牡蠣殼源L-天冬氨酸螯合鈣的結(jié)構(gòu)表征及特性研究?

王 真， 姜?dú)q歲， 張 帆， 王潤(rùn)芳， 馮 雪， 汪 瑞， 李詩(shī)洋， 趙元暉

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

牡蠣(Crassostreagigas)作為第一批被衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食同源食品，不僅其肉質(zhì)味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，而且其殼也是重要的中藥材，具有重鎮(zhèn)安神、軟堅(jiān)散結(jié)、潛陽(yáng)補(bǔ)陰的功效[1]。中國(guó)的牡蠣產(chǎn)量居世界首位，2017年牡蠣的海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá) 487.94×104t，約占貝類(lèi)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的 34%，較 2016 年幅度增長(zhǎng) 4.70%，伴隨而生的是大量的占牡蠣整體質(zhì)量60%以上的牡蠣殼[2-3]。除了部分用作藥材和土壤改良劑以及用于石灰生產(chǎn)外，大多數(shù)牡蠣殼被填埋、堆肥和向海洋傾倒等，引起很多環(huán)境問(wèn)題。因此，如何把廢棄牡蠣殼資源化，備受?chē)?guó)內(nèi)外研究者關(guān)注[4]。

牡蠣殼中含有大量的碳酸鈣，質(zhì)量分?jǐn)?shù)占90%以上[5]。近年來(lái)不少學(xué)者研究利用廢棄牡蠣殼制備各種鈣制劑，為牡蠣殼的高值化利用提供了一些新的途徑[6-8]。目前，對(duì)于氨基酸螯合鈣的結(jié)構(gòu)和理化特性研究不多，大部分僅局限于螯合物的制備，紅外和紫外分析等[9]。本試驗(yàn)基于L-天冬氨酸(L-Aspartate, L-Asp)是酸性氨基酸，且作為鈣的載體及鈣結(jié)合蛋白的重要組成部分，能被細(xì)胞膜識(shí)別，通過(guò)特異性載體蛋白鈣通道在小腸絨毛膜上皮進(jìn)行主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，可在加熱攪拌條件下直接與牡蠣殼粉反應(yīng)生成L-天冬氨酸螯合鈣[8]，經(jīng)過(guò)前期的螯合條件優(yōu)化后，利用掃描電鏡、紅外光譜和質(zhì)譜等對(duì)L-天冬氨酸螯合鈣進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并研究其X射線衍射(X-ray diffraction, XRD)、差示掃描量熱(Differential scanning calorimetry, DSC)、熱重(Thermogravimetry, TG)等指標(biāo)及體外穩(wěn)定性等特點(diǎn)，以期為深入開(kāi)發(fā)和研究L-天冬氨酸螯合鈣提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

L-天冬氨酸螯合鈣(實(shí)驗(yàn)室自制)；胃蛋白酶(3 000 U/g，索萊寶公司)；胰蛋白酶(50 kU/g，索萊寶公司)，溴化鉀(光譜純)和無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、二硫腙、茚三酮、硫化鈉(均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

YK高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 山東益康中藥器械有限公司；CV-600恒溫水浴鍋(上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BD-126W冰箱(青島海爾電器集團(tuán))；PHS-3E型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；JD500-2型電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司)；傅立葉變換紅外光譜儀FT-IR-4100(佳司科上海貿(mào)易有限公司)；FW-5A布魯克紅外用壓片機(jī)(天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司)； HF-2B紅外壓片模具(天津拓普儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；Tescan-vega3掃描電子顯微鏡(德國(guó)Bruker公司)；IB-3離子鍍膜儀(日本Eiko公司)；三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀1290 Infinity II UHPLC/6460 QqQ MS(美國(guó)Agilent科技公司)；AA-6300C石墨爐原子吸收分光光度計(jì)(日本島津公司)；DSC250差示掃描量熱儀(美國(guó)TA儀器公司); TG209F3熱重分析儀(德國(guó)耐馳儀器制造有限公司)；D8 Advance X-射線衍射儀(德國(guó)Bruker公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 L-天冬氨酸螯合鈣的制備[10]根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的條件，取清洗干凈的烘干牡蠣殼→用榔頭敲成碎塊狀→將牡蠣殼碎塊放入高速萬(wàn)能粉碎機(jī)中，調(diào)至一檔粉碎→粉碎后的殼粉過(guò)300～200目篩→將L-天冬氨酸和過(guò)篩牡蠣殼粉按摩爾比2∶1配料→加5倍氨基酸和殼粉總質(zhì)量的蒸餾水→加熱至50 ℃→調(diào)節(jié)pH至5.0→恒溫磁力攪拌90 min→趁熱過(guò)濾→減壓濃縮至粘稠狀→乙醇沉淀→離心收集沉淀→冷凍干燥得到L-天冬氨酸螯合鈣。

