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    氧化石墨烯對2種海洋微藻的毒性效應(yīng)研究?

    2020-11-04 08:03:36杜樹豪孟范平彭曉玲
    關(guān)鍵詞:鹽生球藻微藻

    杜樹豪, 孟范平, 張 倩, 彭曉玲

    (中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266100)

    近20年來,石墨烯基材料(GBMs)的生產(chǎn)和應(yīng)用因其以下優(yōu)點(diǎn)而發(fā)展迅速[1]:①改善生物材料的機(jī)械和電氣性能;②能夠在生物材料表面附著和生長;③可制備更高效的生物傳感器。到2028年年底,預(yù)計(jì)全球GBMs市場將達(dá)到8億美元,較2018年預(yù)計(jì)增長15倍[2]。常見的GBMs主要包括石墨烯(GS)、氧化石墨烯(GO)和還原型氧化石墨烯(rGO)。GO是石墨烯的氧化物,含有單層并以六元環(huán)排列的sp2雜化碳原子[3],其分子中含有羧基、羥基、環(huán)氧基等含氧官能團(tuán)[3-4]而易于分散在水和其它有機(jī)溶劑中[3]。目前,GO因其優(yōu)良的導(dǎo)電性能及良好的水溶性已被廣泛應(yīng)用于電子器件、催化氧化、生物技術(shù)以及作為工業(yè)生產(chǎn)中的表面活性劑,成為GBMs市場的最大組成部分[5-8]。同時,GO又是一種碳納米材料(即三維空間中有一維的尺寸小于100 nm)。在GO大量應(yīng)用過程中,將被釋放到河流、水庫、湖泊和海洋等水環(huán)境中,可能會增加環(huán)境風(fēng)險水平,因此其生物安全性受到較多關(guān)注。

    在水生生態(tài)系統(tǒng)中,微藻作為初級生產(chǎn)者具有重要地位,研究GO對微藻生長的影響及其機(jī)制對于評價GO的潛在毒性效應(yīng)具有重要作用。目前,該方面的研究對象為淡水微藻。Nogueira等[9]研究認(rèn)為,GO對羊角月牙藻(Raphidocelissubcapitata)生長的抑制可能是活性氧(ROS)產(chǎn)生和膜損傷(細(xì)胞活力)的結(jié)果,而GO在培養(yǎng)基中的團(tuán)聚所引起的遮光效應(yīng)也會降低藻細(xì)胞密度。Hu等[6]研究發(fā)現(xiàn),GO濃度≥2.5 mg·L-1時,纖細(xì)裸藻(Euglenagracilis)細(xì)胞的丙二醛(MDA,逆境脅迫下脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物)含量顯著增加,并認(rèn)為培養(yǎng)基中的GO以及包覆在藻細(xì)胞表面的GO均會引起遮光效應(yīng)從而降低微藻對光的利用。Zhao等[10]在研究GO對蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的致毒機(jī)理時發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中GO的遮光效應(yīng)對微藻生長抑制的貢獻(xiàn)率約為16.4%;GO造成細(xì)胞膜完整性明顯下降則是由氧化逆境和物理性穿透共同作用所致。然而,目前尚未見到有關(guān)GO對海洋微藻毒性的研究報道。已有研究證實(shí),離子強(qiáng)度增大可以促進(jìn)GO團(tuán)聚[11]。那么海水背景下GO對微藻的毒性程度和機(jī)理可能與淡水環(huán)境有所不同。為此,本研究擬在測定GO對2種海洋微藻(鹽生杜氏藻Dunaliellasalina和海洋微擬球藻Nannochloropsisoceanic)的半抑制濃度(EC50)基礎(chǔ)上,根據(jù)暴露期間微藻的生理學(xué)指標(biāo)(GSH、GPx、GR、GST、MDA、光合色素)以及細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)的變化,分析其致毒機(jī)制,為GO的海洋生態(tài)風(fēng)險評價及其排放控制提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    GO分散液(深棕色,濃度10 000 mg·L-1):購自中國山東省濟(jì)寧利特納米技術(shù)有限責(zé)任公司,采用改進(jìn)Hummer’s法合成,pH 5~7,純度>99.9%,單層率>99%,Mn含量小于10 mg·L-1。

    微藻:海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanic)購自中國科學(xué)院海洋研究所,鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)購自中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫。兩種微藻均采用F/2培養(yǎng)基[12]進(jìn)行培養(yǎng)。

