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    左支結(jié)扎制備SD大鼠門脈高壓動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究

    2020-11-06 05:33:46王文曉柏娟劉樹(shù)立
    關(guān)鍵詞:門脈主干門靜脈

    王文曉,柏娟,劉樹(shù)立

    (1.煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院兒科,山東 煙臺(tái) 264000;2.煙臺(tái)業(yè)達(dá)醫(yī)院兒科,山東 煙臺(tái) 264006;3.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院普外科,北京 100020)

    門脈高壓是一種常見(jiàn)的肝疾病,并且其具有較高的死亡率[1-2]。但其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確,有研究表明NO在維持門脈高壓高動(dòng)力循環(huán)中發(fā)揮重要作用[3-5],但絕大多數(shù)研究是基于肝硬化導(dǎo)致的門脈高壓。肝前型門脈高壓中NO是否也發(fā)揮類似的作用,國(guó)內(nèi)外研究較少。

    上世紀(jì)80年代,Van Thiel等[6]首次報(bào)道門靜脈主干部分結(jié)扎制作門脈高壓動(dòng)物模型,國(guó)內(nèi)外眾多研究者對(duì)這一模型進(jìn)行復(fù)制、研究,取得了不錯(cuò)的結(jié)果[7]。一例由于門靜脈左支中斷而形成的肝前型門脈高壓引發(fā)思考,單純行門靜脈左支部分結(jié)扎是否也會(huì)形成穩(wěn)定的門脈高壓?NO在其中是否發(fā)揮相應(yīng)作用?現(xiàn)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    8周齡SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,體重260~280 g,平均體重268 g,北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK(京)2019-0008】,飼養(yǎng)于山東國(guó)際生物科技園發(fā)展有限公司【SYXK(魯)2018-0030】。飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水,飼喂普通維持飼料由青島今墨堂生物技術(shù)有限公司【SCXK(魯)2018-0009】提供。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度控制在21~25℃。所有操作均符合首都兒科研究所實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(審批號(hào):SEDDLL-20190045)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

    大鼠NO試劑盒(上海臻科生物科技有限公司提供),BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司生產(chǎn))。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

    36只大鼠隨機(jī)分為6組,每組6只。分別為直徑0.6、0.7、0.8 mm針門靜脈左支結(jié)扎組,直徑0.9 mm針門靜脈主干結(jié)扎組,肝左外葉切除組,假手術(shù)組。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

    所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前晚禁食,手術(shù)采用3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉約10 min后開(kāi)始手術(shù),手術(shù)從劍突向下作2 cm腹部正中切口,暴露、游離門靜脈主干至門脈左右支分叉,繼續(xù)向上游離門靜脈左支。左支結(jié)扎組分別用直徑0.6、0.7、0.8 mm針,平行置于門靜脈左支旁,用4號(hào)絲線將門靜脈左支與直針一起結(jié)扎,緩慢旋轉(zhuǎn)抽出直針;主干結(jié)扎組用直徑0.9 mm針,平行置于門靜脈主干旁,其余與前相同;左外葉切除組游離左外葉,并在左外葉根部結(jié)扎血管,切除左外葉;假手術(shù)組不作門靜脈部分結(jié)扎,其余與左支結(jié)扎組相同,測(cè)壓后關(guān)腹。

    1.2.3 觀察指標(biāo)及方法

    (1)觀察大鼠術(shù)后是否蘇醒及存活。

    (2)門靜脈測(cè)壓:取回腸系膜較平直靜脈,用充滿肝素鹽水的24G套管針穿刺,穿刺針置于腸系膜血管主干或一級(jí)屬支內(nèi),通過(guò)壓力傳感器鏈接BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)以讀取各組大鼠門靜脈壓力。術(shù)后15 d及30 d所有實(shí)驗(yàn)大鼠均按上述相同方法測(cè)量門靜脈壓力。

