陰陽共調(diào)湯干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠的實驗研究

陳藝緣，張茂云，孫 睿，梁健峰，白瀟嫻，王柏淇，劉宏巖，郭軍鵬，錢婷婷，劉巖松

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨病，表現(xiàn)為骨組織微結(jié)構損傷和骨量減少，骨脆性增加導致骨折易發(fā)，尤其以絕經(jīng)后的女性和老年男性最為多見[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMPO）是由于絕經(jīng)后卵巢功能衰退引起雌激素水平分泌降低的一種代謝性疾病[2]，致使患者易骨折，嚴重可致殘甚至致死。目前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要以抑制骨吸收藥物、促進骨形成藥物、骨礦物藥物為主，如雌激素、鈣劑、甲狀旁腺素等。這些藥物在臨床上有著良好的效果，但此類藥物大多需要長時間服用，這種服藥方式會帶來很多不良反應，如雌激素的長時間應用會提高罹患子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等疾病的發(fā)生概率[3]，除此外還有增加異常子宮出血、卵巢癌等風險[4]。為降低雌激素等治療藥物帶來的不良反應，同時有效干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，近年來中醫(yī)學界對于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的研究頗多，如何更好地防止絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥成為研究的熱點。

中醫(yī)學中并沒有絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥這一病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其劃歸為“骨痿”“骨枯”“腰痛”等范疇[5]。中醫(yī)認為，本病發(fā)病緩慢，《素問·上古天真論篇第一》：“七七，任脈虛太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子。”絕經(jīng)后天癸竭，以致腎精虧虛，日久髓海空虛是該病之病機。治療大多以“滋陰、補腎、健脾”[6]立著。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女雖以陰虛多見，但臨床多以陰陽兩虛之證候同時出現(xiàn)，當以“陰陽共調(diào)”論治。本實驗通過去卵巢術建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型，對比陰陽共調(diào)湯、雌激素、金匱腎氣丸湯劑、六味地黃湯對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠的影響，進行該項動物實驗，以期提供動物實驗數(shù)據(jù)，為以后研究提供新依據(jù)，為臨床提供新思路。

1 材料

1.1 實驗藥物 陰陽共調(diào)湯由熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮12 g，葛根12 g，龜板9 g，女貞子12 g，淫羊藿12 g，巴戟天12 g 組成；金匱腎氣丸湯由生地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，桂枝3 g，炮附子3 g組成；六味地黃湯由熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g 組成。所有藥物均來自于長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，3 種中藥劑根據(jù)小鼠與人體質(zhì)量1:0.035 比例配比，煎煮時予8 倍水、6 倍水6 次濃縮至30 mL。對照組予補佳樂1 mg 配比溶液。

1.2 實驗動物 3 月齡SD 雌性小鼠60 只，體質(zhì)量（20±7.7）g。所有小鼠均購于遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，常規(guī)飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學動物實驗室。

1.3 實驗儀器 蘇木素液，伊紅染色液，梯度濃度乙醇，二甲苯，多聚甲醛，青霉素，羧甲基纖維素鈉，超純水等。石蠟包埋機（HIS-TOCENTRE），石蠟切片機（FINESSE），HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，奧林巴斯BX40顯微鏡，小動物骨強度儀。

2 方法

2.1 造模 除假手術組、模型組外，其余各組小鼠以1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，行雙側(cè)卵巢切除術。卵巢切除術：1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，將小鼠仰臥于手術臺上，四肢固定，腹部正中偏下處備皮，絡合碘消毒，切開皮膚，于腹白線依次切開肌肉，剪開腹膜進入腹腔，可見乳白色組織。輕輕將之拉出腹腔,即可見被包裹的粉紅色高粱米大小“桑葚樣”卵巢，分離后鉗夾、結(jié)扎，剪去卵巢，檢查有無滲血，分層縫合皮膚，絡合碘切口消毒。待麻醉蘇醒。小鼠術后均口服青霉素混懸液（2 萬U/mL）抗感染，連續(xù)3 d。常規(guī)飼養(yǎng),自由飲水攝食，并注意觀察小鼠的情況。

2.2 劑量及灌胃 在小鼠接受造模處理后第31 天，進行藥物干預。陰陽共調(diào)湯組、金匱腎氣丸湯劑組、六味地黃湯組分別予對應藥劑0.3 mL 灌胃；對照組給予補佳樂混懸液0.3 mL；假手術組、模型組口服等體積的超純水。每日1 次，連續(xù)給藥90 d。

2.3 取材 第91 天采取斷頭法處死小鼠，處死前一晚斷糧供水，在無菌操作下剝離子宮，稱其重量，剪斷雙側(cè)脛骨、股骨，分離肌肉，測量骨強度值，脛骨、股骨脫鈣2 周處理，切片染色以觀察骨小梁、干骺端。

2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均值±標準差（x±s）表達，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析；技術資料采用卡方檢驗。

3 結(jié)果

3.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型體質(zhì)量變化 分別測定小鼠術后30、60、90 d（處死前）的體質(zhì)量變化，如表1。術后30天與模型組相比，各組小鼠體質(zhì)量無顯著差異；術后60 天，與模型組相比，對照組體質(zhì)量增高、金匱腎氣丸湯劑組體質(zhì)量降低，均有顯著差異；術后90 天（處死前），與模型組相比較，陰陽共調(diào)湯劑組與六味地黃湯劑組體質(zhì)量降低，有顯著差異，與對照組相比較，陰陽共調(diào)湯劑組沒有顯著差異。