    海水:取自青島市石老人海域(pH=7.90±0.02、鹽度30),使用前經(jīng) 0.45 μm 醋酸纖維濾膜抽濾,121 ℃下滅菌20 min后冷卻備用。

    試劑:測定蛋白質(zhì)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、丙二醛(MDA)的試劑盒購自南京建成生物工程研究所。1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)、谷胱甘肽(GSH)為Sigma公司產(chǎn)品。NaH2PO4、Na2HPO4、丙酮等試劑均為國產(chǎn)分析純。鄰苯二甲醛(OPT)為國產(chǎn)化學(xué)純。

    1.2 方法

    1.2.1 GO的粒徑測定及其在蒸餾水和培養(yǎng)基中的形態(tài)觀察 分別向蒸餾水和F/2培養(yǎng)基中加入GO分散液,使GO濃度均為100 mg·L-1,超聲(JY92-II型,中國寧波新芝)振蕩1 h后,在激光粒度分析儀(Nano S90型,英國馬爾文公司)上測量GO粒徑;在透射顯微鏡(JEM-2100型,日本電子株式會社)下觀察GO形態(tài)。

    1.2.2 微藻生長抑制試驗(yàn)與72 h半抑制濃度(72 h EC50)計(jì)算 在125 mL的F/2培養(yǎng)基中加入GO分散液,使其濃度分別為0、1、10、50、100和150 mg·L-1,每組3個平行,150 W超聲處理1 h后,接種指數(shù)生長期的微藻(初始濃度約5×105cells·mL-1)。培養(yǎng)條件為:溫度(25±1)℃、光強(qiáng)80 μmol·(m2·s)-1、光暗比12 h∶12 h。在定軌振蕩光照培養(yǎng)箱(PGX-250D-LED型,江蘇天翎)中培養(yǎng)72 h,轉(zhuǎn)速為100 r/min。每隔24 h,在顯微鏡(YS2-H型,日本尼康)下觀察計(jì)數(shù),計(jì)算藻細(xì)胞密度(D,106cells·mL-1),結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

    繪制每種微藻的72 h生長曲線,按公式(1)計(jì)算各處理濃度對應(yīng)的藻細(xì)胞生長抑制百分率(I),采用概率單位法[13]得到GO濃度對數(shù)(x)—概率單位(y,由百分?jǐn)?shù)換算得到)的關(guān)系方程。當(dāng)概率單位為5.0時,計(jì)算得到72 h EC50。

    (1)

    式中:I為藻細(xì)胞生長抑制百分率;Ac、At分別為對照組、處理組的生長曲線與坐標(biāo)軸包圍面積。

    1.2.3 微藻的掃描電鏡和透射電鏡觀察 在1.2.2節(jié)的暴露培養(yǎng)結(jié)束后,分別吸取對照組和GO100 mg·L-1處理組的藻液,在4 ℃、1 000 r·min-1下離心15 min,藻泥用于掃描電鏡和透射電鏡觀察。

    (1)掃描電鏡觀察:用于清晰顯示藻細(xì)胞形態(tài)以及GO團(tuán)聚體在其表面的附著情況。參照Chen等[14]的方法,向藻泥中加入2.5%戊二醛固定,用PBS(pH=7.8,0.1 mol/L)清洗3次;然后用酒精梯度脫水(30%、50%、70%、80%、100%),每次10 min;干燥后用噴金鍍膜,置于掃描電鏡(SEM,JSM-840型,日本電子株式會社)下觀察。

    (2)透射電鏡觀察:按照(1)的步驟將藻泥用戊二醛固定后,在含1%鋨酸的PBS中固定90 min,再用系列濃度的丙酮(10%~100%)逐級脫水。經(jīng)環(huán)氧樹脂滲透、包埋后,用超薄切片機(jī)切片和檸檬酸鉛染色,置于透射電鏡(TEM,H-7650型,日本日立公司)下觀察拍照[15]。

    1.2.4 GO暴露下微藻的GSH及相關(guān)酶、MDA測定 對于1.2.2節(jié)中的對照組和GO濃度為10、100 mg·L-1處理組,培養(yǎng)結(jié)束后分別收集藻液100 mL,于4 ℃、5 000 r·min-1下離心15 min,棄上清液,向藻泥中加入PBS(pH=7.8,0.1 mol·L-1)重懸浮后,用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎30 min(120 W,間歇、工作各5 s,冰浴),在4 ℃、1 000 r·min-1下離心15 min,上清液用于以下指標(biāo)測定。