1.2.2 L-天冬氨酸螯合鈣的定性檢驗(yàn)[11]取1～3 g樣品，加入50 mL無(wú)水乙醇，攪拌靜置一段時(shí)間后過(guò)濾，向?yàn)V液中加入二硫腙試劑。若溶液變紅，說(shuō)明樣品中可能存在游離金屬離子，繼續(xù)用乙醇洗滌，直至二硫腙檢測(cè)不變色；之后再加入5滴茚三酮試劑，電爐加熱沸騰2～3 min。若溶液不變色，說(shuō)明樣品中無(wú)游離氨基酸；若溶液變?yōu)樗{(lán)紫色，需用無(wú)水乙醇繼續(xù)分離純化，直至完全去除；之后加入過(guò)量硫化鈉，靜置一段時(shí)間。若有大量白色沉淀產(chǎn)生，說(shuō)明硫離子置換出螯合物中的鈣離子，過(guò)濾去掉沉淀，收集濾液；向?yàn)V液中加入5滴茚三酮試劑，電爐加熱沸騰2～3 min。若溶液變?yōu)樗{(lán)紫色，證明硫離子置換出螯合物里的鈣后，螯合態(tài)的氨基酸變?yōu)橛坞x氨基酸。

1.2.4 L-天冬氨酸螯合鈣的紅外光譜分析 取適量的L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣于瑪瑙研缽，在紅外烤燈下分別與少量干燥的光譜純KBr充分研磨，使其粒度在2.5 μm以下，將混合粉末裝入壓片模具，于紅外用壓片機(jī)上抽氣加壓，壓力為900 kg/cm2，維持1.5 min，卸掉壓力得到透明的KBr薄片，迅速放入樣品室，使用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1區(qū)間掃描，得到紅外光譜圖[5]。

1.2.5 L-天冬氨酸螯合鈣的一二級(jí)質(zhì)譜分析 取少量經(jīng)過(guò)純化的L-天冬氨酸螯合鈣樣品溶于超純水中，采用正離子模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，設(shè)置電壓175.0 V，掃描范圍m/z為100～1 000，水∶甲醇為7∶3 ，二級(jí)質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)電離(CID)為碰撞能量值55%[13-14]。

1.2.6 L-天冬氨酸螯合鈣的XRD分析 采用X-射線衍射儀測(cè)定牡蠣殼粉、L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的結(jié)晶性能[15]。X-衍射條件為：Cu Kα輻射源管壓40 kV，管流40 mA，掃描速度0.2°/s，步長(zhǎng)0.02°，接受狹縫0.2 mm，用X射線在2θ=10°～80°范圍內(nèi)測(cè)定樣品的X射線衍射強(qiáng)度。

1.2.8 L-天冬氨酸螯合鈣的TG分析 在氮?dú)夥諊羞M(jìn)行測(cè)定，溫度范圍為25～800 ℃，升溫速率10 ℃/min[17]。

1.2.9 L-天冬氨酸螯合鈣的穩(wěn)定性分析[18-19]

1.2.9.1 L-天冬氨酸螯合鈣的熱穩(wěn)定性分析 將L-天冬氨酸螯合鈣配成0.5%的溶液，分別置于60、70、80、90和100 ℃水浴中加熱1 h，冷卻至室溫后用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定游離鈣離子含量，每組樣品平行測(cè)定3次。螯合物的熱穩(wěn)定性用鈣保留率表示，下同。

