茶硝香酰胺聯(lián)合吉非替尼對人非小細胞肺癌遷移的影響

石曉玉,張 燕,孫彥莉,蓋 靜,劉 昆,張國營

(煙臺大學藥學院分子藥理實驗室,煙臺大學新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),山東 煙臺 264005)

根據(jù)2018年Global Cancer的調(diào)查,肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居首位[1]．其中非小細胞肺癌占肺癌的85%左右,患者5年生存率不到20%[2]．肺癌的治療方式以手術(shù)切除聯(lián)合放化療為主,以及靶向治療,免疫治療等[3-5]．吉非替尼作為表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKIs)代表藥而被廣泛應用[6-7],但同時也伴隨著耐藥[8]和毒副作用,加上肺癌極易轉(zhuǎn)移導致患者的預后差[9]．報道稱肺癌細胞容易通過發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT,epithelial-to-mesenchymal transition)提高其遷移能力．茶氨酸是具有抗焦慮、抗衰老、增強抗癌藥物的效用等諸多生理功能[10-13]的氨基酸，茶氨酸和其衍生物具有抗多種腫瘤的活性[14-15].前期實驗[16]可知茶硝香酰胺(TNC,圖1)屬于茶氨酸衍生物,并且可能是通過EGFR/VEGFR-Akt/NF-κB信號通路發(fā)揮抑制作用,但TNC對人非小細胞肺癌細胞的影響和其作用的分子機制及其臨床應用潛力尚不明了,本實驗擬通過考察TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞遷移能力的影響,分析是否顯著增強吉非替尼抑制A549細胞遠處轉(zhuǎn)移的潛力,結(jié)合前期實驗結(jié)果,通過設(shè)置Ly(PI3K/AKT通路抑制劑),Bay(NF-κB通路抑制劑)2組陽性對照,來探究兩者合用可能影響的信號通路,為TNC的進一步開發(fā)應用、解決如何有效抑制臨床非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的難題以及吉非替尼的毒副作用提供新方法新思路．

圖1 茶硝香酰胺化學結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 實驗材料

A549細胞系購于中國醫(yī)學科學院藥物研究所;本實驗室自主合成的茶硝香酰胺(TNC);Hyclone公司的DMEM高糖培養(yǎng)基;從Sigma公司購買的胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、表皮生長因子(EGF)以及肝細胞生長因子(HGF);購于碧云天公司的彩色預染蛋白Marker,ECL Star發(fā)光試劑盒,BCA蛋白濃度測定試劑盒,PI3K/AKT通路抑制劑Ly,NF-κB通路抑制劑Bay,結(jié)晶紫染色液;所用一抗和HRP標記二抗購于Santa Cruz Technology．

1.2 實驗儀器

細胞恒溫培養(yǎng)箱(3111型,美國Thermo公司);培養(yǎng)皿(美國BD公司);倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司 TE200-U型);小型濕轉(zhuǎn)電泳槽 (美國BIO-RAD公司);冷凍離心機(深圳市邁斯艾爾科技發(fā)展有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞常規(guī)培養(yǎng) 根據(jù)常規(guī)操作,將凍存細胞于溫水中快速融化,離心,加入完全培養(yǎng)液(含雙抗和10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)．細胞長至培養(yǎng)皿80%～90%時,胰蛋白酶消化,離心,傳代．

1.3.2 四甲基偶氮唑鹽法檢測TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞生長的影響 取狀況良好的A549細胞,調(diào)整濃度4×103個/孔均勻加至96孔板,24 h后加藥．配制TNC和吉非替尼至5個濃度,單獨以及交叉組合加藥,另外設(shè)陽性藥物Bay(NF-κB通路抑制劑)和Ly(PI3K/AKT通路抑制劑)組和對照組,每組設(shè)3個復孔．加藥培養(yǎng)24 h后,每孔加MTT孵育4 h后加DMSO溶液,15 min后于酶標儀570 nm處檢測吸光度A,以空白對照組吸光度為標準,計算細胞相對生長率:

相對生長率=(A加藥組/A對照組)×100%.