    (1)GSH含量和GST活性測定

    GSH:分子熒光光度法[16]。在堿性介質(zhì)中,OPT與氨基酸、肽反應(yīng)生成熒光化合物,當(dāng)激發(fā)波長為350 nm,發(fā)射波長為430 nm時,在一定范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與GSH濃度呈線性關(guān)系。根據(jù)GSH濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中的GSH濃度(mg·mL-1),進(jìn)而轉(zhuǎn)換為每g組織蛋白中GSH含量,單位為mg/gprot。

    GST:參照Habig等[17]的方法。原理為:GST能夠催化GSH與CDNB反應(yīng)生成1-巰基-2,4-二硝基苯(GS-DNB)。在波長340 nm下,通過測定吸光度變化率計(jì)算GST活性。酶活力單位為nmol/(min·mg)prot。

    (2)GPx(U/mgprot)、GR活性(U/mgprot)和MDA(nmol/mgprot)、蛋白質(zhì)含量(g·L-1):均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

    1.2.5 光合色素含量測定 取1.2.2節(jié)培養(yǎng)結(jié)束后的對照組和GO濃度10、100 mg·L-1處理組藻液各2 mL,2 500 r·min-1離心15 min,棄上清液后,加入2 mL 80%的丙酮,黑暗處抽提24 h,再以2 500 r·min-1離心15 min,取上清液測定663、646和470 nm處的吸光值(OD),根據(jù)公式(2)~(5)[18]計(jì)算葉綠素a(Chla),葉綠素b(Chlb),總?cè)~綠素(Chl(a+b))和類胡蘿卜素(Car)含量,單位為μg·(106cells)-1)。公式中,D為藻細(xì)胞密度(106cells·mL-1):

    (2)

    (3)

    (4)

    (5)

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    在GO對微藻的生長抑制試驗(yàn)和毒理學(xué)試驗(yàn)中,每個處理組及對照組各設(shè)置3個重復(fù),結(jié)果以3個重復(fù)實(shí)驗(yàn)值的(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。通過單因素方差分析(ANOVA)及Tukey’s post-hoc多重比較檢驗(yàn),進(jìn)行差異顯著性分析,統(tǒng)計(jì)顯著性水平為p<0.05,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 18.0軟件。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GO的粒徑分布及其在培養(yǎng)基中的形態(tài)

    由圖1(A)可見,GO在純水中分散均勻,呈薄片狀,無團(tuán)聚現(xiàn)象;但是,在離子強(qiáng)度較高的F/2培養(yǎng)基(介質(zhì)為海水)中,GO出現(xiàn)嚴(yán)重團(tuán)聚現(xiàn)象,顏色加深(見圖1(B))。粒度分析結(jié)果表明,本研究所用GO的粒徑大多處于200~400 nm之間(見圖1(C))。

    圖1 GO在蒸餾水(A)、F/2培養(yǎng)基(B)中的TEM圖以及GO的粒度分布圖(C)Fig.1 TEM images of GO in in distilled water (A) and F/2-medium (B) respectively after sonication and particle size-distribution in distilled water (C)

    2.2 GO對2種微藻生長的抑制

    由圖2可見,GO對2種微藻的生長均具有明顯抑制作用,其中,鹽生杜氏藻在含GO的培養(yǎng)基中暴露24 h期間幾乎無法生長。隨著暴露時間延長,較高濃度GO對微藻生長的抑制效應(yīng)越來越大。暴露72 h時,150 mg·L-1處理組中,鹽生杜氏藻的細(xì)胞密度(0.652×106cells·mL-1)僅為同期對照組(1.457×106cells·mL-1)的44.75%;同樣,海洋微擬球藻的細(xì)胞密度(1.987×106cells·mL-1)降為同期對照組(4.671×106cells·mL-1)的42.54%。根據(jù)微藻生長曲線,采用1.2.2節(jié)的方法,計(jì)算得到GO對2種微藻的72 h EC50值分別為13.04 和79.10 mg·L-1(見表1)。

    2.3 微藻的GSH及其相關(guān)酶對GO暴露的響應(yīng)

