IDO抑制劑PCC0208009在結腸癌CT26荷瘤小鼠的PK/PD研究

姜 雪,李曉鵬,鄭 爽,王洪波,田京偉,杜廣營

(煙臺大學藥學院分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室,煙臺大學新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺 264005)

免疫耐受是腫瘤發(fā)生與進展的主要原因,也是影響腫瘤臨床治療效果的重要阻礙因素．通過逆轉腫瘤免疫耐受,激活機體自身免疫系統(tǒng)清除殺傷腫瘤細胞的免疫治療已經(jīng)成為一種成熟的腫瘤治療手段[1]．已有6個免疫檢查點類藥物被FDA批準上市,用于多種腫瘤如非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色素瘤等的一線或二線治療[2]．吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO, EC 1.13.11.42)是肝臟外唯一催化色氨酸(Tryptophan, Trp)沿犬尿氨酸(Kynurenine, Kyn)途徑分解代謝的限速酶[3]．近年研究發(fā)現(xiàn)IDO與腫瘤免疫耐受密切相關,可通過多種機制介導腫瘤細胞的免疫逃逸,如色氨酸耗竭抑制局部T細胞增殖,代謝產(chǎn)物誘導調(diào)節(jié)性T細胞增殖,色氨酸代謝產(chǎn)物促進T細胞凋亡等[4-5]．IDO在多種腫瘤微環(huán)境中高表達,表達水平與患者生存率呈負相關,是顯著的不良預后因子[3,6]．IDO抑制劑可逆轉IDO介導的免疫耐受,激活效應T細胞,改善腫瘤免疫微環(huán)境,協(xié)同增強其他藥物如免疫檢查點藥物和化療藥物的腫瘤殺傷抑制作用[7]．已上市的免疫檢查點類藥物臨床應答率低,只有20%～30%[8],這可能與IDO共表達或誘導IDO表達有關[9]．臨床試驗結果也顯示,抑制IDO能有效提升PD-1等免疫檢查點藥物的療效[10]．IDO是抗腫瘤免疫治療領域極具潛力的新靶點[3,6],開發(fā)IDO抑制劑是免疫檢查點藥物臨床應用的重要補充[11]．

PCC0208009是Bristol-Myers Squibb(BMS)公司專利WO2015/031295 A1中的示例1化合物,化學結構如圖1所示[12]．本實驗室前期研究結果表明,PCC0208009是一個高效的IDO小分子抑制劑,可顯著增強替莫唑胺在腦膠質(zhì)瘤荷瘤動物模型的抗腫瘤效應[13]．文獻資料顯示,血清中Kyn和Trp的含量比值Kyn/Trp,可以作為IDO抑制劑臨床前藥效作用評價的的生物標記物[14-15]．因此,本試驗在前期研究的基礎上,采用結腸癌CT26荷瘤小鼠模型,以Kyn/Trp變化為藥效學評價指標,考察PCC0208009在荷瘤小鼠的藥代動力學(pharmacokinetics, PK)和藥效動力學(Pharmacodynamics, PD)特點及二者的相關性,為后續(xù)IDO抑制劑的開發(fā)和臨床治療效果的預測提供參考依據(jù)．

圖1 PCC0208009的化學結構式[12]

1 實驗材料

1.1 細胞株與實驗動物

小鼠結腸癌細胞CT26.WT,由中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫提供,使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和10 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37 ℃,5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng),隔天進行細胞換液,每2到3 d進行細胞傳代,傳代比例為1∶2～1∶5．

實驗用BALB/c小鼠,雄性,體重21～23 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2014-0004．實驗動物飼養(yǎng)于SPF級(無特定病原體)環(huán)境中,溫度為20±2 ℃,相對濕度為30%～70%,人工光照,晝夜12 h交替．所有實驗動物相關的實驗方案與操作均經(jīng)過煙臺大學實驗動物倫理委員會審核及批準．