    (3)術(shù)后30 d處死所有大鼠,用真空采血管收集大鼠門靜脈血液并剪取肝左、右葉部分組織,用NO試劑盒測(cè)量各組NO含量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活情況

    所有大鼠均于術(shù)后24 h內(nèi)蘇醒。術(shù)后第2天,門靜脈主干結(jié)扎組因門靜脈淤血死亡大鼠1只,余均順利存活。術(shù)后30 d,存活大鼠體重282~302 g,平均體重289 g。

    2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)門靜脈壓力情況

    (1)左支結(jié)扎三組大鼠術(shù)后即刻、術(shù)后15 d、術(shù)后30 d門靜脈壓力較各自術(shù)前及同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組均明顯升高(P<0.05),且針直徑越小,其術(shù)后壓力越高。

    (2)主干0.9 mm組大鼠術(shù)后即刻、術(shù)后15 d、術(shù)后30 d門靜脈壓力較各自術(shù)前及同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組均明顯升高(P<0.05);左外葉切除組術(shù)后即刻、術(shù)后15 d門脈壓力較術(shù)前及同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組高(P<0.05),但術(shù)后30 d二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;假手術(shù)組大鼠門靜脈壓力隨時(shí)間推移無(wú)明顯變化。

    (3)左支結(jié)扎三組大鼠術(shù)后即刻、術(shù)后15 d門靜脈壓力低于主干0.9 mm組;至術(shù)后30 d左支0.7、0.8 mm組門靜脈壓力低于主干0.9 mm組,但左支0.6 mm組門靜脈壓力與主干0.9 mm組差異無(wú)顯著性表達(dá)[(16.82±2.16)cm H2O vs(18.74±3.20)cm H2O,P>0.05)]。

    2.3 組織及血液NO含量

    對(duì)六組SD大鼠肝左、右葉組織及血液中NO含量進(jìn)行比較,各組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

    表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)門脈壓力(cm H 2O)Table 1 Portal vein pressure of SD rats at different time of six groups(cm H2O)

    表2 SD大鼠肝左右葉及血液NO含量(μmol/L)Table 2 NO concentration of SD rats in blood,left and right lobes of liver tissue(μmol/L)

    3 討論

    雖然門靜脈主干結(jié)扎法制備大鼠門脈高壓動(dòng)物模型目前在國(guó)內(nèi)外已得到廣泛應(yīng)用,但其術(shù)后死亡率仍然較高,可達(dá)到20%甚至更高[8]。本研究亦有一只大鼠死亡。分析原因,主要為門靜脈血液回流不暢,胃腸道及脾大量淤血,腸管紫紺壞死,且易出現(xiàn)大量腹水,容易導(dǎo)致大鼠死亡。而單純門脈左支結(jié)扎大鼠并不會(huì)出現(xiàn)以上情況,因?yàn)閱渭冮T脈左支結(jié)扎,門靜脈右支保持暢通,胃腸道及脾靜脈無(wú)嚴(yán)重淤血,腸管不會(huì)缺氧壞死,故其術(shù)后死亡率低。SD大鼠肝分為左外葉、左中葉、右葉、尾狀葉和二乳突葉,左肝約占全肝重量的70%,而門靜脈占肝大約75%血液供應(yīng),故單純門靜脈左支結(jié)扎即可嚴(yán)重影響肝血液供應(yīng)。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)單純門靜脈左支部分結(jié)扎能否制備門脈高壓動(dòng)物模型研究較少。

    本研究顯示,六組SD大鼠結(jié)扎前門靜脈壓力約為10.37 cm,與文獻(xiàn)中正常SD大鼠門靜脈壓力值大致相同[9],單純門靜脈左支結(jié)扎的SD大鼠,其術(shù)后門靜脈壓力較術(shù)前及對(duì)照組均明顯升高,且至術(shù)后30 d 0.6 mm針結(jié)扎門脈左支的大鼠與門脈主干部分結(jié)扎的大鼠其門靜脈壓力差異無(wú)顯著性表達(dá)[(16.82±2.16)cm H2O vs(18.74±3.20)cm H2O,P>0.05)],所以單純門脈左支部分結(jié)扎也可取得較好的門脈高壓模型。