    圖3顯示,2種微藻暴露于低(10 mg·L-1)、高濃度(100 mg·L-1)的GO 72 h后,與對照組相比,GSH含量均降低,其中,鹽生杜氏藻的降幅分別為50.0%和71.3%,海洋微擬球藻的降幅分別為58.4%和62.0%。GPx活性也受到抑制,其中,鹽生杜氏藻的降幅分別為21.4%和20.9%,海洋微擬球藻的降幅分別為43.1%和48.2%。但是,高濃度GO暴露則顯著誘導(dǎo)微藻的GR、GST活性,鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻的GR活性分別比對照組上升38.3%和178%;GST活性分別增加95.6%和142%。

    2.4 微藻的脂質(zhì)過氧化程度

    由圖4可見,72 h暴露試驗(yàn)中,低濃度(10 mg·L-1)的GO對2種海水微藻MDA含量的影響不顯著,而暴露在高濃度(100 mg·L-1)GO后,微藻的MDA含量發(fā)生顯著變化(p<0.05)。與對照組相比,鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻的MDA含量分別增加18.0和10.9倍。

    表1 GO對2種海洋微藻的72 h EC50Table 1 72 h EC50 values of GO calculated for two species of marine microalgae

    圖2 鹽生杜氏藻(A)和海洋微擬球藻(B)在不同濃度GO中暴露的生長曲線Fig.2 Growth curves of Dunaliella salina and Nannochloropsis oceanic in batch cultures as a function of GO concentration

    2.5 微藻的光合色素含量

    不同濃度(0、10、100 mg·L-1)GO暴露72 h后,2種微藻光合色素含量的變化見圖5。無論GO存在與否,鹽生杜氏藻的3種光合色素含量均高于海洋微擬球藻。對于鹽生杜氏藻,與對照組相比,2種濃度的GO處理均能顯著刺激光合色素合成(p<0.05),且濃度較高(100 mg·L-1)處理組的增幅大于濃度較低(10 mg·L-1)處理組(Chla:79.9% vs. 37.6%;Chlb: 89.5% vs. 36.8%;Chl(a+b): 82.8% vs. 37.3%;Car: 56.5% vs. 32.5%)。對于海洋微擬球藻,較低濃度GO也能引起色素含量顯著增加,其中,Chla和Car的變化達(dá)到顯著水平(p< 0.05);較高濃度GO能顯著誘導(dǎo)除Car(降幅為48.2%)以外的其它色素的合成(p< 0.05,增幅分別為:Chla11.7%、Chlb81.1%和Chl (a+b) 41.5%)。

    2.6 微藻表面形態(tài)與微觀結(jié)構(gòu)

    SEM觀察發(fā)現(xiàn),對照組的鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻近似呈球形(見圖6 (A)、(D)),經(jīng)過GO暴露后,細(xì)胞因外部包覆一層GO而呈不太規(guī)則的球形或其它形狀(見圖6 (B)、(C)、(E)、(F)中黃色箭頭所指),且藻細(xì)胞總體呈皺縮狀態(tài),海洋微擬球藻尤為明顯(見圖6 (E)、(F))。

    TEM圖顯示,對照組的藻細(xì)胞近似為圓形,細(xì)胞膜和細(xì)胞壁完整(注:鹽生杜氏藻無細(xì)胞壁),細(xì)胞核、葉綠體、線粒體、高爾基體以及淀粉粒、油脂小球等清晰可見(見圖7 (A)、(C))。暴露于GO后,可觀察到以下4點(diǎn)明顯變化:①2種微藻的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生畸變(與SEM觀察結(jié)果相符),其中,鹽生杜氏藻的部分細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞,內(nèi)容物外泄(見圖7 (B)中黃色箭頭所指);海洋微擬球藻細(xì)胞則變得細(xì)長(見圖7 (D)),細(xì)胞表面還出現(xiàn)一些凸起(見圖7 (B)、(D)中紅色箭頭所指);②鹽生杜氏藻細(xì)胞核嚴(yán)重變形,核膜模糊不清,核質(zhì)發(fā)生凝聚(圖7 (B)中藍(lán)色箭頭所指);③海洋微擬球藻的細(xì)胞質(zhì)中分布著GO顆粒(見圖7(D)中2處藍(lán)色箭頭指示的黑色陰影處);④藻細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒數(shù)量增多(或體積增大)(見圖7 (B)、(D))。

    (*p<0.05水平上差異顯著。* denotes significant difference from the control at p<0.05.)

    (*p<0.05水平上差異顯著。*denotes significant difference from the control at p<0.05.)