鈣保留率 =(處理后結(jié)合鈣量 / 初始總鈣量)×100%。

在具體工程數(shù)據(jù)管理中，數(shù)據(jù)管理指標(biāo)可根據(jù)花溪區(qū)紅巖水庫(kù)往年記錄的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)指標(biāo)為核心，通過(guò)移民工程數(shù)據(jù)管理中的位置管理、數(shù)據(jù)拓?fù)潢P(guān)系管理建立對(duì)應(yīng)指標(biāo)數(shù)據(jù)。

1.2.9.2 L-天冬氨酸螯合鈣的酸堿穩(wěn)定性分析 將L-天冬氨酸螯合鈣配成0.5%的溶液，然后用濃鹽酸和濃氫氧化鈉溶液迅速將溶液pH調(diào)至2.0～8.0，靜置2 h后，用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定游離鈣離子含量，每組樣品平行測(cè)定3次。螯合物的酸堿穩(wěn)定性用鈣保留率表示。

1.2.9.3 L-天冬氨酸螯合鈣的模擬胃腸消化穩(wěn)定性分析 將L-天冬氨酸螯合鈣配成0.5%的溶液，先經(jīng)胃蛋白酶酶解1 h(pH=2.0, 37 ℃，加酶量為2 000 U/g)，再經(jīng)胰蛋白酶酶解1 h(pH=8.0, 37 ℃，加酶量為2 000 U/g)，酶解后100 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫后用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定游離鈣含量，每組樣品平行測(cè)定3次。螯合物的模擬消化穩(wěn)定性用鈣保留率表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS進(jìn)行顯著性分析，以P< 0.05表示差異顯著。利用Origin 2018軟件作圖。紅外光譜數(shù)據(jù)采用OMNIC處理和分析，XRD數(shù)據(jù)采用MDIJade6.0軟件進(jìn)行處理和分析。所有處理均設(shè)置3次重復(fù)，以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-天冬氨酸螯合鈣的定性檢驗(yàn)

采用試驗(yàn)中的檢測(cè)方法，未檢測(cè)到螯合物中游離的鈣離子和氨基酸。之后加入過(guò)量硫化鈉后有大量白色沉淀產(chǎn)生，表明樣品中有大量的鈣元素；再加入茚三酮，將其置于電爐上加熱一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，溶液由黃綠色變?yōu)樗{(lán)紫色，證明螯合鈣樣品中氨基酸的存在。這一結(jié)果與劉閃等[9]的研究結(jié)果一致。

2.2 L-天冬氨酸螯合鈣的表面結(jié)構(gòu)分析

采用掃描電子顯微鏡對(duì)L-天冬氨酸螯合鈣進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)表征，分別將樣品放大200和1 200倍，掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1(a)中可以看出，螯合物在放大200倍視野下，顆粒整體分布較為均勻，呈現(xiàn)團(tuán)塊聚集狀，有細(xì)小顆粒附著其上。這種聚集狀可能是牡蠣殼中的鈣與L-天冬氨酸中的氨基氮原子和羧基氧原子相互作用，多個(gè)氨基酸之間通過(guò)鈣離子交聯(lián)相接，形成較大的顆粒，且顆粒間可能相互吸引從而形成聚集[20]。圖1(b)中顯示，螯合鈣的表面粗糙，而且有較多白色晶體吸附，這可能是一些鈣結(jié)晶。付文雯[21]觀察了牛骨膠原多肽螯合鈣的掃描電鏡圖片，也發(fā)現(xiàn)了表面“鑲嵌”的白色晶體，因而推測(cè)在L-天冬氨酸和殼粉中鈣的螯合反應(yīng)過(guò)程中，還可能存在一定的吸附作用。

((a)螯合鈣, 放大200×; (b) 螯合鈣, 放大1 200×。(a)Chelated calcium, 200×; (b) Chelated calcium, 1200×.)

