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    保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞p38 通路及凋亡的作用研究

    2020-11-04 02:03:58崔方強(qiáng)王悅芬江心燦趙文景
    吉林中醫(yī)藥 2020年10期
    關(guān)鍵詞:含藥高糖灌胃

    崔方強(qiáng),王悅芬,孟 元,蔡 朕,江心燦,趙文景*

    (1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010;2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京 100069)

    糖尿病腎?。―N)發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì),已經(jīng)成為導(dǎo)致終末期腎病十分重要的原因[1-2]。但是糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前并未完全闡明。因此糖尿病腎病缺乏針對(duì)性并且有效的臨床防治措施。多項(xiàng)研究均已證實(shí),糖尿病腎病中足細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡,而足細(xì)胞凋亡在DN 的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[3-5]。高糖刺激會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞p38 信號(hào)通路激活,進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑,最終引起caspase-3蛋白激活[6-7]。Caspase-3 蛋白激活直接介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡及蛋白尿的產(chǎn)生,進(jìn)而導(dǎo)致疾病的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),抑制足細(xì)胞p38 通路激活、減輕足細(xì)胞凋亡,可以有效的延緩DN 疾病的進(jìn)展[8-9]。保腎通絡(luò)方是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科協(xié)定處方,被廣泛應(yīng)用于DN 的臨床防治。此外臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),保腎通絡(luò)方臨床防治DN 療效確切[10]。本實(shí)驗(yàn)觀察了保腎通絡(luò)方對(duì)于高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞p38 通路及足細(xì)胞凋亡的影響,闡明其防治DN 的分子機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 8 周齡雄性SD 大鼠,購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2014-0004。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用條件永生小鼠足細(xì)胞系,購(gòu)于北納生物科技有限公司,批號(hào):BNCC337685。CCK-8 試劑盒(碧云天生物,C40042),Hochest33258染料(Solarbio,C0021-1ml),DMEM低糖培養(yǎng)基(Genview,GD3114-500ml),葡萄糖(Sigma,SLBC6575V),甘露醇(Sigma,WXBC2419V),胎牛血清(Sciencell,17985),P38 抗體(abcam,ab121828),P-p38 抗體(abcam,ab47363),Caspase-3 抗體(abcam,ab13847),F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(凱基生物,KGAA25),保腎通絡(luò)方顆粒劑,由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科制備,每1 g 顆粒劑含4.01 g 生藥,臨床成人用量為每日1.91 g(生藥)/kg。酶標(biāo)儀(北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司,ZS-3),電泳儀(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,DG-300C) ; 迷你雙垂直電泳槽(北京市六一儀器廠,DYCZ-24DN) ; 迷你轉(zhuǎn)印電泳槽(北京市六一儀器廠,DYCZ-40D),凝膠化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(FUSION FX6 XT,Vilber 公司),離心機(jī)(Sigma,3K18);倒置顯微鏡(德國(guó)Leica 公司);激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8 STED,Leica,德國(guó))。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 含藥血清制備 20 只8 周齡雄性SD 大鼠隨機(jī)分為空白血清組、保腎通絡(luò)方低劑量組、保腎通絡(luò)方中劑量組及保腎通絡(luò)方高劑量組,每組5 只。將保腎通絡(luò)方分別配制成濃度為0.5、1、2 g/mL 的低、中、高劑量的灌胃劑。保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組分別予相應(yīng)的灌胃劑灌胃。各組大鼠每天灌胃2 次,每次灌胃2 mL,連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃后,待血藥濃度穩(wěn)定后麻醉大鼠,1%戊巴比妥鈉按照40 mg/kg 劑量麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,分離血清。將不同組別血清56 ℃水浴30 min,無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌,-80 ℃冰箱保存。

    1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組給藥 條件永生小鼠足細(xì)胞系移入25 cm2培養(yǎng)瓶,并加入含有10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基4~5 mL。將足細(xì)胞放入37 ℃、95%空氣和 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞增殖到80%融合時(shí),進(jìn)行無(wú)血清處理。然后足細(xì)胞分為不同組別:正常對(duì)照組(NC)(低糖培養(yǎng)基加甘露醇加空白血清),模型組(HG)(含30 mmol/L 葡萄糖的高糖培養(yǎng)基加空白血清),保腎通絡(luò)方含藥血清低(BSF-L)、中(BSF-M)、高(BSF-H)劑量組(含30 mmol/L 葡萄糖的高糖培養(yǎng)基加低、中、高劑量保腎通絡(luò)方含藥血清)。不同組別足細(xì)胞進(jìn)行不同的干預(yù)措施,干預(yù)時(shí)間為24 h。然后進(jìn)行細(xì)胞收集或細(xì)胞固定,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3 CCK-8 檢測(cè) 將重懸的小鼠足細(xì)胞種植于96 孔板中,保證每孔細(xì)胞數(shù)目一致且不少于10 000 個(gè)細(xì)胞。將96 孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)下培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁并且生長(zhǎng)狀態(tài)良好后,給予不同的干預(yù)措施。干預(yù)24 h 后向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液,37 ℃孵育2 h。然后將96 孔板放置在酶標(biāo)儀上,在450 nm 條件下測(cè)定各孔OD 值,并根據(jù)OD 值測(cè)定細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD)×100%。

