miR-593-5p調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的機(jī)制

鐘騰猛 黃俊玲 李廣志 陸炳站

肝癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年中國(guó)肝癌新增病例約36.48萬(wàn)例(男26.89萬(wàn)例，女9.59萬(wàn)例)，死亡病例約31.88萬(wàn)例(男23.35萬(wàn)例，女8.53萬(wàn)例)[2]。肝癌預(yù)后差，患者5年內(nèi)生存率不足15%，已成為全球第二大常見(jiàn)的癌癥死亡原因[3]。因此，迫切需要對(duì)肝癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行全面闡明。微小RNAs(MicroRNAs，miRNAs/miRs)是一種保守的非編碼小RNAs，通過(guò)靶向多個(gè)分子參與調(diào)控基因表達(dá)[4]，miRNAs失調(diào)是包括癌癥在內(nèi)的多種病理狀態(tài)的生物標(biāo)志物。研究表明，miRNAs的異常表達(dá)參與多種人類癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程[5,6]。微小RNA-593-5p(MicroRNA-593-5p，miR-593-5p)在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)量與胃癌患者臨床病理特征密切相關(guān)，miR-593-5p過(guò)表達(dá)可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖[7]。miR-593通過(guò)調(diào)控PLK1基因表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并發(fā)揮抑癌基因作用[8]。在人胃癌MGC-803細(xì)胞中上調(diào)miR-593-5p表達(dá)會(huì)抑制裸鼠移植瘤模型胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，侵襲、轉(zhuǎn)移[9]。本研究以肝癌細(xì)胞為對(duì)象，利用qPCR、MTT及Transwell小室法等技術(shù)檢測(cè)miR-593-5p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并進(jìn)一步探索其可能的分子機(jī)制，為肝癌的臨床診治提供潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2、SMMC-7721、Huh7和正常人肝細(xì)胞HL7702購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胰酶、MTT、二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TRIzol、Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司，miR-593-5p、anti-miR-593-5p、pcDNA-PHF10購(gòu)自廣州銳博生物有限公司，RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、磷脂酰肌醇-3激酶(Phospoinositide 3-kinase，PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自博士德生物公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，其他生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。ABI 7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Hep3B、HepG2、SMMC-7721、Huh7和HL7702細(xì)胞復(fù)蘇后，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%～80%，加入胰酶消化傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SMMC-7721細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板。待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑖?yán)格按照Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書步驟，將miR-593-5p、anti-miR-593-5p及各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入SMMC-7721細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞備用。

1.3 qPCR檢測(cè)miR-593-5p和PHF10 mRNA表達(dá) 細(xì)胞加入TRIzol試劑充分提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以制備的cDNA為模板，利用qPCR檢測(cè)miR-593-5p和PHF10 mRNA水平。miR-593-5p上游引物序列為5’-CACCAGCCAGGCATTGCTC-3’下游引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’； PHF10上游引物序列為5’-TCCAGATTTAGAGCGACGAGA-3’，下游引物序列為5’-TGCGCAATGCTGTTAAGCCT-3’；U6上游引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列為5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-593-5p和PHF10 mRNA表達(dá)量。

1.4 MTT檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞增殖 SMMC-7721細(xì)胞使用胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml，接種于96孔細(xì)胞板。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每孔加入100 μl 5 mg/ml MTT溶液，37℃反應(yīng)4 h，棄上清液，每孔加入200 μl DMSO，37℃搖床反應(yīng)10 min，于酶標(biāo)儀讀取每孔細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD490nm值)，細(xì)胞OD490nm值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)目的蛋白表達(dá) 細(xì)胞中加入磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffered saline，PBS)充分洗滌，使用RIPA裂解液，冰浴條件下裂解30 min，提取總蛋白。加入緩沖液，沸水處理10 min，使蛋白變性，吸取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，使用5%脫脂奶粉室溫條件下封閉1 h，用1∶1 000稀釋的一抗4℃封閉過(guò)夜，用1∶5 000稀釋的二抗室溫反應(yīng)2 h，ELC發(fā)光液曝光顯色，以GAPDH為參照，分析蛋白條帶灰度值。

1.6 Transwell小室法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲 在SMMC-7721細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，吸取100 μl接種于Transwell上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃孵育24 h，之后用棉簽擦除多余細(xì)胞，甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。在SMMC-7721細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，將100 μl Matrigel膠與500 μl無(wú)血清培養(yǎng)基充分混合，吸取50 μl 于Transwell上室，37℃靜置3～4 h。其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因 通過(guò)starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)網(wǎng)站預(yù)測(cè)出PHF10的3’非編碼區(qū)域(3’untranslated region，3’UTR)中含有與miR-593-5p互補(bǔ)的核苷酸序列。分別構(gòu)建野生型PHF10(PHF10-WT)、突變型PHF10(PHF10-MUT)3’UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并與miR-593-5p共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h 后，測(cè)定細(xì)胞雙熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞系中miR-593-5p的表達(dá)量 qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞HL7702相比，人肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2、SMMC-7721、Huh7中miR-593-5p表達(dá)量顯著減少(P<0.05)，PHF10 mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。其中，SMMC-7721細(xì)胞中miR-593-5p表達(dá)量差異最顯著，因此后續(xù)研究選擇SMMC-7721細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。見(jiàn)表1。

表1 肝癌細(xì)胞系中miR-593-5p的表達(dá)量

2.2 miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 在SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-593-5p，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-593-5p過(guò)表達(dá)較miR-NC組顯著降低24 h、48 h和72 h的細(xì)胞活性(P<0.05)。Western blot檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-593-5p過(guò)表達(dá)較miR-NC組顯著減少CyclinD1蛋白表達(dá)量，增加p21蛋白表達(dá)量，二者均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

