武宣地區(qū)紅曲米對紅曲柿酒品質(zhì)影響及其細(xì)菌組成分析

李慧敏，林 鳳，王玉梅，羅佳沂，李 洋，毛瑞豐

（廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530000）

紅曲米是以稻米為基質(zhì)在特定生態(tài)環(huán)境下用成曲作母種培養(yǎng)發(fā)酵制成，因其顏色鮮艷也稱為丹曲或者赤曲。紅曲米中含有較多的淀粉酶、糖化酶及酯化酶，在釀酒過程中起到發(fā)酵劑作用，常被用于釀制米酒[1]。以紅曲作為發(fā)酵劑釀制果酒，可以增強(qiáng)產(chǎn)品色澤，形成獨(dú)特風(fēng)味[2]，但目前將紅曲應(yīng)用到果酒生產(chǎn)的相關(guān)研究較少。柿子中含有豐富的生物活性物質(zhì)[3]，以柿子為原料經(jīng)多種工藝釀造而成的柿子酒，具有柿子獨(dú)特的顏色和果香味，同時(shí)還具有促進(jìn)人體消化和生津健脾等多種功能，但柿子由于缺少像葡萄、蘋果等常見釀酒果實(shí)中所具有的構(gòu)成果酒品質(zhì)特性的多種有機(jī)酸，對酵母菌的發(fā)酵作用不利，并且發(fā)酵而成的柿子酒往往風(fēng)味不佳。將紅曲引入柿酒發(fā)酵體系，可使柿酒具有獨(dú)特的風(fēng)味、絢麗的色彩和更高的營養(yǎng)保健價(jià)值三種特色，從而克服柿子酒風(fēng)味欠佳、營養(yǎng)成分不足的缺點(diǎn)，使生產(chǎn)的果酒具有更好的感官風(fēng)味和營養(yǎng)保健功能。

紅曲米質(zhì)量的好壞直接決定最終成品酒品質(zhì)，酒曲富集了曲霉、酵母菌和乳酸菌等多種微生物及其產(chǎn)生的豐富酶系，不同地區(qū)的生產(chǎn)環(huán)境、制備工藝、氣候條件及地理位置等差異形成了酒曲產(chǎn)品的菌群多樣性。在發(fā)酒酵過程中，絲狀真菌可以通過淀粉的糖化作用來產(chǎn)生酸，而酵母可以通過發(fā)酵糖類產(chǎn)生，但是它們產(chǎn)生的有機(jī)酸含量非常少[4]。一些研究指出細(xì)菌在酒發(fā)酵產(chǎn)酸過程起到了重要作用，如乳酸菌可通過異源發(fā)酵產(chǎn)乳酸、乙酸等有機(jī)酸[5]，醋酸桿菌能氧化葡萄糖或乙醇生成乙酸[6]，直接影響成品酒的口感和風(fēng)味[7]。目前，大部分研究都集中在紅曲各類型酒在發(fā)酵過程中微生物群落與風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性分析[8-9]，還鮮有對紅曲米菌群結(jié)構(gòu)的對比研究。比較紅曲米細(xì)菌菌群差異，對深入了解紅曲酒釀造機(jī)制具有一定的意義。

本研究使用武宣地區(qū)三種紅曲米作為發(fā)酵劑釀造紅曲柿酒，對其理化指標(biāo)和揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，并應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析三種武宣紅曲米細(xì)菌多樣性，為了解發(fā)酵劑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對成品酒品質(zhì)影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