    國(guó)內(nèi)外研究顯示,對(duì)于體重250~300 g的雄性SD大鼠,結(jié)扎門靜脈主干最合適的是20G直針(即相當(dāng)于9號(hào)針,直徑0.9 mm)[7,10],既能保證動(dòng)物較低的死亡率,又能最大限度的提升門靜脈的壓力。但對(duì)于門脈左支部分結(jié)扎的合適口徑,國(guó)內(nèi)外并無(wú)報(bào)道。由于門靜脈分為左右兩支,因此在實(shí)驗(yàn)中我們分別應(yīng)用更細(xì)的0.6、0.7、0.8 mm針對(duì)門靜脈左支進(jìn)行結(jié)扎,三組大鼠術(shù)后即刻、術(shù)后15 d及術(shù)后30 d門脈壓力均較術(shù)前明顯增高,其中利用直徑0.6 mm針結(jié)扎左支SD大鼠其術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)門靜脈壓力均為最高,且在術(shù)后30 d其與主干結(jié)扎大鼠門靜脈壓力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,因此使用直徑0.6 mm針對(duì)門靜脈左支進(jìn)行部分結(jié)扎即可取得較好效果。因?yàn)榇笫箝T靜脈左支供應(yīng)左外葉、左中葉,而這其中左外葉占據(jù)大部分,所以切除左外葉可有效減少門靜脈左支的血液供應(yīng)。而肝切除后是否伴隨著門靜脈壓力的增高,仍存在著爭(zhēng)議。本研究發(fā)現(xiàn),肝左外葉切除后,門靜脈壓力立即上升,隨著時(shí)間推移,肝左葉切除組門脈壓力穩(wěn)步下降,至術(shù)后1個(gè)月其與對(duì)照組已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這提示我們僅僅減少肝左葉血供并不能形成穩(wěn)定門脈高壓模型;而門脈左支部分結(jié)扎則能形成較為穩(wěn)定的門脈高壓模型,由此分析,有可能是門脈左支狹窄導(dǎo)致相關(guān)因子產(chǎn)生或增減,維持了門脈高壓的狀態(tài),因此我們進(jìn)一步研究了NO在其中是否起到相應(yīng)作用。

    之前有研究顯示,蛋白C、蛋白S、抗凝血酶Ⅲ降低與肝外型門脈高壓相關(guān)[11-12]。而在肝內(nèi)型門脈高壓,NO與肝血管收縮、舒張功能失調(diào)及新生血管生成密切相關(guān)[3,4,13]。肝硬化時(shí)肝內(nèi)NO合成減少,導(dǎo)致肝內(nèi)血管阻力增加,門脈壓力升高;與此同時(shí),外周循環(huán)NO合成增多,使內(nèi)臟血管擴(kuò)張、血流量增多,進(jìn)一步促使門靜脈高壓形成[5,14]。

    本研究發(fā)現(xiàn),術(shù)后30 d各組SD大鼠肝內(nèi)及血液內(nèi)NO含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示我們,肝外型門脈高壓與肝內(nèi)型門脈高壓發(fā)生原理并不相同,在肝外型門脈高壓中NO可能并沒(méi)有起到關(guān)鍵作用。而最近有研究提示,對(duì)門脈結(jié)扎的SD大鼠使用促NO產(chǎn)生的生物制劑并不能有效降低門脈壓力,而對(duì)肝硬化的SD大鼠使用促NO產(chǎn)生的生物制劑則能有效降低門脈壓力[15-16]。這與我們研究相符。

    但限于本研究時(shí)間較短,對(duì)術(shù)后長(zhǎng)期門脈壓力及其影響因素研究較少。希望以后有更大樣本、更長(zhǎng)時(shí)間的類似研究。

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