圖1 miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞遷移及侵襲的影響 Transwell小室法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示，miR-593-5p過(guò)表達(dá)較miR-NC組大幅減少遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-593-5p過(guò)表達(dá)較miR-NC組增加E-cadherin蛋白表達(dá)量，降低Vimentin蛋白表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞遷移及侵襲的影響

2.4 miR-593-5p靶向調(diào)控PHF10表達(dá) starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-593-5p下游靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHF10的3’UTR中部分堿基可與miR-593-5p互補(bǔ)配對(duì)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，miR-593-5p顯著降低野生型PHF10(PHF10-WT)熒光素酶相對(duì)活性(P<0.05)，而不影響突變型PHF10(PHF10-MUT)熒光素酶相對(duì)活性。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，anti-miR-593-5p組PHF10蛋白表達(dá)量顯著高于anti-miR-NC組，miR-593-5p組PHF10蛋白表達(dá)量顯著低于miR-NC組(P<0.05)。見(jiàn)表4、5，圖3、4。

圖2 miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 miR-593-5p負(fù)向調(diào)控PHF10表達(dá)

圖3 PHF10的3’UTR中含有與miR-593-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

圖4 miR-593-5p負(fù)向調(diào)控PHF10的表達(dá)

2.5 PHF10過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用 與miR-NC組相比，miR-593-5p過(guò)表達(dá)顯著影響SMMC-7721細(xì)胞活性、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)和CyclinD1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)，結(jié)果同2.2和2.3。與miR-593-5p+pcDNA組相比，miR-593-5p和pcDNA-PHF10共轉(zhuǎn)染入SMMC-7721細(xì)胞明顯提高24 h、48 h和72 h的細(xì)胞活性、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1和Vimentin蛋白表達(dá)量，降低E-cadherin蛋白表達(dá)量，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖5。

表6 PHF10過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用

圖5 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6 PHF10過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與miR-NC組相比，miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白表達(dá)量無(wú)顯著影響，而明顯降低p-PI3K和p-Akt水平(P<0.05)。與miR-593-5p+pcDNA組相比，miR-593-5p和pcDNA-PHF10共轉(zhuǎn)染對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白水平無(wú)明顯影響，顯著增加p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)量(P<0.05)。見(jiàn)表7，圖6。

3 討論

miRNAs是一類長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小型非編碼RNA，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，miRNAs堿基在其靶信使RNA(mRNA)的3，UTR具有特定結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)[10]。miRNAs參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、存活、侵襲和遷移等多種生物學(xué)過(guò)程[11-13]。既往研究表明，miR-593-5p與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如膠質(zhì)瘤[14]，舌鱗狀細(xì)胞癌[15]，口腔鱗狀細(xì)胞癌[16]等。miR-593-5p在原發(fā)胃腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的患者中表達(dá)下調(diào)[17]。miR-593-5p在胃癌患者和胃癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，miR-593-5p與胃癌患者腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；在體外，miR-593-5p抑制SGC-7901和MGC-803細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并在G0/G1期抑制細(xì)胞周期；在體內(nèi)，miR-593-5p也抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18]。miR-593在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)量低于正常食管上皮細(xì)胞，miR-593模擬物顯著抑制食管癌細(xì)胞增殖，可能發(fā)揮腫瘤抑制功能[19]。本研究中，miR-593-5p在肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2、SMMC-7721、Huh7中表達(dá)顯著下調(diào)，與在胃癌、食管癌[18,19]等的表達(dá)情況一致。miR-593-5p過(guò)表達(dá)顯著降低24 h、48 h和72 h的細(xì)胞活性、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)，顯著減少CyclinD1、Vimentin蛋白表達(dá)量，增加p21、E-cadherin蛋白表達(dá)量。表明miR-593-5p過(guò)表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，miR-593-5p在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。

表7 PHF10過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖6 PHF10過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-593-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

PHF10是PBAF的一個(gè)重要亞基，對(duì)神經(jīng)分化、增殖和凋亡的控制至關(guān)重要[20]。根據(jù)報(bào)道，PHF10在多種惡性腫瘤中發(fā)揮癌基因作用，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[21]。PHF10高表達(dá)與腫瘤患者不良預(yù)后有關(guān)[22]，但目前關(guān)于PHF10在腫瘤中的作用機(jī)制仍知之甚少。本實(shí)驗(yàn)中，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，人肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2、SMMC-7721、Huh7中PHF10 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，提示PHF10可能參與肝癌進(jìn)程。資料顯示，PI3K/Akt信號(hào)通路在肝癌進(jìn)程中扮演著重要角色[23]。阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt表達(dá)可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力[25]。然而，miR-593-5p是否可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路而調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲尚未可知。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-593-5p過(guò)表達(dá)明顯降低p-PI3K和p-Akt蛋白水平，推測(cè)miR-593-5p影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲可能與介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

為探討PHF10與PI3K/Akt信號(hào)通路是否是miR-593-5p調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用生物學(xué)信息預(yù)測(cè)與雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)PHF10是miR-593-5p的靶基因，上調(diào)或下調(diào)miR-593-5p表達(dá)明顯調(diào)控PHF10蛋白水平，進(jìn)一步證明miR-593-5p直接靶向調(diào)控PHF10表達(dá)。PHF10過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-593-5p過(guò)表達(dá)抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用，以及逆轉(zhuǎn)了miR-593-5p過(guò)表達(dá)抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的作用。據(jù)此得出，miR-593-5p過(guò)表達(dá)直接靶向PHF10并抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活，從而發(fā)揮對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-593-5p在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-593-5p通過(guò)靶向PHF10調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過(guò)程。