1.3.3 細胞劃痕法檢測TNC與吉非替尼聯(lián)合使用前后對A549細胞遷移的影響 取狀態(tài)良好的A549細胞,以7×105/皿的細胞濃度接種在6孔板中．培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)液,洗滌,用無菌槍頭勻速劃線．再次洗滌后于倒置熒光顯微鏡下拍照,記為0 h．根據(jù)預實驗,分別設(shè)置對照組,吉非替尼組(25 μmol/L),TNC組(125 μmol/L),聯(lián)合組(25 μmol/L 吉非替尼+125 μmol/L TNC)和陽性對照組Ly(25 μmol/L)、Bay(3 μmol/L)．每組使用含2%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后定點拍照,使用ImageJ軟件計算照片中的劃痕面積,計算細胞相對遷移率:

細胞相對遷移率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%．

1.3.4 Transwell檢測TNC聯(lián)合吉非替尼對發(fā)生EMT的A549細胞遷移能力的影響 參考文獻[19-22],用EGF和HGF刺激A549細胞發(fā)生EMT,取狀況良好A549細胞接種于6孔板中,待細胞長至50%,饑餓24 h換成含EGF(20 ng/mL)和HGF(80 ng/mL)的2% FBS培養(yǎng)液,2 d換1次液．觀察細胞,每隔24 h拍照記錄細胞形態(tài)變化．誘導實驗成功后,參考文獻[23],將發(fā)生EMT的A549細胞和未刺激的A549細胞同時饑餓24 h后,調(diào)整濃度為2.5×105個/mL,加入小室的上室中,下室加完全培養(yǎng)基,誘導遷移．將發(fā)生EMT的A549細胞(EGF+HGF)視為模型組,在模型組中設(shè)置空白模型組,TNC+模型組,吉非替尼+模型組,TNC+吉非替尼+模型組,同時對于未進行EMT誘導實驗的A549細胞,設(shè)置相同組別以便觀察,另設(shè)陽性對照組PI3K/AKT通路抑制劑Ly(25 μmol/L)、NF-κB通路抑制劑Bay(3 μmol/L)．培養(yǎng)6 h后吸走上清,PBS清洗,甲醇固定,風干,用棉棒擦去沒有通過的細胞,加結(jié)晶紫染色15 min,于倒置熒光顯微鏡下隨機選擇5個視野拍照,計數(shù),記錄其遷移情況,計算細胞相對遷移率:

細胞相對遷移率=處理組遷移細胞數(shù)/空白對照組遷移細胞數(shù)×100%．

1.3.5 Western Blotting法檢測TNC與吉非替尼聯(lián)合對非小細胞肺癌A549細胞相關(guān)蛋白表達的影響 按照常規(guī)操作,提取上述各組A549細胞總蛋白,使用BCA試劑盒確定蛋白濃度后計算上樣體積分裝．每管加Loading Buffer后預處理蛋白,取出配制好的凝膠上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,使用15%脫脂牛奶封閉,2 h后洗脫牛奶后封閉一抗,過夜孵育．次日,TBST洗膜3次后,封二抗1 h后洗膜,使用ECL發(fā)光檢測儀器檢測捕捉條帶,使用Quantity One軟件掃描分析條帶灰度,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,檢測目的蛋白表達情況．

2 實驗結(jié)果

2.1 TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞生長的影響

由圖2可見,24 h時,較高濃度聯(lián)合方案中25 μmol/L吉非替尼和125 μmol/L TNC及125 μmol/L以下濃度的TNC對細胞生長的影響無統(tǒng)計學意義．

