, 因此需要設(shè)計(jì)口服疫苗的傳遞系統(tǒng)減少疫苗降解, 使疫苗順利到達(dá)中腸, 常用的傳遞方法有鹵蟲()生物包埋[31]、萊茵衣藻()包埋[32]、生物膜法[33]和微型膠囊[34]等。腸道黏膜受到病原微生物刺激時(shí), 腸道黏膜能分辯這些刺激是否對(duì)機(jī)體有害。如果是無害刺激, 相關(guān)的淋巴組織仍然維持低反應(yīng)性的免疫監(jiān)視; 一旦是有害刺激, 淋巴組織就會(huì)快速應(yīng)答。病原體接觸消化道黏膜后, 抗原會(huì)被上皮黏膜細(xì)胞吸收, 上皮黏膜細(xì)胞對(duì)抗原進(jìn)行加工后, 再遞呈給T淋巴細(xì)胞, 最后由免疫細(xì)胞清除抗原[35]。

2 魚類疫苗浸泡免疫方式的概述

浸泡免疫是操作最簡(jiǎn)單的、水產(chǎn)動(dòng)物所特有的一種免疫方式。浸泡免疫是將魚類置于一定濃度疫苗溶液中浸泡一段時(shí)間以達(dá)到魚體免疫預(yù)防的免疫方式[12]。浸泡免疫的操作比較簡(jiǎn)單, 降低了勞動(dòng)力, 還避免了對(duì)魚體的應(yīng)激性, 且在短時(shí)間內(nèi)可以完成大量的免疫工作, 大大降低了魚類養(yǎng)殖的成本[36]。此外, 浸泡免疫可以模擬病原微生物通過黏膜組織進(jìn)入魚體的途徑, 有效地刺激魚體的黏膜系統(tǒng), 產(chǎn)生特異性的黏膜免疫反應(yīng)[37]。浸泡免疫主要有3種方式: 直接浸泡、噴霧和沖洗。直接浸泡是將魚體轉(zhuǎn)移到疫苗溶液中, 一段時(shí)間后魚類再轉(zhuǎn)移到養(yǎng)殖池中。直接浸泡又可以分為浸漬和浸浴兩種方式。浸漬方式時(shí)間短, 疫苗溶液濃度高; 而浸浴時(shí)間較長, 疫苗溶液濃度低。直接浸泡免疫不需要進(jìn)行魚體的預(yù)處理, 是目前廣泛使用的浸泡免疫方式。然而, 噴霧以及沖洗由于可操作性較差, 魚體應(yīng)激較大, 在實(shí)際應(yīng)用中較少。浸泡免疫的疫苗類型主要有滅活疫苗、減毒活疫苗以及亞單位疫苗[38]。

雖然眾多的研究已證實(shí), 浸泡免疫可以提高魚類的免疫保護(hù)力, 但是浸泡免疫的免疫效果受疫苗劑量攝入、免疫時(shí)的水溫、魚體大小、浸泡時(shí)間和佐劑使用等因素的影響, 其中, 影響最大的因素是疫苗劑量攝入、浸泡時(shí)間以及免疫佐劑的選用[38]。因此, 研發(fā)新型無毒高效的免疫佐劑以及優(yōu)化浸泡免疫策略顯得尤為重要, 這可為魚類疫苗的推廣和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

3 提高浸泡免疫效果的相關(guān)研究進(jìn)展

浸泡免疫是魚類的一種黏膜免疫方式, 疫苗被魚體黏膜組織如皮膚、鰓和腸等攝入后, 引起局部的免疫反應(yīng)。和注射免疫相比, 浸泡免疫后的機(jī)體免疫反應(yīng)弱, 持續(xù)時(shí)間短[39-41]。因此, 如何提高黏膜組織對(duì)抗原的攝入量, 從而最大限度地增強(qiáng)免疫反應(yīng)是至關(guān)重要的。優(yōu)化的浸泡免疫策略, 如高滲浸泡(Hyperosmotic immersion, HI)、身體穿刺浸泡、超聲波介導(dǎo)浸泡、浸泡佐劑使用以及疫苗浸泡濃度和疫苗浸泡時(shí)間組合等, 可以提高浸泡免疫的效果。