    3 討論

    GO對微生物的生長抑制情況因微生物種類而異。根據(jù)我國《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》(HJ/T 154—2004)[19]提出的生態(tài)毒理學(xué)危害性分級標(biāo)準(zhǔn),GO對2種海洋微藻(鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻)均具有中等毒性(72 h EC50介于10~100 mg·L-1),但是,鹽生杜氏藻對GO的敏感性高于海洋微擬球藻(72 h EC50:13.04 mg·L-1vs. 79.10 mg·L-1),也高于除纖細(xì)裸藻(Euglenagracilis)以外的其它淡水藻種(72 hEC50≥20.6 mg·L-1,見表1)。但是,由于目前國內(nèi)外關(guān)于GO毒性效應(yīng)的研究所涉及的微藻種類較少,尚無法判斷海洋微藻與淡水微藻對GO敏感性的相對高低。

    本研究觀察到GO-微藻體系中幾乎所有藻細(xì)胞的表面都有GO聚集體附著,甚至整個細(xì)胞被GO完全包裹(見圖6),這是因?yàn)镚O表面存在羧基、羥基和烷氧基[22-23],而微藻細(xì)胞壁上含有多糖、蛋白質(zhì)、脂類等[24],其細(xì)胞膜則是由磷脂分子層、糖脂和蛋白質(zhì)組成[25-26],這些生物大分子中富含酰胺基、羧基、羥基等官能團(tuán)[32],使得GO與海洋微擬球藻、鹽生杜氏藻(無細(xì)胞壁)之間容易通過形成氫鍵和共價鍵而結(jié)合。光是影響微藻生長最重要的環(huán)境因子之一。理論上,在海水中透光性變差(因顏色加深)的GO包覆于藻細(xì)胞表面后,必然造成入射到藻細(xì)胞內(nèi)的光強(qiáng)減弱,相應(yīng)的,光合作用會降低。但是,本研究發(fā)現(xiàn),2種微藻暴露于高、低濃度GO后,單位數(shù)量藻細(xì)胞的光合色素含量總體上明顯增加(見圖5)。Metzler等也發(fā)現(xiàn)[27],納米顆粒產(chǎn)生的遮光效應(yīng)在減少藻細(xì)胞對光吸收的同時會導(dǎo)致葉綠素含量增加,并認(rèn)為這種變化是微藻對遮光效應(yīng)的一種應(yīng)激響應(yīng),其目的是優(yōu)化光的利用率,增加藻細(xì)胞對光的吸收,以消除遮光(非完全不透光)帶來的不利影響。即便如此,由于微藻可獲得的光強(qiáng)減少,其光合作用強(qiáng)度并不能達(dá)到對照組水平,表現(xiàn)為微藻生長受到抑制(見圖2)。

    (*p<0.05水平上差異顯著。*denotes significant difference from the control at p<0.05.)圖5 2種微藻暴露于GO(0、10和100 mg·L-1)72 h后的Chl a、Chl b、Chl (a+b)和Car含量Fig.5 Contents of Chl a, Chl b, Chl (a+b) and Car in two species of algae exposed to 0, 10 and 100 mg·L-1 of GO for 72 h

    (A~C:鹽生杜氏藻;D~F:海洋微擬球藻。其中,黃色箭頭指示GO包裹細(xì)胞。A~C:Dunaliella salina; D~F: Nannochloropsis oceanic. The yellow arrows indicate GO envelops cells.)