2.2 TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞遷移的影響

如圖3所示,由預實驗確定聯(lián)合濃度,與對照組相比,其他各組細胞遷移率的降低均有統(tǒng)計學意義(*P<0.05),24 h時25 μmol/L 吉非替尼組A549細胞相對遷移率為64.86%,125 μmol/L TNC組細胞相對遷移率為73.73%,與25 μmol/L吉非替尼聯(lián)合組細胞相對遷移率降低為51.26%,統(tǒng)計學分析結(jié)果表明:25 μmol/L 吉非替尼與125 μmol/L TNC聯(lián)合組對比吉非替尼單藥組,可增強對A549細胞遷移的抑制作用,有統(tǒng)計學意義,且其抑制程度與陽性對照組PI3K/AKT通路抑制劑Ly和NF-κB通路抑制劑Bay相近．

代表與單一TNC組相比,*P<0.05.

代表與對照組相比,**P<0.01, ***P<0.001;#代表與單藥組相比,###P<0.001.

2.3 EGF聯(lián)合HGF誘導A549發(fā)生EMT細胞形態(tài)變化

由圖4可知,EGF聯(lián)合HGF可誘導A549細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,細胞間隙變大,細胞由典型鋪路石狀變?yōu)殚L梭型,紡錘狀,提示EMT誘導實驗成功,由圖5可見TNC和吉非替尼可抑制EGF和HGF聯(lián)合誘導的EMT過程．

圖4 EGF聯(lián)合HGF刺激促進A549細胞發(fā)生EMT細胞形態(tài)變化

圖5 EMT誘導實驗中不同處理組A549細胞形態(tài)圖

2.4 TNC聯(lián)合吉非替尼對加速發(fā)生EMT的A549細胞遷移的抑制作用

從圖6可觀察到:在未刺激的A549組中,與對照組相比,TNC組和吉非替尼組遷移的細胞數(shù)量明顯減少,聯(lián)合用藥組遷移的細胞數(shù)較單藥組更少,細胞相對遷移率降低至42.71%;在EGF和HGF聯(lián)合刺激的模型組中,雙生長因子刺激模型組細胞相對遷移率提高至135.9%,TNC、吉非替尼、聯(lián)合用藥組細胞相對遷移率則顯著降低,分別降低至61.45%、74.13%和49.48%．陽性對照Ly和Bay也顯著抑制EGF和HGF聯(lián)合刺激的A549細胞EMT和遷移．

2.5 TNC聯(lián)合吉非替尼對A549細胞相關(guān)蛋白表達的影響

2.5.1 TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞HGF、c-MET表達的影響 如圖7所示,單獨使用TNC(125 μmol/L)、吉非替尼(25 μmol/L)以及兩者聯(lián)合可顯著下調(diào)肝細胞生長因子HGF,受體酪氨酸激酶c-MET蛋白表達水平．而且在模型組(EGF+HGF刺激組)中,上述蛋白變化情況相似,與單一處理組相比均有統(tǒng)計學意義．

2.5.2 TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞EGF、EGFR、K-Ras表達的影響 如圖8所示,單獨使用TNC、吉非替尼和兩者聯(lián)合可顯著下調(diào)EGF及其受體EGFR蛋白和K-Ras表達水平．而且在模型組(EGF+HGF)中,上述蛋白變化情況相似,與單一處理組相比均有統(tǒng)計學意義．

代表與空白對照組相比,***P<0.001,&代表與各單藥組相比,&P<0.05;#代表與模型組相比,

2.5.3 TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞AKT蛋白表達的影響 如圖9所示,未使用EGF+HGF刺激組中,聯(lián)合組的AKT蛋白下調(diào)至49.43%;使用EGF+HGF刺激組中,聯(lián)合組AKT蛋白表達量低至45.55%,與此同時,陽性對照Ly組使其下調(diào)至30.59%．雖然TNC和吉非替尼單獨作用均可顯著減少AKT蛋白的表達,但聯(lián)合用藥組抑制作用更顯著．

2.5.4 TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞NF-κB蛋白表達的影響 如圖10所示,在模型組和正常組中,TNC、吉非替尼、TNC+吉非替尼均顯著下調(diào)NF-κB蛋白表達水平,其聯(lián)合用藥組(TNC+吉非替尼、模型+TNC+吉非替尼)與對應的對照組相比,NF-κB蛋白表達下降程度較單藥組顯著增強,分別降低了52.75%和49.46%,Ly組下調(diào)了56.33%,兩者影響程度無統(tǒng)計學意義．

代表與空白對照組相比,**P<0.001,***P<0.001;&代表與各單藥組相比,&P<0.001;#代表與模型組相比,#P<0.001;＄代表與模型組中的各單藥組相比,＄P<0.001.

