冠心病氣虛血瘀證病證結(jié)合大鼠模型的建立研究

王瑾茜藺曉源劉侃胡國恒?

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué),長沙 410208)

冠心病(coronary artery heart disease,CHD)是指因冠狀動脈阻塞等原因?qū)е滦呐K的血液灌注減少,從而引起心肌缺血缺氧、能量代謝失常的心血管疾病[1-2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)最新報道,因心血管疾病引發(fā)的死亡率占全球死亡的人數(shù)30%[3],嚴(yán)重影響了人類的健康。CHD在中醫(yī)學(xué)歸屬“胸痹”“心痛”“真心痛”范疇,其中氣虛血瘀證為胸痹最常見證型[4]。自2014年劉建勛等[5-6]提出“病證結(jié)合動物模型擬臨床研究”概念后,CHD氣虛血瘀證動物模型的研究已獲得一定的進(jìn)展。本研究中,主要對比現(xiàn)有的CHD氣虛血瘀證病理模型、病因模型以及病理病因復(fù)合模型,通過分析各模型舌色RGB值、舌尖絲狀乳頭各層高度和固有層微血管數(shù)量,并且分析前列環(huán)素(prostacyclin,PGI2)、血栓素A2(thromboxaneA2,TXA2)在絲狀乳頭固有層表達(dá)情況,以期為CHD氣虛血瘀證病證結(jié)合模型研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

16周齡SPF級健康雄性SD大鼠32只,體重(280±20)g,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK(湘)2016-0003】。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物房【SYXK(湘)2015-0003】。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件為:18～21℃,濕度保持40%～70%,環(huán)境空氣控制為每分鐘10次換氣;保持每天12 h光照和12 h黑暗環(huán)境。本文涉及的實(shí)驗(yàn)動物,均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會監(jiān)管和批準(zhǔn)實(shí)施(審批號:IACUC 2018659C)。

1.1.2 試劑與儀器

Tris(金克隆,T1503),辣根酶(博爾西,P105524),DAB顯色液(Sigma,ab18799),PGI2免疫組化測定試劑盒(賽默飛,E21390),TXA2免疫組化測定試劑盒(賽默飛,B10710),Harris蘇木素(中杉金橋,ZLI-9610),伊紅(中杉金橋,ZLI-9660)。

Casmatch標(biāo)準(zhǔn)色卡(X-Rite,美國),NikonZ50(尼康,日本),光學(xué)顯微鏡(尼康,Nikon Eclipse E100,日本),TP-2200B型電子天平(湘儀,長沙),光學(xué)顯微鏡(Leica,德國),RM2125RTS型手動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Leica,德國),BOND-MAX型全自動免疫組化染色機(jī)(Leica,德國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn),根據(jù)體質(zhì)量按完全隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組:空白組(K組)、病理組(L組)、病因組(Y組)和復(fù)合因素組(F組),每組8只。除K組大鼠正常飼養(yǎng)外,各模型組大鼠造模方式如下:

(1)Y組[7]以中醫(yī)“勞則氣耗”、“饑則氣損”為病因,于正式實(shí)驗(yàn)第1天進(jìn)行力竭游泳造模,每次以大鼠沉入水中10 s,以頭不能露出水平面為準(zhǔn)。頻率為每天1次,游泳后撈出實(shí)驗(yàn)大鼠,不予保溫措施及擦拭水跡,關(guān)閉門窗任其暴露于空氣中自然晾干。力竭游泳造模同時開始控制攝食量,大鼠每日攝入正常食量的1/2的飼料,連續(xù)21 d。

(2)L組[8]于正式實(shí)驗(yàn)第1～21天正常飼養(yǎng),正式實(shí)驗(yàn)第22天制備病理模型:左前胸去毛,順肋間隙方向于胸骨左旁第3～4肋間切開皮膚長約1 cm,切開心包,在左心耳前下方用1根零號醫(yī)用縫合線結(jié)扎血管縫針,記錄標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖。以心電圖ST段弓背向上太高的改變及左室前壁向外膨脹發(fā)紺、搏動減弱為結(jié)扎成功標(biāo)志。術(shù)后腹腔注射青霉素每只8萬U×3 d以抗感染。