    1.2.4 Hochest33258 染色 將消毒好的玻璃片放入12孔板,將足細(xì)胞懸液滴加至玻璃片上,加入DMEM 完全培養(yǎng)基,進(jìn)行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁并狀態(tài)良好后給予不同干預(yù)措施,干預(yù)24 h 后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,0.5%Triton X-100 室溫透膜20 min,然后用配置好的Hochest33258 染料染色30 min,甘油封片。共聚焦顯微鏡觀察各組足細(xì)胞凋亡情況。每組隨機(jī)選取15 個(gè)視野,計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)目,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.2.5 細(xì)胞免疫熒光 將消毒好的玻璃片放入12孔板,將足細(xì)胞懸液滴加至玻璃片上,加入DMEM 完全培養(yǎng)基,進(jìn)行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁并狀態(tài)良好后給予不同干預(yù)措施,干預(yù)24 h 后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,0.5%Triton X-100 室溫透膜20 min,山羊血清封閉30 min。滴加稀釋好的一抗至玻璃片上,4 ℃孵育過(guò)夜,PBS 清洗后,二抗室溫孵育2 h,DAPI 染核5 min,甘油封片。共聚焦顯微鏡下觀察蛋白分別及表達(dá)情況。每組隨機(jī)選取15 個(gè)視野,計(jì)算熒光強(qiáng)度,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.2.6 Western blot 將裂解液加入收集的足細(xì)胞中,進(jìn)行組織裂解,離心后取上清,完成蛋白提取。然后用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。將等量的蛋白提取液加入孔槽中,利用10%SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束后,將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,然后滴加稀釋號(hào)的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜后加入二抗,室溫孵育2 h,ECL 試劑暗室內(nèi)膠片曝光,掃描膠片,用圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶。

    1.2.7 RT-PCR 將Trizol 加入收集好的足細(xì)胞中,反應(yīng)5 min 后加入氯仿,5~10 min 后離心提取最上層液體,然后向最上層液體依次加入預(yù)冷異丙醇、75%DEPC 乙醇,最后加入DEPC 處理過(guò)的水溶解沉淀,完成足細(xì)胞中的總RNA 的提取。然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的mRNA 轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增及熒光定量,采用 2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列,見(jiàn)表1。

    表1 引物序列

    1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊,組間比較采用單因素方差分析數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多重比較采用LSD 檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞活力影響 CCK-8 法檢測(cè)不同組別足細(xì)胞活力。與正常對(duì)照組相比,高糖組足細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05),與模型組相比,保腎通絡(luò)方含藥血清組足細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高糖刺激可以顯著降低足細(xì)胞活力,而保腎通絡(luò)方含藥血清可以升高足細(xì)胞活力。見(jiàn)圖1。

    圖1 不同組別足細(xì)胞活力比較

    2.2 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞p38 及P-p38 蛋白表達(dá)影響 WB 檢測(cè)不同組別足細(xì)胞p38 及P-p38 蛋白表達(dá)。p38 蛋白表達(dá)水平在不同組別之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與正常對(duì)照組相比,高糖組足細(xì)胞P-p38 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05);與高糖組相比,保腎通絡(luò)方含藥血清組足細(xì)胞P-p38 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高糖刺激可以顯著激活足細(xì)胞p38 信號(hào)通路,而保腎通絡(luò)方含藥血清可以抑制高糖引起的p38 信號(hào)通路激活。見(jiàn)圖2。

    圖2 不同組別足細(xì)胞P-p38 及p38 蛋白表達(dá)比較

    2.3 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞caspase-3蛋白及mRNA 表達(dá)影響 免疫熒光及RT-PCR 檢測(cè)不同組別足細(xì)胞caspase-3 蛋白和mRNA 表達(dá)。研究結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,高糖組足細(xì)胞caspase-3蛋白及mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),與高糖組相比,保腎通絡(luò)方含藥血清組足細(xì)胞caspase-3 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高糖刺激可以顯著上調(diào)足細(xì)胞caspase-3 蛋白及mRNA表達(dá),而保腎通絡(luò)方含藥血清可以下調(diào)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞caspase-3 蛋白及mRNA 表達(dá)。見(jiàn)圖3。

    圖3 不同組別足細(xì)胞caspase-3 蛋白及mRNA 表達(dá)比較

    2.4 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞凋亡的影響 Hochest33258 染色檢測(cè)不同組別足細(xì)胞的凋亡情況。與正常對(duì)照組相比,高糖組足細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯升高(P<0.05),與模型組相比,保腎通絡(luò)方含藥血清組足細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯降低(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高糖刺激可以引起足細(xì)胞凋亡,而保腎通絡(luò)方含藥血清可以減輕高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖4。

