MALAT1在腸癌中的表達(dá)、生物學(xué)功能及其與患者預(yù)后關(guān)系

姚坤厚,張軍杰,王朝陽,秦長江

河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普外科,河南 開封 475000

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(MALAT1)定位于人染色體11q13,全長約8 500 bp,最初發(fā)現(xiàn)其高度特異性表達(dá)于肺腺癌,干擾其表達(dá)后可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞遷移能力,并由此得以命名[1]。MALATl是較早發(fā)現(xiàn)的一類與轉(zhuǎn)錄本加工有關(guān)的長鏈非編碼RAN(LncRNA)。2003年JI及其同事[1]在對非小細(xì)胞肺癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)移患者的組織中,MALAT1 表達(dá)水平明顯高于非轉(zhuǎn)移組織。此后的功能學(xué)研究[2]顯示,MALAT1 由DNA 轉(zhuǎn)錄后的3’端加工而來,其主要位于剪切斑點(diǎn)附近。MALAT1可與絲氨酸/精氨酸(Ser/Arg)剪接因子間存在相互作用,并還通過調(diào)控剪接因子在剪接斑點(diǎn)中的分布和磷酸化水平,使mRNA 前體的選擇性剪接模式發(fā)生改變從而達(dá)到調(diào)控轉(zhuǎn)錄本剪接模式的分子生物學(xué)功能。MALAT1被認(rèn)為是與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要LncRNA。在肺癌轉(zhuǎn)移病灶中,MALAT1的表達(dá)水平顯著增高,因而推測其與肺癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步采用基因敲除技術(shù)研究顯示,MALATl可對轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,如螺旋重復(fù)膠原蛋白1(CTHRCl)、真核細(xì)胞伴侶素(CCT)、透明質(zhì)酸調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)受體(HMMR)、分節(jié)因子1(RODl),而這些基因?qū)?xì)胞的遷移有重要作用。但關(guān)于MALAT1在腸癌組織中的表達(dá)情況及其與腸癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。近來研究表明,MALAT1在多種不同類型的惡性腫瘤中均有異常表達(dá),其中包括結(jié)直腸癌[3-4]。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)也已表明,MALAT1在結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5],然而,MALAT1參與調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究,以期更深入全面地理解該RNA 在結(jié)直腸癌中發(fā)揮功能的機(jī)理,為結(jié)直腸癌后期治療新方案的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床組織樣本

選取病理學(xué)確診的腸癌患者30例,留取患者的癌組織和遠(yuǎn)癌的正常組織。

1.2 細(xì)胞和主要試劑

于美國ATCC 購買人腸癌細(xì)胞系(SW620、LOVO、HCT116)和正常人腸上皮細(xì)胞系(NCM460),培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)傳代。

1.3 MALAT1表達(dá)水平檢測

對30例患者的癌組織和遠(yuǎn)癌的正常組織首先采用RNA 提取試劑盒提取總RNA,并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法,檢測患者癌組織和遠(yuǎn)癌正常組織中MALAT1 的表示水平,比較MALAT1 在腸癌患者癌組織及遠(yuǎn)癌正常組織中是否存在表達(dá)差異。將培養(yǎng)好的人腸癌及正常腸上皮細(xì)胞系進(jìn)行總RNA 提取,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 進(jìn)行測定上述細(xì)胞系中MALAT1的差異表達(dá)情況,評價(jià)腸癌細(xì)胞系和正常腸上皮細(xì)胞系中MALTA1是否存在差異表達(dá)。

1.4 下調(diào)MALAT1表達(dá)

由深圳吉瑪公司合成針對MALAT1的小干擾RNA,采用脂質(zhì)體(lipo2000)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至人腸癌細(xì)胞系(SW620、LOVO、HCT116)和人正常腸上皮細(xì)胞系(NCM460),然后采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后MALAT1的表達(dá)水平,檢測下調(diào)其表達(dá)效果。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