1.2 供試品與主要試劑

PCC0208009,白色粉末,難溶于水,購自上海瀚香生物科技有限公司,HPLC鑒定純度大于99.5%,分子式為C29H35N7O,相對分子質(zhì)量487.63．PCC0208009溶液配制:先加入適量預先配置的溶媒20% Kolliphor?HS 15(Solutol),50 ℃超聲至溶液澄清,再用20% Solutol定容至所需體積,配制成不同濃度的藥物．Matrigel?基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences公司．

2 實驗方法

2.1 CT26荷瘤小鼠制備

收集對數(shù)生長期的CT26結腸癌細胞,重懸于無血清培養(yǎng)基中,調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL,制備好的細胞懸液與Matrigel基質(zhì)膠等體積混合,細胞終濃度為5×105個/mL．超凈工作臺中,于每只小鼠背部肩胛處皮下接種0.2 mL腫瘤細胞懸液,接種量為1×105個/只．待瘤塊長至500～1000 mm3時,剝出瘤塊,無菌手術剪刀剪碎,用皮埋植入穿刺針(直徑1.2 mm)再次接種至小鼠背部肩胛處皮下,制備CT26小鼠移植瘤模型．游標卡尺測量腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b),根據(jù)公式V=0.5×a×b2計算腫瘤體積,當腫瘤體積大于300 mm3時,動物分組,用于試驗．

2.2 劑量設計

本實驗室前期CT26荷瘤小鼠模型藥效研究顯示,PCC0208009在25～200 mg/kg范圍內(nèi)可劑量依賴性抑制移植瘤的生長,200 mg/kg劑量下,腫瘤生長抑制率已基本達到最大藥效水平．因此,在時間效應關系的PK/PD研究中,PCC0208009的劑量設為200 mg/kg,單次灌胃給藥后在不同時間點檢測腫瘤和血漿中PCC0208009,Kyn和Trp的含量．在劑量效應關系的PK/PD研究中,PCC0208009的劑量設為25、50、100、200、400 mg/kg,單次或多次灌胃給藥后4 h,檢測腫瘤和血漿中PCC0208009、Kyn和Trp的含量．

2.3 時間效應關系PK/PD研究

荷瘤小鼠根據(jù)腫瘤體積隨機分成給藥前0 h對照組及給藥后不同時間點組,每組5只動物．對照組直接采血及瘤塊,給藥后5 min(0.083 h)、15 min(0.25 h)、30 min(0.5 h)、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h組,分別單次灌胃給予200 mg/kg的PCC0208009,給藥體積0.1 mL/10 g,并按時間點采血及瘤塊．通過眼眶采血0.5～0.8 mL,肝素抗凝．取血后,小鼠以脫頸椎實施安樂死,手術剝?nèi)⊥暾鰤K．

所得抗凝血在4000 r/min離心條件下,離心10 min,并分離得到血漿．采用LC-MS/MS方法,檢測瘤塊和血漿中PCC0208009,Kyn和Trp含量,并計算主要藥代參數(shù)和Kyn/Trp．血漿樣品檢測中,取50 μL小鼠血漿樣品,采用HLB小柱進行固相萃取后用已建立并驗證的LC-MS/MS替代分析物(Kyn-d4和Trp-d5)法進行Kyn和Trp濃度測定;腫瘤樣品檢測中,腫瘤組織用1∶4體積的純凈水分散后進行高速勻漿約30 s,取50 μL組織勻漿液,采用HLB小柱進行固相萃取后用已建立并驗證的LC-MS/MS替代分析物(Kyn-d4和Trp-d5)法進行Kyn和Trp濃度測定[16-17]．

2.4 劑量效應關系PK/PD研究

劑量效應關系PK/PD研究可分為2個部分:單次給藥試驗和多次給藥試驗．單次給藥或多次給藥實驗中,荷瘤小鼠均根據(jù)腫瘤體積,隨機分為6組:對照組,25、50、100、200、400 mg/kg PCC0208009給藥組,每組各5只動物．單次給藥試驗中,小鼠分別單次灌胃給予20% Solutol和相應不同劑量的PCC0208009,給藥體積0.1 mL/10 g,給藥后4 h,采集血漿和腫瘤組織,LC-MS/MS法檢測PCC0208009,Kyn和Trp含量,并計算Kyn/Trp．多次給藥試驗中,小鼠分別灌胃給予20% Solutol和相應不同劑量的PCC0208009,每天2次,連續(xù)3 d,給藥體積0.1 mL/10 g,給藥后4 h,采集血漿和腫瘤組織,LC-MS/MS法檢測PCC0208009,Kyn和Trp含量,并計算Kyn/Trp．