(3)F組[9-11]于正式實(shí)驗(yàn)第1天時進(jìn)行力竭游泳造模,造模方式同Y組,第22天開始復(fù)合病理模型,造模方式同L組。

造模結(jié)束后,各組大鼠恢復(fù)正常飲食、作息,期間不采用任何造模手段,以第25天上午8:00為統(tǒng)一觀察、取材時間點(diǎn)。

1.2.2 舌色RGB值

于第25天上午8:00將各組麻醉后,置于手術(shù)臺。用手術(shù)鑷輕拉暴露整個舌面,照明條件參照國際照明委員會推薦照明標(biāo)準(zhǔn),拍照距離設(shè)定為1500～2000勒克斯,拍攝模式設(shè)定為手動擋,自動對焦,光圈F8,關(guān)閉閃光燈,Casmatch標(biāo)準(zhǔn)色卡與舌面平行[12-13]。舌象色度分析采用Photoshop 6.0軟件,參照Casmatch標(biāo)準(zhǔn)色卡說明書,設(shè)定色階,黑色為L:22、a:0、b:0,灰色為L:58、a:0、b:0,白色為L:93、a:0、b:0。分析具體圖片時,將黑、白、灰色階值設(shè)置為圖片標(biāo)準(zhǔn)色卡中的黑、白、灰色階值。選擇套圈工具,劃定舌體范圍(從舌尖到舌體中部),利用Photoshop 6.0軟件中“直方圖”工具,計算該區(qū)域的R(紅色)、G(綠色)、B(藍(lán)色)分量值,以表1作為辨別舌質(zhì)依據(jù)[14]。

表1 RGB值數(shù)據(jù)分布范圍表Table 1 RGB value data distribution range

1.2.3 HE染色觀察舌尖絲狀乳頭各層高度與固有層毛細(xì)血管數(shù)量

拍照后立即取舌尖組織,直徑約0.3 cm左右,投入預(yù)先配好的4%多聚甲醛中固定,以不同濃度的乙醇脫水,浸蠟,包埋,切成5μm厚薄片脫蠟,轉(zhuǎn)染,蘇木精,伊紅染液染色5 min。在熒光顯微鏡高倍(×以樹膠)視野下拍攝,并測算其角化層、固有層、上皮層高度,并統(tǒng)計固有層的毛細(xì)血管數(shù)量。具體實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[15]。

1.2.4 免疫組化觀察舌尖組織TXA2、PGI2表達(dá)水平

石蠟切片脫蠟至水后,3%H2O2室溫下孵育10 min,封閉非特異性抗原,滴加新配制的一抗TXA2、PGI2(1∶200稀釋),4℃孵育過夜,洗滌后滴加辣根酶工作液,37℃恒溫箱孵育30 min,洗滌后DAB顯色3 min;復(fù)染,脫水,透明,封片。具體實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[15]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),根據(jù)不同的數(shù)據(jù)特點(diǎn)采用不同的檢驗(yàn)法:計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組比較,如果滿足正態(tài)及方差齊性,采用成組t檢驗(yàn),不滿足者采用秩和檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舌色RGB值

K組舌質(zhì)辨別歸屬“淡紅舌”,與K組大鼠比較,L組大鼠舌面R值下降且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),G值下降、B值上升但均不具有統(tǒng)計學(xué)意義,舌質(zhì)辨別歸屬“暗紅舌”;Y組大鼠舌面G、B值上升但均不具有統(tǒng)計學(xué)意義,R值下降且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),舌質(zhì)辨別歸屬“淡白舌”;F組大鼠舌面R、G、B值下降且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),舌質(zhì)辨別歸屬“紫舌”。與L組大鼠比較,Y組大鼠舌面R值下降,但差異未見統(tǒng)計學(xué)意義;F組大鼠舌面R、G、B值均下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)(見圖1)。

圖1 各組大鼠舌色RGB值測定Note.A,Picture of RGB determination of tongue color of rats in each group.B,Compared with Group K,▲P<0.05,▲▲P<0.01.Figure 1 Determination of RGB value of tongue color in each group of rats

圖2 各組大鼠絲狀乳頭形態(tài)與各層高度、毛細(xì)血管數(shù)量Note.A,Histological structure of filiform papilla in each group(HE staining,×400).B/C,Compared with Group K,▲▲P<0.01.Figure 2 Shape and height of each layer of rat’s filamentous papilla and the number of capillaries in each group

