甘薯渣多糖提取、分離純化及抗氧化活性研究

陳樹俊 崔 云

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006)

甘薯是我國主要糧食作物之一，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1]，常用于生產(chǎn)甘薯淀粉類等產(chǎn)品，其產(chǎn)生的副產(chǎn)物甘薯渣難以處理，除極少部分用作飼料外，大部分被丟棄。但甘薯渣中含有許多未利用的可溶性膳食纖維類等多糖類物質(zhì)[2]。多糖是一種生物活性物質(zhì)，因為具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、提高免疫力[5]等功效被廣受關(guān)注。劉捷等[6]研究了水浴醇沉法提取紅薯葉多糖，并測定其為β-吡喃糖化合物。但對甘薯渣多糖的研究鮮有報道。本實驗用超聲輔助提取甘薯渣多糖，對比得使用Sevag-酶法脫蛋白[7]，H2O2法脫色[8，9]，透析，DEAE-52纖維素分級[10]得SPRP-1，用SephadexG-100和紫外吸收光譜法[11]對SPRP-1純度鑒定，并研究其抗氧化活性[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯(4月份)產(chǎn)自山西太原、牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶(80萬u/g)、DEAE-52纖維素、SephadexG-100、DPPH等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-2000UV型紫外分光光度計，SC-3614低速離心機，HHS-21-4電熱恒溫水浴鍋，SHZ-Ⅲ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，MS-H-S標準加熱型磁力攪拌器，SB-5200DTD超聲波清洗機，SCIENTZ-18N真空冷凍干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 提取

1.3.1.1 超聲輔助提取

將新鮮甘薯洗凈，打漿機2次破碎，3層紗布過濾2次得鮮甘薯渣，60 ℃條件下烘干10 h，粉碎過60目篩得甘薯渣樣品。稱1 g樣品，適當條件超聲輔助熱水浸提后，4 000 r/min離心15 min，濃縮，加95%乙醇4 ℃醇沉過夜，4 000 r/min離心15 min，冷凍干燥得粗多糖。

1.3.1.2 多糖含量測定

參考馬風偉等[13]方法，標準品為葡萄糖，以吸光度(y)和葡萄糖濃度(x)得標準曲線y=9.931 4x-0.051 6R2=0.999 1，測定多糖得率。

式中：m1為多糖質(zhì)量/mg；m為樣品質(zhì)量/mg。

1.3.1.3 單因素實驗

料液比：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；超聲溫度：30、40、50、60、70 ℃；超聲功率：160、180、200、220、240 W；超聲時間：40、50、60、70、80 min。每組實驗重復(fù)3次，得各單因素對多糖得率影響。

1.3.1.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

以料液比，超聲溫度，超聲功率，超聲時間(x)，甘薯渣多糖得率(y)，根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素結(jié)果，采用四因素三水平響應(yīng)面進行實驗，優(yōu)化超聲波輔助提取甘薯渣多糖工藝，實驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平

1.3.2 脫蛋白

1.3.2.1 蛋白質(zhì)含量測定

參考楊玉芳[14]方法，標準品為牛血清白蛋白，以吸光度(y)和牛血清白蛋白濃度(x)得標準曲線y=0.004 6x+0.073 8，R2=0.999 3，測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.2 方法

Sevag法：取適量多糖溶液，加1/3體積(氯仿∶正丁醇=4∶1)氯仿-正丁醇溶液攪拌1 h，8 000 r/min離心20 min得上清液。重述操作直至無沉淀產(chǎn)生。

TCA法：取適量多糖溶液，加適量30%三氯乙酸溶液，4 ℃靜置過夜，8 000 r/min離心20 min得上清液。

酶法：取適量多糖溶液，加2%木瓜蛋白酶，調(diào)pH 6.0，50 ℃水浴2 h，8 000 r/min離心20 min得上清液。

Sevag-酶法：在酶法基礎(chǔ)上用Sevag法脫蛋白得上清液。

Sevag-TCA法：在TCA法基礎(chǔ)上用Sevag法脫蛋白得上清液。

比較上述方法，計算蛋白質(zhì)清除率及多糖損失率。

1.3.3 脫色

H2O2法：用1 mol/LNaOH溶液調(diào)溶液pH 8.5，加1/3體積30% H2O2溶液，50 ℃下脫色2 h，直至顏色不再改變，冷卻后調(diào)pH 7.0。

活性炭法：將活性炭洗凈過濾，120 ℃烘干10 h，冷卻備用。取20 mL多糖溶液，加1.5%活性炭，60 ℃脫色2 h。

反膠束法：取4 mg/mL多糖溶液100 mL，沸水浴30 min，3 000 r/min離心3 min，取上清液40 mL加0.467gNaCl攪拌溶解，放置備用。取1 mL反膠束溶液和3 mL多糖處理液，混勻3 min后靜置30 min，檢測下層溶液。