3.1 高滲浸泡

高滲浸泡是指魚類先放在含有氯化物的高滲溶液中浸泡一段時(shí)間, 再將其移入含有疫苗溶液中浸泡免疫的免疫方式[37]。高滲浸泡預(yù)處理過程中, 突然變化的滲透壓導(dǎo)致魚類黏膜上皮因失水而皺褶, 甚至部分上皮細(xì)胞由于脫落會(huì)留下空洞, 疫苗浸泡后, 這些上皮細(xì)胞會(huì)吸水恢復(fù)原有的狀態(tài); 上皮細(xì)胞大量吸水時(shí), 疫苗的攝入量也大大增加, 從而增強(qiáng)魚體的免疫反應(yīng)。陳月英[42]等用食鹽作高滲劑浸浴鯽魚, 再用嗜水氣單胞菌菌苗浸泡免疫鯽魚, 結(jié)果顯示, 與對(duì)照組比, 高滲處理組鯽魚的免疫保護(hù)率提高10%。有的研究人員認(rèn)為高滲浸泡對(duì)魚體應(yīng)激太大, 但Huising[37]等發(fā)現(xiàn), 鯉魚高滲浸泡免疫疫苗后, 鰓、血漿的皮質(zhì)醇水平以及皮膚細(xì)胞的損傷都是短暫的并且可迅速恢復(fù)的, 這些短暫的細(xì)胞損傷會(huì)起到佐劑的效果, 增加鯉魚對(duì)殺鮭氣單胞菌疫苗的攝入量。高滲浸泡免疫時(shí), 高滲溶液的鹽度有一定的限制范圍。Fender[43]等研究表明, 在特定的高滲鹽度值內(nèi), 虹鱒的抗原攝入會(huì)增加, 但高于這個(gè)鹽度域值, 魚體并不能增加抗原的攝入量。對(duì)于鯉魚來說, 5.3%() NaCl和4.5%() NaCl溶液疫苗中, 抗原的攝入量沒有顯著差異[37]。Gao[22, 28]等的研究結(jié)果表明, 浸泡溶液鹽度為50時(shí), 牙鲆對(duì)遲緩愛德華氏菌抗原的攝入量達(dá)到最大, 且牙鲆的抗體免疫反應(yīng)以及細(xì)胞免疫反應(yīng)達(dá)到最佳。因此, 對(duì)于高滲浸泡來說, 高滲溶液鹽度的選取至關(guān)重要。當(dāng)鹽度過高時(shí), 魚體黏膜上皮的損傷不可恢復(fù), 造成魚體對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)下降; 當(dāng)鹽度過低時(shí), 浸泡免疫時(shí)間有限, 黏膜上皮細(xì)胞不能對(duì)疫苗做出有效的反應(yīng), 魚體不能攝入最佳的疫苗量。

3.2 身體穿刺浸泡

身體穿刺浸泡是指在魚體接受浸泡免疫之前, 使用穿刺工具(圖1)在魚體皮膚上制造一些小創(chuàng)傷, 再將魚體置于疫苗溶液中浸泡的一種免疫方式。在人類疫苗預(yù)防中, 穿刺工具就被廣泛應(yīng)用于經(jīng)皮膚免疫來預(yù)防肺結(jié)核病。穿刺浸泡與皮內(nèi)注射相比, 易于操作, 可以降低像淋巴腺炎和潰瘍等導(dǎo)致傷疤等的副作用。Nakanishi[44]等使用穿刺浸泡滅活的海豚鏈球菌()疫苗免疫虹鱒魚苗后, 其免疫保護(hù)率與注射疫苗后的免疫保護(hù)率類似, 這是因?yàn)楹琪V經(jīng)穿刺浸泡后, 抗原攝入量大大增加, 并且這些抗原可以傳遞到淋巴組織中。仔稚魚的疾病問題是魚類苗種繁殖過程中的大問題, 許多病毒性或細(xì)菌性疾病就發(fā)生在魚體發(fā)育的早期階段, 當(dāng)仔稚魚的體重超過0.5 g并且具備免疫能力時(shí), 人工進(jìn)行免疫接種可以預(yù)防多種疾病[45]。因此, 身體穿刺浸泡免疫特別適合仔稚魚疾病的免疫防控, 降低魚類育種過程中的死亡率。

圖1 穿刺工具和應(yīng)用[14]