2.5 統(tǒng)計學方法

3 實驗結果

3.1 時間效應關系PK/PD研究

單次灌胃給予200 mg/kg的PCC0208009,檢測給藥后不同時間點血漿和腫瘤中PCC0208009的濃度,計算主要藥代參數(shù)．藥時曲線圖見圖2(a)．血漿和腫瘤中Tmax分別為0.25 h和0.5 h,達峰濃度Cmax分別為13.3 μg/mL和3.86 μg/g,PCC0208009灌胃給藥后入血較快,在0.25 h時濃度為13.3 μg/mL,隨后血漿中藥物濃度快速下降,至24 h時低于檢測下限;腫瘤中藥物濃度緩慢下降,至24 h時仍可檢測到藥物．血漿和腫瘤中藥時曲線下面積AUC0-t分別為22.9 μg·h/mL和17.5 h·μg/g,半衰期T1/2分別為6.22 h和7.08 h,血漿中藥物平均滯留時間MRT0-t為2.84 h．

單次灌胃給予200 mg/kg的PCC0208009, 血漿和腫瘤中的Kyn/Trp變化見圖2(b)．血漿中,Kyn/Trp在給藥后2 h開始顯著低于給藥前,這種抑制作用可持續(xù)至給藥后24 h(各時間點P<0.05);腫瘤中,給藥后2～8 h,Kyn/Trp顯著低于給藥前(P<0.05)．血漿和腫瘤中Kyn/Trp的最大抑制率分別為46.7%和62.1%,均出現(xiàn)在給藥后8 h．單次灌胃給藥200 mg/kg后2～8 h內(nèi),PCC0208009可同時顯著降低Kyn/Trp,有效抑制血漿和腫瘤中IDO的活性．

和0 h對照組數(shù)據(jù)比較.

3.2 單次給藥劑量效應關系PK/PD研究

根據(jù)時間效應關系研究結果,荷瘤小鼠單次灌胃給予25～400 mg/kg PCC0208009,在給藥后4 h,檢測血漿和腫瘤中藥物濃度以及Kyn/Trp比值的變化．血漿和腫瘤中藥物濃度見圖3(a),在25～400 mg/kg劑量范圍內(nèi),血漿和腫瘤中藥物濃度均隨劑量的增大而增加,呈劑量依賴性．血漿和腫瘤中Kyn/Trp改變見圖3(b),血漿中,PCC0208009可劑量依賴性降低Kyn/Trp,各個劑量水平Kyn/Trp均顯著低于對照組(P<0.05);腫瘤中,PCC0208009也可劑量依賴性的降低Kyn/Trp,但25 mg/kg劑量下Kyn/Trp與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05),50～400 mg/kg各個劑量水平Kyn/Trp均顯著低于對照組(P<0.05)．血漿和腫瘤中,給藥劑量200 mg/kg時,實現(xiàn)對Kyn/Trp的半數(shù)抑制,給藥劑量為400 mg/kg時,對Kyn/Trp的抑制率無明顯升高,給藥劑量為200 mg/kg和400 mg/kg時,抑制率分別為47.0% vs 49.3% 和52.2% vs 51.0%．

3.3 多次給藥劑量效應關系PK/PD研究

荷瘤小鼠在多次灌胃給予25～400 mg/kg PCC0208009,給藥后4 h,檢測藥物濃度和Kyn/Trp比值變化．血漿和腫瘤中藥物濃度見圖4(a)．在25 ～400 mg/kg劑量范圍內(nèi),血漿和腫瘤中藥物濃度均隨劑量的增大而增加,呈劑量依賴性．血漿和腫瘤中Kyn/Trp改變見圖4(b)．血漿中,PCC0208009可劑量依賴性降低Kyn/Trp,各個劑量水平Kyn/Trp均顯著低于對照組(P<0.05);腫瘤中,PCC0208009也可劑量依賴性的降低Kyn/Trp,各個劑量水平Kyn/Trp均顯著低于對照組(P<0.05)．血漿和腫瘤中,200 mg/kg和400 mg/kg 劑量組的Kyn/Trp降低相當,抑制率分別為57.7% vs 61.5% 和72.0% vs 73.6%．

和對照組數(shù)據(jù)比較.