2.3 L-天冬氨酸螯合鈣的紅外光譜分析

L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的傅里葉紅外光譜測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)比L-天冬氨酸的紅外光譜圖，可以發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸與牡蠣殼粉經(jīng)水浴螯合后，整體光譜波形出現(xiàn)了明顯的移動(dòng)。在特征區(qū)，氨基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的3 031.07 cm-1處的寬吸收峰藍(lán)移至3 142.92 cm-1，說(shuō)明L-天冬氨酸中的N-H鍵發(fā)生化學(xué)變化；同樣地，在指紋區(qū)，羰基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的吸收峰1 515.29 cm-1紅移至1 397.66 cm-1，這可能是由于L-天冬氨酸的氨基氮和羧基氧參與了配位反應(yīng)，形成螯合物的結(jié)果[22]。另外，L-天冬氨酸在2 085.64 cm-1左右有一個(gè)吸收峰，但是螯合之后，在L-天冬氨酸螯合鈣的紅外光譜圖中該峰消失了，這一結(jié)果與王青等[23]報(bào)道相符，也與日本特許公報(bào)中介紹的α-氨基酸在2 100 cm-1處有一特征峰, 絡(luò)合后該峰就消失的研究結(jié)果相一致[24], 進(jìn)一步表明了螯合鈣的生成。而且，螯合鈣譜圖在1 603.52 cm-1處有一明顯的強(qiáng)吸收峰，說(shuō)明L-天冬氨酸的氨基與殼粉中的鈣發(fā)生了較強(qiáng)的螯合作用，有力地證明了氨基酸螯合鈣的存在。這一結(jié)果與Nara等[25]的研究結(jié)果相似。

圖2 L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of L-Asp and L-Asp chelated calcium

2.4 L-天冬氨酸螯合鈣的一二級(jí)質(zhì)譜分析

電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)具有樣品用量少，檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度和精確度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的有效手段之一[14]。圖3為以牡蠣殼為鈣源的L-天冬氨酸螯合鈣一級(jí)質(zhì)譜圖，從圖3中可以得到m/z為100～1 000的離子分布情況。從圖3中可以看出，其他離子峰的響應(yīng)信號(hào)都較弱，信號(hào)較強(qiáng)的母離子m/z為342.9，為單一化合物，這與王曉萍研究報(bào)道的小麥胚芽蛋白源鋅螯合肽的電噴霧質(zhì)譜結(jié)果類(lèi)似[26]。所合成的螯合鈣主要分子量可能為342.9，結(jié)合GB29226—2012可知，天門(mén)冬氨酸鈣的m/z理論值為304.2，樣品螯合鈣中最高響應(yīng)峰為342.9，這可能是由于在正離子模式下，螯合鈣與系統(tǒng)中的K離子結(jié)合形成[M+K]+為343.2(342.9±0.5)的響應(yīng)峰，且該峰響應(yīng)值較高，表明所制備的L-天冬氨酸螯合鈣較純，符合GB29226—2012中天門(mén)冬氨酸鈣的結(jié)合方式，即兩個(gè)天冬氨酸與一個(gè)鈣配位。

以牡蠣殼為鈣源的L-天冬氨酸螯合鈣二級(jí)質(zhì)譜如圖4所示，圖4是選擇圖3中m/z為342.9(誤差±0.5)的母離子進(jìn)行歸一化能量19%的碎片結(jié)果。其中藍(lán)色標(biāo)記處的342.8為碎片后所選母離子峰的低豐度質(zhì)荷比，而圖4中m/z為276.4的子離子峰響應(yīng)值最高，相比于母離子其相對(duì)分子量丟失了66.5，推測(cè)可能是螯合物結(jié)構(gòu)中一些側(cè)鏈基團(tuán)被破碎的結(jié)果。Zhao等[27]研究報(bào)道了純化肽(Phe-Asp)中的氨基和羧基可以與鈣螯合形成共用電子對(duì)的情況。

2.5 L-天冬氨酸螯合鈣的XRD分析

L-天冬氨酸、牡蠣殼粉和L-天冬氨酸螯合鈣的X-射線衍射譜圖如圖5所示。從譜圖中可以看出，L-天冬氨酸與牡蠣殼粉形成螯合鈣后，原料中主要吸收峰發(fā)生了顯著變化，晶面間距(d)和相對(duì)強(qiáng)度(I/I0)改變。螯合前，L-天冬氨酸的結(jié)晶度非常高，主強(qiáng)峰2θ=23.72°，I/I0=100%，晶面間距d=3.74，兩個(gè)次強(qiáng)峰2θ分別為11.80°和35.92°，I/I0分別是34.1%和25.9%，晶面間距d=7.49和5.86。牡蠣殼粉在2θ為29.58°和47.70°也顯示出其特有的方解石特征峰，I/I0分別為100%和22.2%。然而，在生成的螯合鈣中卻未發(fā)現(xiàn)特征衍射峰，只是在2θ=33.90°處有一個(gè)較寬的彌散區(qū)域，無(wú)結(jié)晶特性，即該螯合鈣為非晶態(tài)物質(zhì)。何昇鴻等[28]研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖與銅離子生成的銅螯合物也呈非晶態(tài)，其反應(yīng)物譜圖中的強(qiáng)峰在螯合物中完全消失，表明了螯合物的形成。