表1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型體質(zhì)量變化 g

3.2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠子宮重量 分別測定小鼠處死后的子宮重量，如表2。與模型組相比較，對照組與陰陽共調(diào)湯劑組子宮重量增高，有顯著差異；與對照組相比較，陰陽共調(diào)湯劑組無顯著差異。

表2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠子宮重量

3.3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨強度值 取右側(cè)股骨，放置于小動物骨骼強度測定儀上，根據(jù)骨壓碎最大荷載壓力，測定骨骼強度，如表3。

表3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨強度值 kg

3.4 HE 染色小鼠股骨、脛骨冠狀面光鏡圖 分別在4倍鏡、10 倍鏡下觀察骨小梁與干骺端，如圖4、5、6、7。從圖可看出，在4 倍鏡、10 倍鏡下，可以看出，假手術組骨細胞內(nèi)含量豐富，干骺端骨量正常分布，骨小梁排列規(guī)律，脛骨、股骨細胞中無空洞現(xiàn)象，結(jié)構緊密，密度正常。模型組的脛骨和股骨細胞內(nèi)可見多處空洞、骨小梁斷裂、干骺端骨量流失且分布不均勻，骨組織明顯減少，結(jié)構疏松，證明雙側(cè)卵巢切除術可以模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松這一模型。與模型組相比，陰陽共調(diào)湯劑組的股骨與脛骨的骨小梁之間聯(lián)系更為緊密，排列更有規(guī)律，而模型組骨小梁稀疏纖細，有斷裂、分層；與模型組相比較，干骺端骨量明顯增多。

4 討論

圖4 4 倍鏡下股骨骨小梁與干骺端

圖5 10 倍鏡下股骨骨小梁與干骺端

圖6 4 倍鏡下脛骨骨小梁與干骺端

圖7 10 倍鏡下脛骨骨小梁與干骺端

中醫(yī)認為，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥由多種病機所致，以腎精虧虛為本，同時與肝脾兩臟有關[7]。“腎主骨，生髓?！惫撬璧某溆蕾囉谀I精的滋養(yǎng)，從而使骨骼強健有力[8]。李建國認為，女子以肝為先天，女性的特殊生理、病理都與肝的關系極為密切，女性的生理特點決定了其易于引起肝血虧虛之證，導致肝藏血及疏泄功能失職，引發(fā)陰虛血虧，不能濡養(yǎng)筋骨[9]；絕經(jīng)后婦女脾氣虧虛，氣血生化無源，無以填充骨髓，則骨枯髓減，四肢廢痿[10]。但筆者在臨床中發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥陰陽兩虛者甚多。“天癸至，月事以時下；天癸竭，地道不通”，彭勛潛認為女子來潮、絕經(jīng)都與天癸有著密不可分的關系，天癸竭則月經(jīng)竭，進而發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[11]。“天癸竭”主要表現(xiàn)為腎陰虛、腎陽虛或陰陽俱虛等臨床表現(xiàn)[12]。周艷認為，陰陽失衡則諸證峰起[13]。陽存于陰，陰存于陽，“孤陰不生，獨陽不長”，陰陽互根互用，雙方具有互相滋生、促進的作用，同時也會“陽損及陰，陰損及陽”，故而絕經(jīng)后婦女易于出現(xiàn)陰陽兩虛之證，在治療上施以“陰陽共調(diào)”之法，以期使陰陽復交，正氣盛則病自去[14]。

本實驗采用的去卵巢骨質(zhì)疏松模型是目前最常用的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型[15]。該模型采用手術切除小鼠雙側(cè)卵巢的方法后，其骨代謝活躍，骨量明顯丟失；雌激素水平下降，骨密度值降低，較好的模擬了女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的雌激素水平下降，骨密度值下降，骨強度值下降，骨量丟失加速，鈣、磷等礦物質(zhì)代謝紊亂，破壞了骨形成與骨吸收間的骨代謝平衡，破骨細胞吸收的骨量大于成骨細胞形成的骨量，導致凈骨量丟失的特點[16]。

目前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有雌激素補充劑、雷洛昔芬[17]、降鈣素[18]等，并且有相關研究表明維生素D 可以調(diào)節(jié)鈣磷及骨代謝[19]。

本實驗探究陰陽共調(diào)湯對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨強度、骨小梁、干骺端等指標的影響。病理切片提示陰陽共調(diào)湯劑組與對照組干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠有良好的效果，可以明顯改善骨質(zhì)疏松的病理形態(tài)，增加骨小梁面積和厚度、增加干骺端的骨量；骨強度提示陰陽共調(diào)湯劑組與對照組能夠顯著提升小鼠的股骨強度，提高荷載能力。陰陽共調(diào)湯劑組與對照組各項指標并無顯著差異，可以認為，陰陽共調(diào)湯與雌激素效力相當。相較于雌激素的使用，陰陽共調(diào)湯可以降低致癌或靜脈血栓[20]等不良反應，更為安全、健康。研究結(jié)果可以為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的臨床提供新的理論依據(jù)及實驗基礎。