和對照組數(shù)據(jù)比較.

4 討 論

本實驗室前期對PCC0208009進行了部分體內(nèi)外活性研究,表明其是一個高效的IDO小分子抑制劑,可顯著增強替莫唑胺在腦膠質(zhì)瘤荷瘤動物模型的抗腫瘤效應[13]．本試驗是在前期研究的基礎上,進一步對其在荷瘤小鼠體內(nèi)的PK/PD行為特點進行探討．IDO抑制劑屬于腫瘤免疫增強藥物,大量文獻資料顯示其在荷瘤小鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用并不強,腫瘤抑制率約30%～50%[18],即采用腫瘤抑制率作為藥效指數(shù)對IDO抑制劑來說不敏感．前期研究和文獻報道提示,血清中Kyn和Trp的含量的比值Kyn/Trp可以作為評價IDO抑制劑的藥效作用的生物標記物．因此,本研究中采用Kyn/Trp的改變作為藥效指標進行PK/PD關系研究．

時間效應關系PK/PD研究結果表明,單次灌胃給藥后,PCC0208009快速在血漿中分布,Tmax為0.25 h,腫瘤組織中分布稍慢,Tmax為0.5 h,達峰后血漿中藥物濃度快速下降,而腫瘤中藥物濃度下降緩慢．給藥后2～8 h內(nèi),PCC0208009可顯著降低血漿和腫瘤內(nèi)的Kyn/Trp,抑制IDO的活性,血漿和腫瘤中Kyn/Trp的最大抑制率均出現(xiàn)在給藥后8 h．對比血漿和腫瘤中PCC0208009藥物濃度和Kyn/Trp抑制率,藥物發(fā)揮最大抑制活性時,藥物濃度并非最高,可知PCC0208009對IDO的抑制作用具有一定的滯后性,分析可能與采用的藥效指標Kyn和Trp是IDO酶活的間接作用結果有關．

根據(jù)時間效應關系研究結果,單次和多次給藥試驗中,在給藥4 h時,觀察不同藥物劑量下,PCC0208009的PK/PD相關性．結果均顯示,在25 ～400 mg/kg劑量范圍內(nèi),血漿和腫瘤中藥物濃度均隨劑量的增大而增加,呈劑量依賴性．PCC0208009也可劑量依賴性降低血漿和腫瘤中Kyn/Trp．多次給藥試驗中,25 mg/kg劑量下,血漿和腫瘤中Kyn/Trp均顯著低于對照組,可以認為25 mg/kg是PCC0208009在該模型的藥效起始劑量．無論單次給藥還是多次給藥,血漿和腫瘤中,200 mg/kg和400 mg/kg 劑量組的Kyn/Trp降低作用相當,即200 mg/kg 劑量下,PCC0208009已經(jīng)達到最大藥效水平,與前期荷瘤小鼠體內(nèi)藥效研究試驗結果一致,為后續(xù)IDO抑制劑的開發(fā)提供了參考依據(jù)．

5 結 論

IDO抑制劑PCC0208009在結腸癌CT26荷瘤小鼠體內(nèi)的PK/PD研究表明,在給藥后2～8 h內(nèi)PCC0208009可有效抑制血漿和腫瘤中Kyn/Trp,藥物在血漿和腫瘤中的濃度及對Kyn/Trp的抑制作用均呈劑量依賴性,PK和PD具有較好的相關性．本試驗條件下,PCC0208009的藥效起效劑量為25 mg/kg,200 mg/kg時已接近最大藥效平臺．本研究可為IDO抑制劑的開發(fā)以及預測IDO抑制劑的臨床治療效果提供理論基礎．