3.3 超聲波介導(dǎo)浸泡

超聲波介導(dǎo)浸泡是指高頻聲波(≥20 kHz)結(jié)合浸泡免疫的免疫方式, 疫苗浸泡免疫過程中同時(shí)或間隔使用超聲波。超聲波產(chǎn)生物理震動(dòng), 使生物可以穿過動(dòng)物組織, 同時(shí)超聲過程中還會(huì)產(chǎn)生氣旋和熱, 可以顯著地提高動(dòng)物組織的滲透性。Fernandez- Alonso[46]等將病毒性出血性敗血癥病毒的DNA疫苗使用超聲介導(dǎo)浸泡免疫方式免疫虹鱒, 虹鱒的相對(duì)保護(hù)率達(dá)到50%。滅活的海豚鏈球菌全菌疫苗超聲波介導(dǎo)浸泡免疫奧尼羅非魚(×), 魚體的相對(duì)保護(hù)率達(dá)到77.2 %[47]。Zhou[48]等研究發(fā)現(xiàn), 適宜強(qiáng)度(175 mW/cm2)的低頻率超聲波(35 kHz)不會(huì)對(duì)六帶石斑魚()造成傷害。在該實(shí)驗(yàn)中, 不同的超聲波介導(dǎo)方法, 即先超聲波處理六帶石斑魚再浸泡免疫溶藻弧菌()疫苗, 或者六帶石斑魚先浸泡免疫疫苗再超聲波處理后再次浸泡免疫疫苗, 都使六帶石斑魚獲得較好的免疫保護(hù)。金魚()超聲波介導(dǎo)浸泡牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)后, 皮膚中BSA攝入量顯著增加, 且血清中特異性的抗體水平也有所增加[49]。Labarca[50-51]等證明, 虹鱒低頻率超聲波介導(dǎo)浸泡免疫殺鮭氣單胞菌疫苗后, 魚體的抗原攝入量增加, 炎癥反應(yīng)和黏膜免疫反應(yīng)顯著增強(qiáng)。

3.4 浸泡佐劑使用

佐劑(Adjuvant)是非特異性免疫增強(qiáng)劑, 它自身沒有免疫原性, 但能夠輔助疫苗發(fā)揮作用, 增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力或改變機(jī)體免疫應(yīng)答的類型。目前研發(fā)的浸泡疫苗抗原純度高、特異性強(qiáng), 但免疫原性相對(duì)較差, 對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答誘導(dǎo)能力較弱。因此, 選擇合適的佐劑對(duì)浸泡免疫效果提升至關(guān)重要。佐劑增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的機(jī)制有3種: (1) 佐劑使抗原的物理狀態(tài)發(fā)生改變, 抗原停留時(shí)間延長; (2) 佐劑刺激單核吞噬細(xì)胞對(duì)抗原的遞呈能力; (3) 佐劑刺激淋巴細(xì)胞分化, 提高免疫應(yīng)答能力[52]。目前應(yīng)用于浸泡免疫過程中的佐劑主要有莨菪堿、皂土、甘草素、氯化鈉、葡聚糖、脫乙酰幾丁質(zhì)和雞蛋清等[53]。The MontanideTM是具有良好信譽(yù)的商品化疫苗佐劑品牌, 種類繁多, 其中IMS1312 VG是一種水包油型佐劑, 用于魚類的浸泡免疫, 有利于疫苗懸浮, 防止疫苗聚合凝集, 有利于魚體吸收疫苗。Soltani[54]等發(fā)現(xiàn), 與直接浸泡魯克氏耶爾森菌疫苗的虹鱒相比, 浸泡疫苗溶液中加入佐劑IMS1312VG免疫的虹鱒的血清溶菌酶活力和抗體滴度明顯增強(qiáng)且免疫保護(hù)率提高。嗜水氣單胞菌滅活疫苗結(jié)合 IMS1312VG浸泡免疫異育銀鯽()后, 魚體的抗體效價(jià)達(dá)1︰64, 相對(duì)保護(hù)率為67%, 不加佐劑浸泡的魚體中抗體效價(jià)卻只有1︰32, 相對(duì)保護(hù)率為56%[55]。