組織或細(xì)胞在Life Technologies 公司的Trizol試劑下裂解,經(jīng)氯仿混合震蕩離心,再經(jīng)異丙醇沉淀,提取的總RNA 放置于-80 °C冰箱保存。經(jīng)過定量,利用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并稀釋待用。利用Toyobo公司的SYBR GREEN MASTER MIX,在ABI 7500 96孔實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行實(shí)驗(yàn),定量檢測MALAT1的表達(dá)情況。

1.6 增殖和遷移能力

檢測MALAT1對腸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響,在腸癌細(xì)胞中采用小干擾RNA 技術(shù)下調(diào)MALAT1表達(dá),采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法判斷下調(diào)MALAT1前后細(xì)胞增殖能力變化,應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲力實(shí)驗(yàn),探討下調(diào)MALAT1前后細(xì)胞遷移能力變化。

1.7 生存分析

在TCGA 數(shù)據(jù)庫中[6-7],根據(jù)MALAT1 中位表達(dá)水平分為高表達(dá)組(≥ 中位表達(dá)水平)和低表達(dá)組,logrank檢驗(yàn)分析高、低表達(dá)組總生存和無疾病進(jìn)展生存是否存在差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用Stata 12.0軟件完成。定量數(shù)據(jù)均采用±s表示,兩組之間比較采用配對t檢驗(yàn)或成組t檢驗(yàn),生存分析采用logran 檢驗(yàn),以P<0.05 判斷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸癌患者癌組織與遠(yuǎn)癌組織中MALAT1的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測了30對人配對結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中MALAT1 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示相比正常組織,MALAT1 在46.7%(14/30)的結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)增高(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見圖1A。Oncomine數(shù)據(jù)庫中,結(jié)直腸癌患者癌組織中MLAT1表達(dá)水平高于癌旁組織,見圖1B。

2.2 MALAT1 在腸癌及正常腸上皮細(xì)胞系中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測腸癌細(xì)胞系及正常腸上皮細(xì)胞株中MALAT1的相對表達(dá)水平,結(jié)果顯示,腸癌細(xì)胞系中(SW620、LOVO、HCT116)MALAT1的相對表達(dá)量顯著高于正常人腸上皮細(xì)胞(NCM460),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測MALAT1在腸癌組織中的表達(dá)情況

圖2 MALAT1在腸癌及正常腸上皮細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 抑制MALAT1表達(dá)可抑制SW620細(xì)胞的遷移與侵襲能力

圖3 抑制MALAT1表達(dá)對SW620細(xì)胞的遷移與侵襲能力的影響

利用從吉瑪公司設(shè)計(jì)的能夠特異性沉默MALAT1的siRNA 轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞,在48 h后,先收集細(xì)胞抽提總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測,MALAT1 具有很好的沉默效果(見圖3A)。再次轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞,在24 h后消化細(xì)胞,分別鋪入6孔板和24孔板進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和小室侵襲實(shí)驗(yàn),48 h 后,分別拍照劃痕寬度結(jié)果和小室染色結(jié)果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),抑制MALAT1 表達(dá)可明顯抑制SW620細(xì)胞的劃痕遷移與小室侵襲能力(見圖3B、圖3C)。

2.4 MALAT1共表達(dá)分析

在結(jié)直腸癌組織中,與MALAT1共表達(dá)基因?yàn)锳NKRD11,THRAP3,C10orf118等,其共表達(dá)聚類分析見圖4。

圖4 MALAT1共表達(dá)基因聚類分析

2.5 MALAT1 在腸癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后關(guān)系

MALAT1表達(dá)的高低患者總生存(OS)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.2,P=0.35),見圖5。而高低表達(dá)組無疾病進(jìn)展生存(DFS)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.6,P=0.023),MALAT1高表達(dá)組DFS顯著低于低表達(dá)組,見圖6。

圖5 MALAT1在腸癌中的表達(dá)及其與患者總生存(OS)關(guān)系

圖6 MALAT1在腸癌中的表達(dá)及其與無疾病進(jìn)展生存(DFS)關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率居世界常見惡性腫瘤第3位,結(jié)直腸癌在我國居惡性腫瘤致死因素的第4位[8],嚴(yán)重危害人類健康。隨著環(huán)境和飲食劇變,在我國,結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分布具有以下特點(diǎn):男性高于女性,城市高于農(nóng)村,發(fā)病率和死亡率均隨年齡增長而上升。手術(shù)后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后差的主要原因[9]。