代表與空白對照組相比,*P<0.005,***P<0.001;&代表與各單藥組相比,&P<0.05;#代表與模型組相比,P<0.001;＄代表與模型組中的各單藥組相比,#P<0.001.

代表與空白對照組相比,*P<0.005,***P<0.001;&代表與各單藥組相比,&P<0.005;#代表與模型組相比,##P<0.01;＄代表與模型組中的各單藥組相比,＄P<0.005.

代表與空白對照組相比,*P<0.005,**P<0.001,***P<0.001;&代表與各單藥組相比,&P<0.005;#代表與模型組相比,##P<0.01;＄代表與模型組中的各單藥組相比,＄P<0.005.

2.5.5 TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞E-Cadherin、Vimentin蛋白表達的影響 如圖11所示,在模型組和正常實驗組中,上皮細胞標志物E-Cadherin表達水平顯著性增加,波形蛋白Vimentin表達水平明顯降低,且聯(lián)合組的影響程度較單一藥物組更顯著,與陽性對照Ly影響程度幾乎持平．

代表與空白對照組相比,*P<0.05,**P<0.001,***P<0.001;&代表與各單藥組相比,&P<0.001;#代表與模型組相比,###P<0.001;＄代表與模型組中的各單藥組相比,＄P<0.005.

2.5.6 TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞N-Cadherin、Slug蛋白表達影響 如圖12所示,各用藥組均下調(diào)N-Cadherin、Slug的蛋白表達量,與同組別的單一用藥組相比,聯(lián)合組下調(diào)蛋白表達水平的能力顯著增強．

2.5.7 TNC與吉非替尼聯(lián)合使用對A549細胞ZEB、Twist、Snail蛋白表達影響 如圖13所示,在加速EMT的模型組和正常實驗組中,鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族ZEB、Twist和Snail表達水平明顯降低,且聯(lián)合組的影響程度較單一藥物組更顯著,陽性對照Ly也展示顯著性的抑制作用．

3 討論與結(jié)論

非小細胞肺癌占肺癌的80%,起初癥狀不明顯,一旦發(fā)現(xiàn)往往是中晚期．遠處轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的重要原因,而針對轉(zhuǎn)移性肺癌患者的有效治療方案很缺乏,術(shù)后生存率極低．吉非替尼作為代表性的表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKIs)類小分子靶向藥物而熟知,但隨著應用的不斷擴大,其逐漸出現(xiàn)的耐藥性和毒副作用不容忽視,為了避免藥物本身存在的不足,臨床上往往采用多種藥物聯(lián)合使用的方案來達到最佳的治療效果．

代表與空白對照組相比,***P<0.001;&代表與各單藥組相比,&P<0.001;#代表與模型組相比,##P<0.01;＄代表與模型組中的各單藥組相比,＄P<0.001.

代表與空白對照組相比,***P<0.001,&代表與各單藥組相比,&P<0.001;#代表與模型組相比,###P<0.001;＄代表與模型組中的各單藥組相比,＄P<0.001.