WX-1、WX-2、WX-3紅曲米：廣西來賓市武宣縣；恭城月柿：廣西桂林恭城。

1.1.2 試劑

安琪SY釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母有限公司；無水乙醇（分析純）、重鉻酸鉀（分析純）、濃硫酸（純度98%）、氫氧化鈉（分析純）、3,5-二硝基水楊酸（分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；Qubit3.0脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）檢測試劑盒：美國Life Technologies公司；高純度耐熱DNA聚合酶（8 U/μL）、2×TaqMaster Mix：美國Vazyme公司；QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)：美國Promega公司；MagicPure Size Selection DNA Beads：法國Transgen公司；E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒：美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-800F恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE-2010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；UV1800-PC紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；XMT-F9型電熱恒溫水浴鍋：上海洪記儀器設(shè)備有限公司；7890A型安捷倫氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：美國安捷倫科技公司；9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PHBJ-260 pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；198*30手持折光儀：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲柿酒釀造工藝[10]

柿子→清洗→脫澀→去果柄和花盤→果漿調(diào)配→主發(fā)酵→倒酒→后發(fā)酵→倒酒→澄清→低溫陳釀→紅曲柿酒原酒

操作要點(diǎn)：

（1）選取完整無病害的恭城脆柿，經(jīng)過清洗、脫澀、去果柄和花盤后打漿處理。

（2）果漿調(diào)配：柿果打漿后，調(diào)糖度18%～22%，調(diào)pH值為4.5～5.5，按原果漿∶水=4∶1比例稀釋調(diào)配。

（3）主發(fā)酵：調(diào)配好后，加入原料質(zhì)量0.03%的活化釀酒酵母和3.5%紅曲米粉，發(fā)酵8～10 d。

（4）后發(fā)酵：主發(fā)酵過后，倒酒去除酒腳，進(jìn)行后發(fā)酵15 d。

（5）澄清：后發(fā)酵完成后，第二次去除酒腳，加入復(fù)合澄清劑（0.02%果膠酶和0.03%可溶性殼聚糖）澄清4～6 d。澄清完畢，過濾除濾渣。

（6）低溫陳釀：待澄清后，進(jìn)行低溫陳釀。將紅曲柿酒降溫為4 ℃繼續(xù)陳釀2個(gè)月，使酒更加協(xié)調(diào)，得到原酒。

1.3.2 紅曲柿酒質(zhì)量指標(biāo)測定

理化指標(biāo)：采用分光光度法測定酒精度[11]；采用酸堿滴定法測定總酸、揮發(fā)酸含量[12]；采用手持糖度儀測定可溶性固形物（殘?zhí)橇浚┖?；采?,5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[13]；采用氧化法測定SO2含量[12]。

微生物指標(biāo)：參照國標(biāo)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》測定細(xì)菌菌落總數(shù)、大腸菌群；參照國標(biāo)GB 29921—2013《食品中致病菌限量》測定致病菌。

1.3.3 紅曲柿酒中揮發(fā)性成分的測定

采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法測定紅曲柿酒中的揮發(fā)性成分[14]。

GC條件：DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm×0.5 μm），載氣為氦氣（He），流速19 mL/min；進(jìn)樣口溫度為230 ℃，程序升溫：起始溫度為60 ℃，保持2 min，5 ℃/min升至160 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至230 ℃保持1 min，最后運(yùn)行31 min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，連接桿溫度150 ℃。采用全掃模式收集信號，掃描范圍33～550 m/z。

定性定量：測定結(jié)果基于美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）14質(zhì)譜庫檢索進(jìn)行定性分析，面積歸一化法進(jìn)行定量分析，通過匹配度及CAS#號判斷可能的物質(zhì)種類。

1.3.4 紅曲米細(xì)菌菌群高通量測序

分別稱取200mg紅曲米樣品，放入無菌的2mL離心管中，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，振蕩混勻，10 000 r/min室溫離心3 min，棄上層液體。加入磷酸鹽緩沖液溶液（0.01 mol/L、pH=7.2），振蕩混勻，10 000 r/min室溫離心3 min，棄上層液體。按照Power Soil DNA Isolation Kit說明書分別提取3種紅曲米菌群的宏基因組DNA，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量。以提取的宏基因組DNA為模板，采用引物341F（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）對細(xì)菌的16S rRNA V3-V4區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共20個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：2×Phusion Master Mix 15 μL，正向及反向引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 20 ng，補(bǔ)雙蒸水（dd H2O）至30 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