3.5 疫苗浸泡濃度和疫苗浸泡時(shí)間組合

浸泡免疫過程中, 諸多因素影響抗原的攝入量, 從而影響免疫保護(hù)率, 最重要的因素就是抗原的濃度、浸泡時(shí)間的長短以及抗原本身的性質(zhì)(可溶型還是顆粒型)[56]。魚類浸泡免疫后, 機(jī)體獲得的免疫保護(hù)持續(xù)時(shí)間少于6個(gè)月[57-58], 而加強(qiáng)免疫可以提高免疫保護(hù)率以及延長免疫保護(hù)的時(shí)間[59], 但是加強(qiáng)免疫需要花費(fèi)多一倍的浸泡疫苗劑量和時(shí)間, 成本太高。因此, 研究者們開始考慮是否可以采取降低疫苗濃度同時(shí)延長浸泡時(shí)間, 或者提高疫苗濃度同時(shí)減少浸泡時(shí)間的措施來提高魚類浸泡免疫的保護(hù)率。Ototake[60]等和Moore[61]等利用模擬的乳膠顆粒和疫苗抗原-BSA研究了抗原濃度和浸泡時(shí)間對(duì)魚體抗原攝入量的影響。結(jié)果顯示, 抗原濃度和浸泡時(shí)間與抗原的攝入量相關(guān)。魯克氏耶爾森菌疫苗不同稀釋濃度和浸泡時(shí)間組合中, 棕鱒()在稀釋2 000倍的疫苗溶液中浸泡6 h后獲得的免疫保護(hù)率最高[62]; 硬頭鱒()在不同稀釋倍數(shù)的放射性同位素標(biāo)記的殺鮭氣單胞菌疫苗中浸泡不同的時(shí)間, 疫苗攝入量的研究結(jié)果顯示, 當(dāng)細(xì)菌濃度較低時(shí), 延長浸泡的時(shí)間可以增加抗原的攝入量[63]。牙鲆浸泡免疫稀釋遲緩愛德華氏菌疫苗, 同時(shí)延長浸泡免疫的時(shí)間至24 h, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 牙鲆血清的溶菌酶活力以及殺菌活力顯著增強(qiáng), 同時(shí)牙鲆抗體凝集效價(jià)和免疫保護(hù)率提高[64]。Du[65]等分別用不同濃度滅活的遲緩愛德華氏菌疫苗(106、107、108和109cfu/mL)以及不同浸泡時(shí)間(30、60和90 min)組合浸泡免疫牙鲆, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 免疫保護(hù)率與疫苗濃度和浸泡時(shí)間密切相關(guān), 其中108cfu/mL的疫苗濃度浸泡牙鲆60 min后得到的免疫保護(hù)率最高。

4 浸泡免疫面臨的問題

浸泡免疫能夠增強(qiáng)魚類的免疫保護(hù)力, 但是浸泡疫苗的種類與數(shù)量不足以及疫苗效果評(píng)價(jià)指標(biāo)不統(tǒng)一等都是浸泡疫苗研究和推廣面臨的問題。此外, 大多數(shù)養(yǎng)殖戶只了解浸泡免疫的流程, 對(duì)浸泡過程中的關(guān)鍵因素缺乏科學(xué)的認(rèn)識(shí)(浸泡水溫、浸泡工具、溶解氧和佐劑的選用等)。

4.1 浸泡疫苗的種類與數(shù)量不足

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展, 傳染病病原體很容易在個(gè)體之間傳播, 疫苗在漁業(yè)養(yǎng)殖中發(fā)揮著重要的作用[66]。養(yǎng)殖魚類以及病原體種類繁多, 病原體的抗原比較復(fù)雜, 且由于環(huán)境等各種因素的影響, 病原體的變異率較高, 這些給浸泡疫苗的研發(fā)帶來困難。目前, 國內(nèi)還沒有商品化的浸泡疫苗, 不能滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的需求。但是, 研究者對(duì)不同魚類的不同病原體的浸泡疫苗的研發(fā)以及疫苗效果進(jìn)行了探究(表1), 中國在浸泡疫苗的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用上仍有很長的路要走。而在美國, 農(nóng)業(yè)部許可的疫苗種類達(dá)到10種(表2)[73]。因此, 中國浸泡疫苗的種類與數(shù)量跟國外相比, 與中國水產(chǎn)養(yǎng)殖的世界地位相比, 有些不相稱。