茶硝香酰胺TNC屬于茶氨酸衍生物,單獨或聯(lián)合抗癌藥物使用均有良好的抗腫瘤活性．實驗室前期工作已經(jīng)證實TNC對A549細胞生長和遷移具有抑制作用,并且可能是通過影響AKT或NF-κB信號通路發(fā)揮作用．由MTT實驗結(jié)果可知:24 h時除250 μmol/L TNC聯(lián)合25 μmol/L吉非替尼對A549細胞的生長有較弱的影響外,其他聯(lián)合濃度在24 h對A549細胞生長無顯著性影響,在此基礎(chǔ)上,本實驗主要探究TNC能否提高吉非替尼對A549細胞遷移的抑制作用和其作用的分子機制,排除高濃度對細胞生長的影響,結(jié)合預實驗我們選擇125 μmol/L TNC聯(lián)合25 μmol/L吉非替尼進行實驗．劃痕實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn):TNC聯(lián)合吉非替尼對A549細胞遷移抑制作用顯著優(yōu)于單獨應用同等劑量的吉非替尼,25 μmol/L 吉非替尼組細胞相對遷移率為64.86%,而加入TNC的聯(lián)合組細胞相對遷移率降低至51.26%,對A549細胞遷移的抑制率顯著提高;在后續(xù)的Transwell實驗中,吉非替尼組細胞相對遷移率為56.59%,而聯(lián)合用藥組細胞相對遷移率降低至42.71%,提示TNC可顯著提高吉非替尼對A549細胞遷移的抑制作用．Transwell實驗結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn):在EMT模型組中,TNC和吉非替尼均可以抑制A549細胞的遷移能力,且聯(lián)合用藥組的抑制率較單藥組顯著提高．此外,本研究采用Western Blotting實驗檢測相關(guān)蛋白的表達水平,進一步解析其可能作用的分子機制．

EMT是腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一[17],與腫瘤細胞的遷移密切相關(guān)[18],其中上皮細胞標志物E-Cadherin、間質(zhì)細胞標志物波形蛋白Vimentin和N-鈣黏著蛋白N-Cadherin公認為細胞發(fā)生EMT過程的重要標志[24],其中可以抑制E-Cadherin表達的轉(zhuǎn)錄因子家族也逐漸成為研究EMT過程的重要內(nèi)容,其中包含鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員Slug、Snail、堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族成員Twist和E盒結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族ZEB等[25],這四者同屬于E鈣黏著轉(zhuǎn)錄抑制子,可以通過位于E-Cadherin 啟動子區(qū)域的E盒特異結(jié)合,從而起到抑制 E-Cadherin表達的作用,進而促進間質(zhì)化進程．本實驗中,TNC聯(lián)合吉非替尼可顯著上調(diào)E-Cadherin的表達,下調(diào)N-Cadherin、Vimentin、轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、ZEB、Twist的表達,提示兩者聯(lián)合可能是通過抑制A549細胞發(fā)生EMT過程從而影響其遷移能力．HGF誘導的c-MET活化觸發(fā)了多種細胞反應,包括細胞增殖,凋亡,骨架重排等．在癌細胞中,可以通過激活RTK激酶,引起自體磷酸化,激活PI3K,進一步促進癌細胞轉(zhuǎn)移[26-27]．表皮生長因子受體EGFR可由活化的HGF/c-Met、 K-Ras激活后,與EGF結(jié)合啟動PI3K/AKT信號通路,逐級磷酸化下游蛋白,比如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等,從而影響細胞的生長轉(zhuǎn)移和一系列生理過程．由Western Blotting實驗結(jié)果可知:TNC聯(lián)合吉非替尼顯著下調(diào)了上述PI3K/AKT和NF-κB信號通路促進EMT和遷移相關(guān)蛋白的表達水平,同時顯著提高了抑制EMT和遷移的E-Cadherin蛋白的表達水平,且較單藥組相比,作用程度更顯著．本研究這些結(jié)果表明:TNC聯(lián)合吉非替尼可顯著增強吉非替尼對A549細胞遷移能力的影響,其作用的分子機制可能是通過影響HGF/c-Met/K-Ras/EGFR/EGF-PI3K/AKT/NF-κB信號通路而發(fā)揮作用,這為TNC開發(fā)應用與吉非替尼在臨床上如何平衡治療效果、減少轉(zhuǎn)移和毒副作用提供了新的解決思路．