2.6 L-天冬氨酸螯合鈣的DSC分析

通過(guò)比較螯合反應(yīng)前后的DSC曲線圖，觀察熔融峰或其他熱轉(zhuǎn)變峰形、峰面積等的變化，可定性判斷有無(wú)化學(xué)反應(yīng)或其他相互作用的發(fā)生[29-30]。圖6所示L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的DSC圖。從圖中可以看出，L-天冬氨酸和它的螯合鈣在27.5 ℃有一個(gè)強(qiáng)放熱峰。隨著溫度的升高，L-天冬氨酸在約31 ℃處出現(xiàn)拐點(diǎn)，吸熱速率趨向平緩，在圖中所示的溫度范圍內(nèi)尚未達(dá)到其變性溫度，這與其熔點(diǎn)為230 ℃相符合。同樣地，其螯合鈣在31 ℃左右也出現(xiàn)拐點(diǎn)，吸熱速率減慢，但在約135 ℃時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)寬的吸熱峰，這個(gè)溫度點(diǎn)可能即L-天冬氨酸螯合鈣的變性溫度。

圖4 L-天冬氨酸螯合鈣的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 MS/MS spectrum of L-Asp chelated calcium

圖5 L-天冬氨酸、牡蠣殼粉和L-天冬氨酸螯合鈣的X射線衍射圖Fig.5 X-ray diffractograms of L-Asp, oyster shell powder and L-Asp chelated calcium

2.7 L-天冬氨酸螯合鈣的TG分析

熱重分析是通過(guò)程序控制一定溫度條件，測(cè)量物質(zhì)的質(zhì)量隨溫度變化關(guān)系的技術(shù)，失重速率最大值與TG曲線的失重拐點(diǎn)相對(duì)應(yīng)[31]。L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣的熱重曲線如圖7所示。隨著溫度的不斷上升，L-天冬氨酸在溫度約260 ℃時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，質(zhì)量開(kāi)始迅速下降，L-天冬氨酸開(kāi)始熔化，熱重百分比77.7%，當(dāng)溫度達(dá)到390 ℃左右時(shí)，出現(xiàn)第二次峰形拐點(diǎn)，此時(shí)熱重百分比為49.8%，在約790 ℃時(shí)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至最低，趨于定值，失重78.1%，即灰分21.9%。

圖6 L-天冬氨酸及其螯合鈣的差示掃描量熱曲線Fig.6 Differential thermal curves of L-Asp and its chelated calcium

對(duì)于L-天冬氨酸螯合鈣來(lái)說(shuō)，在溫度約135 ℃時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)質(zhì)量損失，失重3.2%，這一結(jié)果與圖6中的螯合鈣在135 ℃附近開(kāi)始變性的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。此外，與L-天冬氨酸的熱重曲線相一致的是，螯合鈣在260 ℃附近也有強(qiáng)烈的質(zhì)量損失，樣品開(kāi)始熔化，此時(shí)的熱重百分比84.2%，隨后在約412和770 ℃處有較快的分解現(xiàn)象。這與管海躍所報(bào)道的甘氨酸鋅螯合物在溫度約295 ℃時(shí)開(kāi)始熔化，隨后發(fā)生分解相似[16]。但L-天冬氨酸螯合鈣在800 ℃左右尚未完全分解，其熱重百分比為37.1%，表明螯合后的熱穩(wěn)定性得到了一定程度的提高。

圖7 L-天冬氨酸及其螯合鈣的熱重曲線Fig.7 TG curves of L-Asp and its chelated calcium

2.8 L-天冬氨酸螯合鈣的穩(wěn)定性分析

2.8.1 L-天冬氨酸螯合鈣的熱穩(wěn)定性分析 熱處理是一種常用于食品的加工方式，研究L-天冬氨酸螯合鈣在熱處理過(guò)程中的穩(wěn)定性對(duì)其在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有重要意義。由圖8可知，隨著加熱溫度的提高，不同溫度下的鈣保留率變化不大，與對(duì)照組(Control check，CK)相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)，這表明所制備的L-天冬氨酸螯合鈣具有良好的熱穩(wěn)定性，持鈣能力不隨溫度的改變而發(fā)生顯著變化。