利用Min Eluter PCR Purification Kit對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。利用Tru-SeqRDNA PCR-Free Sample Preparation Kit制備測序文庫并添加接頭序列，經(jīng)過Nano Drop 2000測定文庫質(zhì)量后，利用Illumina MiSeq 2500測序平臺進(jìn)行高通量測序[13]。

1.3.5 高通量測序數(shù)據(jù)處理與分析

使用QIIME軟件中的UCLUST將可操作分類單位（opti caltransform unit，OTU）根據(jù)97%的相似度進(jìn)行聚類[15]。根據(jù)OTU在不同樣本中的豐度分布，采用QIIME進(jìn)行alpha多樣性（Chao1、ACE、Shannon指數(shù)）分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用R語言3.6.1對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Origin8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種紅曲米對紅曲柿酒發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.1.1 不同種紅曲米對紅曲柿酒理化指標(biāo)的影響

3種紅曲柿酒發(fā)酵過程中總酸、揮發(fā)酸含量及酒精度的變化見圖1。由圖1可知，3種紅曲柿酒中的總酸和揮發(fā)酸含量首先迅速上升，發(fā)酵4～6 d時(shí)到達(dá)峰值，而后下降直至趨于平緩。WX-2組紅曲柿酒的總酸和揮發(fā)酸含量最高，與其他兩組差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵后期總酸和揮發(fā)酸含量都呈下降趨勢，是由于酸類物質(zhì)能與醇類物質(zhì)反應(yīng)生成相應(yīng)的酯類物質(zhì)，從而賦予酒體香味[16]。由圖1亦可知，紅曲柿酒發(fā)酵過程中酒精度與發(fā)酵時(shí)間呈正相關(guān)，且3種紅曲發(fā)酵劑對酒精度無顯著影響（P＞0.05）。酒精度的增加一定程度可以抑制酸的生成，因?yàn)楫?dāng)酒精度達(dá)到一定值，產(chǎn)酸的關(guān)鍵細(xì)菌可能不再存活，從而可以抑制總酸、揮發(fā)酸含量的增加[17]。

圖1 3種紅曲柿酒發(fā)酵過程中總酸（a）、揮發(fā)酸含量（b）及酒精度（c）的變化Fig.1 Changes in total acid (a),volatile acid content (b) and alcohol content (c) in three kinds of red kojic persimmon wine during fermentation

3種紅曲柿酒發(fā)酵過程中還原糖、可溶性固形物及SO2含量的變化見表1。由表1可知，3種紅曲柿酒在可溶性固形、SO2含量上均顯著差異（P＜0.05）。WX-3柿酒樣品的還原糖含量最高，與其他兩組差異顯著（P＜0.05），推測可能與紅曲米中糖化酶糖化速率有關(guān)。3種紅曲柿酒理化指標(biāo)均達(dá)到國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求。

表1 3種紅曲柿酒理化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of three kinds of red kojic persimmon wine

2.1.2 微生物指標(biāo)

3種紅曲柿酒的微生物指標(biāo)見表2。由表2可知，3種紅曲米制得的紅曲柿酒中細(xì)菌總數(shù)均≤50 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/100 mL，致病菌未檢出，結(jié)果表明3種紅曲柿酒微生物指標(biāo)均符合國標(biāo)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》、GB 29921—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》要求。

表2 3種紅曲柿酒微生物指標(biāo)檢測結(jié)果Table 2 Detection results of microbial indexes in three kinds of red kojic persimmon wine

2.2 紅曲柿酒揮發(fā)性成分測定

采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合GC-MS對發(fā)酵8 d后的紅曲柿酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測，其相對含量對比結(jié)果見圖2。