2.2 舌面絲狀乳頭各層高度、固有層毛細(xì)血管數(shù)量比較

與K組大鼠比較,L組大鼠舌面絲狀乳頭的角化層、固有層、上皮層高度降低,微血管數(shù)量增高,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;Y組大鼠舌面角化層高度降低且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),上皮層高度降低,固有層高度升高、微血管數(shù)量增高但均不具備統(tǒng)計學(xué)意義;F組大鼠舌面角化層、上皮層高度均降低、固有層微血管數(shù)量增高(P<0.01),固有層高度下降但不具備統(tǒng)計學(xué)意義。與L組大鼠比較,Y組大鼠舌面絲狀乳頭的角化層、上皮層高度降低,固有層高度增高、微血管數(shù)量降低但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;F組與L組比較,舌面絲狀乳頭的角化層、上皮層高度降低、固有層微血管數(shù)量增加(P<0.01),固有層高度差異不具備統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2)。

2.3 免疫組化觀察舌尖組織TXA 2、PGI2表達(dá)水平

與K組比較,L組、Y組、F組PGI2水平均下降、TXA2水平均上升,其中僅L組、F組TXA2水平與K組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05);L組、F組T/P值均升高且與K組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。與L組比較,Y組PGI2、TXA2和T/P值較低,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;F組與L組比較PGI2水平較低但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),TXA2、T/P比值較高且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

圖3 各組大鼠舌尖組織TXA2、PGI2蛋白表達(dá)(A)、T/P比值(B)和TXA2、PGI2表達(dá)光鏡圖(C、D)Note.A/B,Group F compared with Group K,▲▲P<0.01.C/D,Protein expression results of TXA/PGI2(HE staining).Figure 3 Expression of TXA2 and PGI2 proteins in the tongue tip tissues of rats in each group(A),T/P ratio(B)and the light microscopy images of TXA2and PGI2expressions(C,D)

3 討論

CHD在我國發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,目前主要藥物治療為口服阿司匹林和硝酸酯類藥物以抗血小板聚集,但長期服用導(dǎo)致消化道出血癥狀及過敏反應(yīng)等副作用[16]。CHD氣虛血瘀證一直是中醫(yī)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣虛血瘀是CHD的主要病機(jī),氣虛則無力推動血液運(yùn)行,血液凝滯成瘀,阻于心脈,則心前區(qū)憋悶疼痛[17]。并認(rèn)為舌與心關(guān)系密切,心開竅于舌,心功能正常則舌體紅潤柔軟,形色正常[18]。通過觀察對比3種常見CHD氣虛血瘀證病證結(jié)合大鼠單純病理、病因及復(fù)合因素造模方式下舌色RGB值、舌尖絲狀乳頭病理形態(tài)學(xué)變化以及TXA2、PGI2水平表達(dá),探討各模型舌象的特點(diǎn),為CHD氣虛血瘀證動物模型研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

RGB值是一種國際公認(rèn)的比色標(biāo)準(zhǔn),在統(tǒng)一的照明標(biāo)準(zhǔn)、拍照距離、相機(jī)參數(shù)下,運(yùn)用Photoshop 6.0軟件計算出紅色(R)、綠色(G)、藍(lán)色(B)值可以更加客觀化、數(shù)字化比較各組模型的舌體顏色變化。翁維良教授運(yùn)用“中醫(yī)舌診專家系統(tǒng)”將各類舌質(zhì)舌苔記錄出不同的RGB值,還證明了RGB值不僅與舌苔顏色有關(guān),還與舌苔厚薄等變化明顯相關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)與K組大鼠比較,L組大鼠舌面R值下降且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Y組大鼠舌面R值下降且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);F組大鼠舌面R、G、B值下降且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本研究運(yùn)用伍喜良課題組“舌質(zhì)RGB數(shù)據(jù)分布范圍表”發(fā)現(xiàn),L組大鼠舌色歸屬于“暗紅舌”、Y組大鼠舌色歸屬于“淡白舌”,而F組大鼠舌色歸屬于“紫舌”。參照2002年版《中藥、天然藥物治療冠心病心絞痛的臨床研究指導(dǎo)原則》筆者發(fā)現(xiàn),L組符合“CHD血瘀證之暗紅舌”、Y組符合“CHD氣虛證之淡白舌”,而僅F組舌象與“CHD氣虛血瘀證之舌淡紫”相吻合。RGB值反映L組模型更傾向于CHD血瘀證舌色,Y組模型更傾向于CHD氣虛證舌色,病證結(jié)合模型相比其他兩個模型組而言,更契合CHD氣虛血瘀證舌色特征。