近年來,隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的不斷發(fā)展,眾多新的轉(zhuǎn)錄序列被逐漸發(fā)現(xiàn),研究[10]發(fā)現(xiàn),在人和大多數(shù)哺乳動(dòng)物基因組中有超過90%的DNA序列是被轉(zhuǎn)錄并生成或短或長的非編碼RNA,這類RNA 缺乏啟動(dòng)子序列,因而不能進(jìn)一步翻譯成蛋白質(zhì)。其中 LncRNA 是一類長度大于200 nt的非編碼RNA 轉(zhuǎn)錄本,曾被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“垃圾”。然而隨著研究的深入,越來越多的報(bào)道認(rèn)為LncRNA 可參與調(diào)控許多重要的生物學(xué)過程,包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡、多能干細(xì)胞重編程等。LncRNA 具有類型多、數(shù)量多和作用機(jī)制多等特點(diǎn)[11-12]。隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的LncRNA 被陸續(xù)發(fā)現(xiàn),但目前大部分LncRNA 確切生物學(xué)功能及作用機(jī)制并不清楚[13]。LncRNA 可以通過招募相關(guān)蛋白,改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)控某個(gè)或某些基因表達(dá),也可以通過順式或反式機(jī)制來沉默或激活一個(gè)基因或基因家族甚至整條染色體。如LncRNA Xist介導(dǎo)的X 染色體失活,Xist轉(zhuǎn)錄后可招募多梳蛋白復(fù)合體(Polycomb repressive complex 2,PRC2) 并可覆蓋X 染色體導(dǎo)致X 染色體發(fā)生大量組蛋白H3K27甲基化,從而導(dǎo)致X 染色體轉(zhuǎn)錄沉默,最終造成其失活。

LncRNA 廣泛存在于真核動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組中。它們具有mRNA 樣結(jié)構(gòu),但缺乏開放的閱讀框,不編碼蛋白質(zhì)[14]。研究[15,16]表明,LncRNA 可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理過程,包括X 染色體沉默、基因組印記及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活及干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)?。近年?隨著研究的深入,已證實(shí)長鏈非編碼RNA 與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可作為預(yù)測腫瘤進(jìn)展的新型生物標(biāo)志物。

本研究采用生物信息學(xué)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析MALAT1在腸癌中的表達(dá)水平、生物學(xué)功能及其與患者預(yù)后的關(guān)系。qPCR 結(jié)果顯示,相比正常組織,MALAT1在腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。同時(shí) Oncomine數(shù)據(jù)庫中,結(jié)直腸癌患者癌組織中MLAT1表達(dá)水平高于癌旁組織。腸癌細(xì)胞系中(SW620、LOVO、HCT116) MALAT1的相對表達(dá)量顯著高于正常人腸上皮細(xì)胞(NCM460)。無論從患者腫瘤組織中、腸癌細(xì)胞系還是數(shù)據(jù)庫中,MALAT1在癌組織中的表達(dá)水平均明顯升高,說明MALAT1在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。功能學(xué)研究顯示,抑制MALAT1 表達(dá)可明顯抑制SW620細(xì)胞的劃痕遷移與小室侵襲能力,提示MALAT1的表達(dá)與腸癌的侵襲能力和增殖能力有關(guān)。預(yù)后分析提示,MALAT1 高低表達(dá)組患者OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.2,P=0.35),而高低表達(dá)組DFS 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.6,P=0.023),MALAT1高表達(dá)組總生存期顯著低于低表達(dá)組。

因此,MALAT1 在腸癌組織中表達(dá)水平明顯上調(diào),并與腸癌細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)有關(guān)。高表達(dá)患者預(yù)后較差,并有望成為腸癌預(yù)后分子標(biāo)志物和靶向治療的新靶點(diǎn)。