2.8.2 L-天冬氨酸螯合鈣的酸堿穩(wěn)定性分析 L-天冬氨酸螯合鈣的酸堿穩(wěn)定性見(jiàn)圖9。從圖中可以看出，隨著pH的增加，鈣保留率先增加后降低，在pH=6左右達(dá)到最大值，鈣保留率接近對(duì)照組，且與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。之后鈣保留率顯著降低，在pH=10時(shí)出現(xiàn)了絮狀沉淀，可能是強(qiáng)堿性條件下氫氧根離子和鈣離子形成了氫氧化鈣沉淀，穩(wěn)定系數(shù)大于螯合鈣。而在酸性較強(qiáng)條件下，氫離子的大量存在與鈣離子競(jìng)爭(zhēng)性搶奪供電基團(tuán)-NH2和-COOH，亦加速螯合鈣的解離，這與單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。而大多數(shù)食品的pH在5～8范圍內(nèi)，且螯合鈣在該范圍內(nèi)的鈣保留率均在90%以上，因此L-天冬氨酸螯合鈣可考慮作為鈣營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到大多數(shù)食品中。

圖8 溫度對(duì)L-天冬氨酸螯合鈣鈣保留率的影響Fig.8 The influence of temperature on L-Asp chelated calcium retention rate

(數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同小寫(xiě)字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p < 0.05，單因素方差分析結(jié)合HSD進(jìn)行事后檢驗(yàn))。Data were expressed as means ± standard deviations, with different lowercase letters marking significant differences (p < 0.05, one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Turkey’s Honest Significant Difference (HSD) test).)

2.8.3 L-天冬氨酸螯合鈣的模擬胃腸消化穩(wěn)定性分析 L-天冬氨酸螯合鈣受消化酶作用的影響見(jiàn)圖10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，螯合鈣由胃蛋白酶模擬消化1 h后，鈣保留率顯著下降了近29%。之后，再經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理1 h的鈣保留率恢復(fù)至87.6%，表明L-天冬氨酸螯合鈣具有一定的抗消化性。在模擬消化過(guò)程中，雖然鈣保留率有顯著下降，但是總體都高于70%，顯示其抗消化特性良好，且經(jīng)過(guò)胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后，仍保留了消化酶作用前的87.6%的持鈣能力。

(數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同小寫(xiě)字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p < 0.05，單因素方差分析結(jié)合HSD進(jìn)行事后檢驗(yàn))。Data were expressed as means ± standard deviations, with different lowercase letters marking significant differences (p < 0.05, one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Turkey’s Honest Significant Difference (HSD) test).)

3 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)掃描電鏡、紅外光譜和質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)L-天冬氨酸螯合鈣進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，并研究了其物理化學(xué)特性。研究結(jié)果表明，螯合鈣的微觀形態(tài)整體呈團(tuán)塊狀，結(jié)構(gòu)較緊密。L-天冬氨酸中的氨基和羧基主要以配位結(jié)合形式參與了螯合反應(yīng)。所制備的螯合鈣主要分子量響應(yīng)峰值342.9，其結(jié)構(gòu)符合GB29226—2012中天門(mén)冬氨酸鈣的結(jié)合方式。此外，理化特性研究表明，該螯合鈣為非晶態(tài)物質(zhì)，具有良好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，且在模擬胃腸消化過(guò)程后仍能保留87.6%的持鈣能力。

本文的研究結(jié)果完善了目前對(duì)牡蠣殼源L-天冬氨酸螯合鈣的結(jié)構(gòu)及理化特性的研究，為牡蠣殼廢棄物的高值化利用及新型鈣營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑L-天冬氨酸螯合鈣的生產(chǎn)、應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)，今后將進(jìn)一步研究牡蠣殼源L-天冬氨酸螯合鈣對(duì)缺鈣大鼠骨密度和生物可利用性等方面的影響。