吳敏教授通過舌部熱象圖將舌劃分為五個區(qū)域,分別對應(yīng)中醫(yī)藏象心(舌尖)、脾胃(舌中)、肝膽(舌左、右邊)、腎(舌根)[20]。有研究報道絲狀乳頭遍布于舌體前2/3,是形成舌苔的一個重要的因素[21]。據(jù)此本研究推測CHD氣虛血瘀舌象可能是由舌尖絲狀乳頭高度降低、微血管數(shù)量增高所致的外在觀象。我們通過HE染色觀察三種模型絲狀乳頭上皮層、角化層和固有層以及固有層的毛細(xì)血管數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對比L組與K組,F組大鼠舌面絲狀乳頭的角化層、上皮層高度降低、固有層微血管數(shù)量增加(P<0.05),但各組絲狀乳頭固有層高度均無差異(P>0.05)。提示舌尖絲狀乳頭的病理改變與舌尖RGB數(shù)值改變存在一定關(guān)系,RGB數(shù)值相應(yīng)的微觀病理學(xué)改變主要體現(xiàn)在絲狀乳頭上皮層尤其是角化層高度以及固有層微血管數(shù)量的變化上,與固有層關(guān)系不大。且CHD氣虛血瘀證舌象特征與舌面絲狀乳頭的角化層、上皮層高度降低、固有層微血管數(shù)量增加有關(guān)。

PGI2是花生四烯酸的一種衍生物,是血小板凝集作用的一種抑制劑。TXA2是由血小板微粒體合成并釋放的一種具有強(qiáng)烈促進(jìn)血管收縮和血小板聚集的生物活性物質(zhì)[22]。正常情況下血液中TXA2和PGI2含量保持相對平衡的狀態(tài),可以防止聚集效應(yīng),使血管擴(kuò)張,保持血管通暢。研究表明中醫(yī)學(xué)中“氣虛”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中PGI2合成減少、“血瘀”與TXA2增加有關(guān)[23-24]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們對舌尖組織PGI2、TXA2水平進(jìn)行免疫組化半定量分析發(fā)現(xiàn),與K組比較,3種模型的舌尖絲狀乳頭固有層PGI2水平均下降、TXA2水平均上升,僅L組和F組TXA2水平變化明顯(P<0.05,P<0.01),綜合RGB值結(jié)果,推測血瘀證、氣虛血瘀證形成與TXA2存在密切關(guān)聯(lián);L組、Y組、F組PGI2變化均不大,其原因考慮機(jī)體存在代償性增加現(xiàn)象,由此得出T/P比例比單一指標(biāo)更可靠;L組、F組T/P比值均升高(P<0.05,P<0.01),說明病證結(jié)合模型和疾病模型皆可導(dǎo)致機(jī)體血瘀證相關(guān)指標(biāo)變化,而相較于單純疾病模型,病證結(jié)合模型T/P比值變化更明顯,說明氣虛可在血瘀過程中引起血瘀嚴(yán)重化,進(jìn)一步說明病理病因復(fù)合因素模型相較于單純病理模型和病因模型而言更具氣虛血瘀的特點(diǎn)。

綜上所述,本研究通過對比病理、病因、病理病因復(fù)合3種常用的CHD氣虛血瘀證動物模型造模方式舌象客觀化研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純病理模型和單純病因造模方式無法達(dá)到CHD氣虛血瘀證舌象特點(diǎn),僅F組符合CHD氣虛血瘀證“淡紫舌”的特點(diǎn)。此外,F組乳頭層、角化層、上皮層高度均下降、微血管數(shù)量均增高,T/P比值均有明顯改變,說明CHD氣虛血瘀證舌色RGB值變化與絲狀乳頭上皮層、角化層高度降低,固有層毛細(xì)血管數(shù)量增加有關(guān),其分子學(xué)機(jī)制可能與TXA2/PGI2失調(diào)有關(guān),但TXA2/PGI2失調(diào)是否為CHD氣虛血瘀的主導(dǎo)性分子生物學(xué)指標(biāo)有待深入研究。