    圖4 不同組別足細(xì)胞凋亡數(shù)目比較

    3 討論

    DN 是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥,也是導(dǎo)致ESRD 的主要原因[1-2]。DN 目前的治療措施有限,并且缺少針對(duì)DN 發(fā)病機(jī)制的有效治療措施。因此盡管已經(jīng)采取了早期積極的臨床干預(yù)措施,我們并未有效的延緩DN 疾病的進(jìn)展。多項(xiàng)研究均已證實(shí),足細(xì)胞凋亡是DN 疾病進(jìn)展的重要病理機(jī)制[3-5]。腎小球?yàn)V過(guò)膜由內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜及足細(xì)胞的足突三層結(jié)構(gòu)組成,其中足細(xì)胞足突是腎小球?yàn)V過(guò)膜最為重要的組成部分。足細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致粘附在基底膜上的足突結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生及疾病的進(jìn)展[11-13]。此外足細(xì)胞是一種終末分化期細(xì)胞,失去了再生增殖的能力,因此足細(xì)胞凋亡引起的腎小球?yàn)V過(guò)膜的破壞無(wú)法得到再生修復(fù)。P38 信號(hào)通路是介導(dǎo)DN 足細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路。在DN 中,高糖刺激會(huì)引起足細(xì)胞p38 信號(hào)通路顯著激活,導(dǎo)致P-p38 蛋白表達(dá)上調(diào)。P38 通路激活后會(huì)引起促凋亡蛋白Bax 表達(dá)上調(diào),抑制凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)下調(diào),進(jìn)而引起caspase-3 激活,最終介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[14-15]。研究發(fā)現(xiàn),抑制足細(xì)胞p38 通路激活,減輕足細(xì)胞凋亡能夠有效的延緩DN 疾病進(jìn)展,可能成為DN 防治新的治療靶點(diǎn)[16-17]。

    中醫(yī)藥并沒(méi)有DN 的疾病名稱,從臨床癥狀上看應(yīng)屬于“水腫”“尿濁”“關(guān)格”的疾病范疇。針對(duì)DN 的中醫(yī)病因病機(jī),不同的醫(yī)家具有不同的認(rèn)識(shí),形成不同的理論學(xué)說(shuō)如微型癥瘕學(xué)說(shuō)[18]、毒損腎絡(luò)學(xué)說(shuō)[19]。全國(guó)名老中醫(yī)、首都國(guó)醫(yī)名師張炳厚教授根據(jù)五十多年臨床經(jīng)驗(yàn),提出“腎氣精兩虛,腎失封藏,腎絡(luò)閉阻”是DN 發(fā)病的核心病機(jī)。消渴初期多為陰虛燥熱,繼而出現(xiàn)氣血凝滯,絡(luò)脈閉阻,日久耗傷腎之氣精,導(dǎo)致腎失封藏,精微下泄。因此張炳厚教授以補(bǔ)腎通絡(luò)為DN 的治則,并取得很好的臨床療效。保腎通絡(luò)方就是補(bǔ)腎通絡(luò)的代表方藥,其是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科協(xié)定處方,被廣泛應(yīng)用于DN 的臨床防治。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),保腎通絡(luò)方具有降低蛋白尿、改善腎功能的作用[10]?;A(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí),保腎通絡(luò)方能夠改善KK-Ay 小鼠腎臟病理改變,并且能夠上調(diào)KK-Ay 小鼠足細(xì)胞nephrin 蛋白表達(dá),下調(diào)desmin 蛋白表達(dá),進(jìn)而減輕足細(xì)胞損傷[20]。但是保腎通絡(luò)方減輕足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制目前并不清楚。

    本實(shí)驗(yàn)首先觀察了保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)于高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞活力及足細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高糖刺激可以引起足細(xì)胞活力降低,導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡;而保腎通絡(luò)方含藥血清可以升高高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞活力,并能減輕足細(xì)胞凋亡。鑒于p38 信號(hào)通路在DN 足細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用,本實(shí)驗(yàn)觀察了保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞p38 蛋白及P-p38蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,保腎通絡(luò)方含藥血清能夠下調(diào)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞P-p38 蛋白表達(dá),抑制p38 通路激活。本實(shí)驗(yàn)又觀察了不同組別足細(xì)胞p38通路介導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,保腎通絡(luò)方含藥血清能夠下調(diào)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞caspase-3 蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),保腎通絡(luò)方含藥血清能夠抑制高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞p38 信號(hào)通路激活,減輕足細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)為保腎通絡(luò)方臨床防治DN 提供了科學(xué)依據(jù),但是至于其減輕DN 足細(xì)胞損傷的其他分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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