比較上述方法，計算脫色率及多糖損失率。

1.3.4 透析

脫蛋白、脫色后多糖溶液還存在一些如無機鹽等小分子雜質(zhì)需要除去，將多糖溶液置于透析袋中，放入蒸餾水中透析72 h，每24 h換1次水，換3次。

1.3.5 分級

將多糖溶液濃縮上樣到處理好的DEAE-52纖維素柱上，用蒸餾水、0.1～1 mol/LNaCl的Tris-HCl溶液依次洗脫，流速為1 mL/min，每6 min收集一管，用苯酚-硫酸法在波長490 nm處測定洗脫液吸光度，以吸光度(y)、管號(x)繪制洗脫曲線。洗脫液濃縮，冷凍干燥得精多糖。

1.3.6 純度鑒定

SephadexG-100凝膠柱層析：配制6 mg/mL多糖溶液上樣到處理好的SephadexG-100凝膠柱上，用蒸餾水洗脫，流速為0.3 mL/min，每10 min收集一管。用苯酚-硫酸法在波長490 nm處測定洗脫液吸光度，以吸光度(y)、管號(x)繪制洗脫曲線。

紫外吸收光譜法：配制1.0 mg/mL多糖溶液在200～500 nm范圍內(nèi)全波長掃描，觀察其在波長260、280 nm附近的吸收峰。

1.3.7 體外抗氧化活性

1.3.7.1 清除DPPH自由基能力測定

參考宋佳敏[12]方法：測定2 mL無水乙醇和2 mLDPPH-乙醇溶液混合液在波長517 nm處的吸光度A0。配制不同質(zhì)量濃度多糖溶液，加2 mL0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液避光靜置30 min，測定吸光度A1，用無水乙醇代替DPPH-乙醇，測定吸光度A2。以VC為對照，計算清除率：

式中：A0為2 mL無水乙醇+2 mLDPPH-乙醇溶液吸光度；A1為2 mL樣品溶液+2 mLDPPH-乙醇溶液吸光度；A2為2 mL樣品溶液+2mL無水乙醇溶液吸光度。

1.3.7.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

參考王麗波[15]方法：取預(yù)熱后4.5 mL(pH 8.2、50 mmol/L)Tris-HCl溶液，加4 mL蒸餾水37 ℃水浴20 min，加0.5 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液水浴20 min，搖勻計時1 min，立刻測定在波長325 nm下吸光度值，每0.5 min測定1次，以10 mmol/L HCl溶液為對照，計算鄰苯三酚自氧化速率v0。取不同質(zhì)量濃度多糖溶液4 mL代替蒸餾水，以VC為對照，計算鄰苯三酚自氧化速率v1，最后計算清除率：

式中：v0為鄰苯三酚自氧化速率；v1為加多糖后鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.7.3 清除·OH能力測定

參考張昊[16]方法：取不同質(zhì)量濃度多糖溶液1 mL，加1 mL6 mmol/LH2O2溶液、FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液，40 ℃水浴1 h，在波長510 nm處測定吸光度A1，用蒸餾水代替H2O2溶液測定吸光度A2，用蒸餾水代替多糖溶液測定吸光度A0，計算清除率：

式中：A0為1 mL蒸餾水+1 mLH2O2溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度；A1為1 mL樣品溶液+1 mLH2O2溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度；A2為1 mL樣品溶液+1 mL蒸餾水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇溶液吸光度。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

本實驗均進行3次重復(fù)實驗，采用Design-Expert 8.0.6、Origin8.0和excel軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取優(yōu)化

2.1.1 單因素結(jié)果

由圖1可知，增加溶劑用量，促進了溶質(zhì)與溶劑反應(yīng)，使多糖得率增加，過大溶劑用量可能導(dǎo)致分子間作用力減弱得率下降；隨著超聲時間延長，多糖得率先增加后降低，超過60 min后多糖內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到破壞得率下降，但在70～80 min，得率回升可能是超

圖1 單因素實驗結(jié)果

聲破壞了其他大分子結(jié)構(gòu)使其降解為小分子物質(zhì)，懸浮在溶液中而使得率增大[17]；超聲溫度過高得率下降，原因是高溫使得溶劑溶出，不利于多糖溶出[18]；超聲功率過大使得其他活性物質(zhì)散布于溶劑中，影響了多糖溶出。

2.1.2 響應(yīng)面結(jié)果

由表2建立二次元線性回歸方程：Y=5.91+0.22A+0.33B+0.25C+0.18D-0.27AB-0.11AC+0.12AD-0.27BC-0.41BD+0.17CD-0.41A2-0.54B2-0.52C2-0.21D2。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果