圖2 3種紅曲柿酒中揮發(fā)性成分相對含量Fig.2 Relative content of volatile components in three kinds of red kojic persimmon wine

使用紅曲發(fā)酵柿子酒引入了非果酒風(fēng)味物質(zhì)，豐富了發(fā)酵制品風(fēng)味。由圖2可知，3種紅曲米發(fā)酵而成的紅曲柿酒中酸類物質(zhì)差異明顯，相對含量分別為4.2%、3.3%、10.0%，其中揮發(fā)性酸類物質(zhì)的組成及占比見表3。

由表3可知，辛酸、乙酸為果酒中主要的揮發(fā)性酸類物質(zhì)，WX-2紅曲米制成的紅曲柿子酒中含有較多的棕櫚酸。棕櫚酸含量過高具有腐敗脂肪氣味；乙酸具食醋內(nèi)酸味及刺激性氣味；辛酸少量時(shí)有水果香味，大量具有汗臭味。適量的酸類物質(zhì)能提高酒體的整體協(xié)調(diào)性，過高或過低都會(huì)給酒體呈香帶來負(fù)面影響，WX-1紅曲米制成的紅曲柿子酒中含有較多的辛酸，WX-2紅曲米制成的紅曲柿子酒中還有較多的棕櫚酸，這些酸類對果酒風(fēng)味都會(huì)產(chǎn)生不良影響。

表3 3種紅曲柿酒中的揮發(fā)性酸類物質(zhì)Table 3 Volatile acids components in three kinds of red kojic persimmon wine

2.3 武宣地區(qū)3種紅曲米細(xì)菌菌群α-多樣性分析

武宣地區(qū)3種紅曲米樣品中細(xì)菌菌群序列數(shù)及α-多樣性分析結(jié)果見表4，紅曲米樣品細(xì)菌稀釋曲線見圖3。

表4 武宣地區(qū)3種紅曲米細(xì)菌菌群序列數(shù)及α-多樣性分析結(jié)果Table 4 Results of sequence numbers and α-diversity analysis of bacterial community of three kinds of red kojic rice samples from Wuxuan areas

圖3 武宣地區(qū)3種紅曲米樣品細(xì)菌稀釋曲線Fig.3 Dilution curves of bacteria in three kinds of red kojic rice samples from Wuxuan areas

由表4可知，樣本的覆蓋率指數(shù)平均值為97.2%。由圖3可知，當(dāng)測序量較低時(shí)每個(gè)紅曲米樣品的Shannon指數(shù)均隨著測序量的增加呈顯著上升趨勢，當(dāng)測序量＞10 000后，稀釋曲線與X軸幾乎接近平行，Shannon指數(shù)幾乎達(dá)到上限。說明在當(dāng)前測序水平下，樣品中的細(xì)菌群落多樣性已能夠充分覆蓋。由表4亦可知，從3種紅曲米中共獲得234 866條細(xì)菌有效序列。序列按97%相似度水平進(jìn)行OTU聚類劃分，3種紅曲米樣本中共獲得6848個(gè)OTU，其中紅曲米樣品WX-1中細(xì)菌OTU數(shù)量最多，為2 961個(gè)，種群多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)最高，為2.564；而紅曲米樣品WX-2中細(xì)菌菌群的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)最高，分別為234 092.1、61 749.15。說明紅曲米樣品WX-1細(xì)菌群落的物種種類最豐富；紅曲米樣品WX-2細(xì)菌群落數(shù)目最多。

2.4 武宣地區(qū)3種紅曲米細(xì)菌不同分類水平上的豐度分析

在門分類水平上，從3種紅曲米樣品共檢測出19個(gè)細(xì)菌門。將相對豐度＞1%的菌門定義為優(yōu)勢細(xì)菌門，優(yōu)勢細(xì)菌門見圖4。由圖4可知，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）為3種紅曲米樣品的共有優(yōu)勢菌門。其中變形菌門（Proteobacteria）占比最高（49.3%～97.5%），為最主要的優(yōu)勢菌門。厚壁菌門（Firmicutes）在紅曲米樣品WX-2中占據(jù)較大比例（50.64%），為紅曲米樣品WX-2中的主要優(yōu)勢菌門。結(jié)果表明，3種紅曲米樣品中所含物種基本相似，但其細(xì)菌菌門結(jié)構(gòu)存在一定差異。