表1 國內(nèi)部分研究的浸泡疫苗種類

表2 截至2013年2月份, 美國農(nóng)業(yè)部許可的魚類疫苗

4.2 疫苗效果評(píng)價(jià)指標(biāo)不統(tǒng)一

哺乳動(dòng)物中, 疫苗許可是參照已經(jīng)建立的免疫保護(hù)相關(guān)性, 這種免疫保護(hù)相關(guān)性是抗體表達(dá)水平[74]。傳統(tǒng)上的浸泡疫苗評(píng)價(jià)方式是相對(duì)保護(hù)率, 該評(píng)價(jià)指標(biāo)經(jīng)常被用于評(píng)估疫苗的效果。此外, 免疫后魚體攻毒后的病原攜帶量[57, 75, 76]、抗體細(xì)胞數(shù)量[22, 40, 65]、血漿或黏液中特異性抗體的水平[13, 21-22, 77]、免疫相關(guān)基因表達(dá)量[28, 58, 78, 79]、抗原攝入量[28, 37, 49-50]等評(píng)價(jià)方式也應(yīng)用于浸泡疫苗的效果評(píng)價(jià)。但由于魚類種類差異性、生境差異性以及生理差異性等各差異因素的存在, 目前還沒有統(tǒng)一的浸泡疫苗效果評(píng)價(jià)方法, 因此無法對(duì)所研制的浸泡疫苗做出正確、科學(xué)的判斷, 也無法為浸泡疫苗的許可作參照數(shù)據(jù)。

5 浸泡免疫發(fā)展趨勢(shì)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)(全基因組)的發(fā)展以及魚類疫苗政策的改變(DNA疫苗已經(jīng)被歐洲授權(quán)), 魚類浸泡疫苗以及浸泡策略的未來發(fā)展前景廣闊。一方面, 疫苗抗原鑒定(反向疫苗學(xué))及抗原呈遞方式(病毒樣顆粒、脂質(zhì)粒、免疫刺激復(fù)合物)的研究方法革新為浸泡疫苗研制打下良好的基礎(chǔ)[80]。此外, 新型疫苗(mRNA疫苗、DNA疫苗、減毒活疫苗、自體疫苗)和新型浸泡佐劑[81](CpG寡脫氧核苷酸); 細(xì)胞因子(白介素)的種類不斷增多, 豐富了魚類浸泡疫苗的選擇。另一方面, 魚類黏膜免疫系統(tǒng)機(jī)制的研究越來越受到重視[82], 這為黏膜疫苗的研發(fā)以及水產(chǎn)疫苗浸泡免疫的研究和推廣等奠定基礎(chǔ)。

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Current investigation status of immerison vaccination strategy optimization in fish

YAO Hai-jing1, HAN Gao-shang1, GAO Ying-li1, 2, 3

(1. College of Marine Life and Fisheries, Jiangsu Oean University, Lianyungang 222000, China; 2. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Lianyungang 222000, China; 3. Jiangsu Key Laboratory of Marine Bioresources and Environment, Lianyungang 222000, China)

Avaccine is a biological preparation directed against a specific disease, which can stimulate a fish’s immune system to produce both specific and nonspecific immunity, thus providing resistance to diseases via immune protection. Immersion vaccination is a specialized immunization method for fish, which simplifies the artificial operation process, reduces labor intensity, decreases the degree of stress on the fish, stimulates the mucosal system of the fish, and can be completed in a short period of time on a large number of fish. The use of the correct vaccination strategy is very important to improve the vaccine’s effectiveness. In this paper, research progress on the mechanisms of mucosal immunity in fish, modes of vaccination, the optimization of immersion vaccination methods, problems faced by immersion vaccination, and developmental trends were reviewed with the aim of providing new insights and strategies for disease control and immunological enhancement in fish.

fish; vaccine; immersion vaccination; strategy optimization

Nov. 6, 2019

Q-1

A

1000-3096(2020)10-0133-10

10.11759/hykx20191106002

2019-11-06;

2020-03-25

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(BK20170450); 江蘇省省政策引導(dǎo)類計(jì)劃-北科技專項(xiàng)項(xiàng)目(SZ-LYG2017020); 江蘇省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(HS2017003); 江蘇海洋大學(xué)啟動(dòng)基金項(xiàng)目(KQ16032)

[Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK20170450; Policy Guidance Program of Jiangsu Province, No. SZ-LYG2017020; The Open Research Fund of Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, No. HS2017003; Scientific Research Foundation Program of Jiangsu Ocean University, No. KQ16032]

姚海靜(1988- ), 女, 江蘇連云港人, 碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫學(xué)研究, E-mail: 544873329@qq.com; 高迎莉,通信作者, E-mail: yingligao0127@126.com

(本文編輯: 譚雪靜)