圖2 各因素交互作用對SPRP得率影響的響應(yīng)面圖

表3 Box-Behnken 實驗結(jié)果方差分析

2.1.3 各因素交互作用

由圖2a可知，料液比和超聲時間對多糖得率影響呈拋物線，隨著超聲時間的延長得率變化大于料液比，說明超聲時間對多糖得率的影響較大；由圖2d可知，超聲時間和超聲功率對得率影響呈曲面較陡的拋物線，兩者對多糖得率的影響顯著；由圖2e可知，超聲時間和超聲溫度對多糖得率影響呈先升高后平緩，兩者交互作用顯著。由圖2f可知，得率隨著超聲溫度增加先上升后平緩，但隨著超聲功率增大呈拋物線，交互曲面坡度較陡，說明兩者交互作用顯著。經(jīng)Design-Expert 8.0分析可得最優(yōu)工藝為料液比1∶17.30(g/mL)、超聲時間57.05 min、超聲功率208.66 W、超聲溫度60 ℃，多糖得率最優(yōu)值為6.069%。綜合考慮實際因素和實驗準確性，最后確定料液比1∶17、超聲時間57 min、超聲功率209 W、超聲溫度60 ℃，進行3組重復(fù)驗證實驗，多糖平均得率為5.926%。

2.2 脫蛋白結(jié)果

由圖3可知，綜合考慮蛋白質(zhì)清除率及多糖損失率，單獨使用TCA法、Sevag法、酶法效果不及Sevag-酶法和Sevag-TCA法，因為兩種方法合用可以起增效作用。但Sevag-TCA法多糖損失率比Sevag-酶法高7.82%，最后選Sevag-酶法脫蛋白，因為酶法中的木瓜蛋蛋白酶可將多糖周圍的蛋白質(zhì)降解[19]，在酶法基礎(chǔ)上使用Sevag法可以使蛋白質(zhì)清除率達到76.41%的同時將多糖損失率降到25.69%，時間短且處理次數(shù)少。

圖3 脫蛋白方法對SPRP影響

2.3 脫色結(jié)果

由圖4可知，活性炭法脫色率62.55%且多糖損失率47.26%，原因是活性炭特異性吸附一些有顏色的色素導(dǎo)致脫色率較低；反膠束法脫色率55.34%且多糖損失率44.38% ，但原料價格昂貴、所用試劑不能回收且脫色率比H2O2法低27.37%。H2O2法可以在脫色率可達82.71%且多糖損失率僅30.03%。因此選用H2O2法脫色，簡單易操作且脫色效果較好。

圖4 脫色方法對SPRP影響

2.4 分級結(jié)果

由圖5可知，經(jīng)DEAE-52纖維素分級后出現(xiàn)了3種較對稱的峰，說明0～1mol/L NaCl的Tris-HCl溶液能較好地分離甘薯渣多糖，分別命名為SPRP-1、SPRP-2和SPRP-3。SPRP-1集中在第10～30管間，SPRP-2集中在第40～45管間，SPRP-3集中在第60～66管間，由于SPRP-2和SPRP-3峰較小即含量較少，接下來的實驗中不予考慮。

2.5 純度鑒定結(jié)果

由圖6a可知，經(jīng)Sephadex G-100洗脫后呈現(xiàn)單一對稱峰，說明經(jīng)一系列分離純化的SPRP-1為相對分子質(zhì)量分布均勻且較純的多糖。從圖6b可知，SPRP-1特征吸收峰出現(xiàn)在235 nm，在260 nm和280 nm處沒有出現(xiàn)核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰，說明SPRP-1不含核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的純多糖。

2.6 抗氧化活性測定結(jié)果

由圖7a可知，隨著質(zhì)量濃度增大，SPRP-1對DPPH自由基清除率逐漸增加，在70 μg/mL后清除率穩(wěn)定在86%左右。計算得SPRP-1對DPPH自由基的IC50為29.928 μg/mL；從圖7b可知，隨著質(zhì)量濃度增大，SPRP-1對超氧陰離子自由基清除率增長了44.49%，計算得SPRP-1對超氧陰離子自由基的IC50為0.537 mg/mL；從圖7c可知，質(zhì)量濃度在0.1-0.6 mg/mL范圍內(nèi)，SPRP-1對·OH清除率增長了69.68%，計算得SPRP-1對·OH的IC50為0.308 mg/mL。與VC對照可知甘薯渣多糖具有較好的抗氧化活性。

圖5 DEAE-52洗脫曲線

圖6 純度鑒定實驗結(jié)果

圖7 抗氧化能力實驗結(jié)果

3 結(jié)論

目前，甘薯渣中部分可溶性多糖類物質(zhì)或提取多糖后剩余的不可溶性物質(zhì)已被初步研究且得率較低，本實驗通過超聲輔助提取甘薯渣多糖最優(yōu)工藝為：料液比1∶17(g/mL)、超聲時間57min、超聲功率209 W、超聲溫度60 ℃，甘薯渣多糖得率為5.926%。經(jīng)Sevag-酶法脫蛋白，H2O2法脫色，透析，DEAE-52纖維素分級得含量較多的SPRP-1。且SPRP-1是一種相對分子質(zhì)量分布均勻、不含蛋白質(zhì)、核酸并具有較好抗氧化活性的純多糖。