圖4 基于門水平武宣地區(qū)3種紅曲米樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of bacterial community structure of three kinds of red kojic rice samples from Wuxuan area based on phyla level

在屬分類水平上，武宣地區(qū)3種紅曲米樣品中共檢出239個(gè)屬，為了展示效果，一般只顯示相對豐度前25的物種分類，前25種菌屬相對豐度熱圖見圖5。將菌屬數(shù)量經(jīng)過lg（n+1）標(biāo)準(zhǔn)化后大于3的菌屬定義為優(yōu)勢菌株。

由圖5可知，伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、未分類細(xì)菌（unclassified）為3種紅曲米樣品的共有優(yōu)勢菌屬。紅曲米樣品WX-1中優(yōu)勢菌屬有13種，說明WX-1樣品細(xì)菌種群復(fù)雜程度高，紅曲米樣品WX-2中優(yōu)勢菌屬有醋菌屬（Acetobacter）、小球菌屬（Pediococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus），均為產(chǎn)酸菌株。而紅曲米樣品WX-3中細(xì)菌相對豐度和細(xì)菌種群復(fù)雜程度都較低。

對紅曲米細(xì)菌屬豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化層次聚類后得到相對豐度（0～4），數(shù)字越大表示該菌屬相對含量越高。

圖5 武宣地區(qū)3種紅曲米細(xì)菌屬相對豐度熱圖Fig.5 Heatmap of relative abundance of bacteria genera of three kinds of red kojic rice samples from Wuxuan area

在屬分類水平上，紅曲米中主要產(chǎn)酸菌屬有克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳酸桿菌屬（Franconibacter）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、小球菌屬（Pediococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus），不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium），它們的產(chǎn)酸機(jī)理[18-21]見圖6。3種紅曲米中產(chǎn)酸菌株在種類和相對豐度上均有差異，其中，紅曲米樣品WX-2產(chǎn)酸菌株種類最多，且菌株對應(yīng)的相對豐度最高。而紅曲米WX-2樣品發(fā)酵而成的紅曲柿酒的總酸、揮發(fā)性成分均高于其他兩種紅曲柿酒，說明紅曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與紅曲柿酒中酸類物質(zhì)的形成緊密相關(guān)。

圖6 3種紅曲米中產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸機(jī)理Fig.6 Acid-producing mechanism of acid-producing strains in three kinds of red kojic rice samples

3 結(jié)論

該研究以武宣地區(qū)3種紅曲米作為發(fā)酵劑釀造的紅曲柿酒總酸和揮發(fā)酸含量差異顯著（P＜0.05），且揮發(fā)性酸類物質(zhì)組成存在較大差異，其中，紅曲米樣品WX-2制成的紅曲柿酒揮發(fā)性酸類物質(zhì)含量最高（10.0%）。應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)檢測3種武宣紅曲米細(xì)菌多樣性，研究發(fā)現(xiàn)紅曲米樣品WX-1細(xì)菌群落中物種的種類最豐富，紅曲米樣品WX-2細(xì)菌群落中物種數(shù)目最多。從3種紅曲米樣品共檢測出19個(gè)細(xì)菌門，239個(gè)細(xì)菌屬，共有優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）；共有優(yōu)勢菌屬為伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella），WX-2樣品中優(yōu)勢菌屬還有醋菌屬（Acetobacter）、小球菌屬（Pediococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus），均為產(chǎn)酸菌株。表明紅曲米細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與紅曲柿酒酸類物質(zhì)的形成緊密相關(guān)。