    雖然海洋微擬球藻具有細(xì)胞壁,但是包覆于其表面的GO仍能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中(見圖7(D))。細(xì)胞壁是外部物質(zhì)進(jìn)出藻細(xì)胞的主要部位和屏障。據(jù)報道,細(xì)胞壁上的微孔直徑在5~20 nm之間,因此細(xì)胞對外部物質(zhì)的進(jìn)出具有選擇性[28]。本研究所用的GO在淡水中的粒徑大多在200~400 nm(見圖1)。當(dāng)GO進(jìn)入F/2培養(yǎng)基(海水介質(zhì))后,其表面電荷因高濃度電解質(zhì)的屏蔽效應(yīng)而減少,膠體的穩(wěn)定性變差[29],造成GO團(tuán)聚而形成較大的聚集體,故其粒徑必然大于淡水中的粒徑。在這種情況下,GO進(jìn)入海洋微擬球藻細(xì)胞內(nèi)的原因可能是:細(xì)胞繁殖期間細(xì)胞壁的通透性會發(fā)生改變,使得一些大尺寸的納米顆粒聚集體能夠穿過新合成的細(xì)胞壁[30],而后通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(真核細(xì)胞中普遍存在)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[31]。鹽生杜氏藻細(xì)胞的表面缺少細(xì)胞壁,意味著海水介質(zhì)中的GO可以直接與細(xì)胞膜接觸,而GO片層的邊緣通常較為尖銳(單層GO的厚度約為0.8~1 nm),其與細(xì)胞的相互碰撞過程可直接刺穿細(xì)胞膜,造成細(xì)胞完整性的喪失[32-33],這將大大降低GO進(jìn)入藻細(xì)胞的阻力。因此,在TEM圖像中觀察到暴露于GO的鹽生杜氏藻細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重畸變、細(xì)胞膜破損、內(nèi)容物外泄、細(xì)胞核染色質(zhì)凝集等。而經(jīng)同樣GO暴露后的海洋微擬球藻中較少見到這些變化(見圖7 (B)、(D))。這是鹽生杜氏藻生長受GO抑制較大的原因之一。文獻(xiàn)報道無細(xì)胞壁的淡水微藻纖細(xì)裸藻對GO具有高敏感性(72 h EC50= 3.76 mg·L-1),也能夠證明這一點(diǎn)。

    碳納米材料在藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化逆境常被認(rèn)為是此類物質(zhì)的致毒機(jī)理之一。大量研究已證明,碳納米顆粒能在生物體內(nèi)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生[34-35],其中,GO對ROS生成具有顯著催化作用,由此引發(fā)脂質(zhì)過氧化,造成細(xì)胞壁以及DNA等生物分子的氧化損傷,抑制細(xì)胞的生理行為而導(dǎo)致毒性[31,36]。本研究發(fā)現(xiàn),暴露于GO的2種微藻細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽抗氧化防御系統(tǒng)出現(xiàn)顯著變化。其中,GSH含量顯著降低(p<0.05),表明這種抗氧化劑在消除ROS過程中被大量消耗。一般認(rèn)為[32,37],GSH可通過2條途徑起到抗氧化作用,一是在GPx催化下與H2O2作用生成氧化型谷胱甘肽(GSSG);二是在GST作用下與污染物結(jié)合成為極性小的物質(zhì),實(shí)現(xiàn)對機(jī)體的保護(hù)作用。此外,細(xì)胞中的GR可利用NADPH作為電子供體,催化GSSG的二硫鍵還原,重新生成GSH,以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原動態(tài)平衡。就本研究而言,由于高、低濃度GO暴露下GPx活性均顯著受抑(p<0.05),而GST活性未受到抑制甚至在高濃度GO處理組中顯著上揚(yáng)(見圖3),表明GSH在GPx催化下清除H2O2而消耗的數(shù)量相對較少,相反,因與GO直接結(jié)合而消耗的GSH數(shù)量較大(雖然兩者的結(jié)合機(jī)制尚不清楚)。相應(yīng)的,高濃度GO暴露下活性顯著上升的GR(p<0.05)只能對GSSG進(jìn)行還原,而無法介入與GO直接結(jié)合的GSH的恢復(fù),由此導(dǎo)致GO處理組的GSH含量始終低于對照組(見圖3)。

    (紅色箭頭指向細(xì)胞表面凸起,藍(lán)色箭頭指向核染色質(zhì)凝集,黑色箭頭指向進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的GO。Cw:細(xì)胞壁;CE:細(xì)胞外膜;Pm:質(zhì)膜;N:細(xì)胞核;M:線粒體;CHL:葉綠體;PC:淀粉核中心;Psp:淀粉鞘;S:淀粉粒;L:油脂小球;Cc:凝集的核染色質(zhì);G:高爾基體。The red arrows indicate the cell surface bulge, blue arrows indicate the Nuclear chromatin agglutination, and black arrows indicate the internalized GO. Cw: cell wall; CE: cell envelope;Pm: plasmalemma; N: nucleus; M: mitochondrion; CHL: chloroplast; PC: pyrenoid center; Psp: pyrenoid starch plate; S: starch grain; L: lipid globule;Cc: condensed chromatin; G: golgi apparatus.)

    表2 GO對不同種類微藻的生長抑制作用(EC50)比較Table 2 Growth inhibition effects (EC50) comparison of GO to the different algal species

    比較發(fā)現(xiàn),在較高濃度GO脅迫下,鹽生杜氏藻的GR活性誘導(dǎo)程度較小,GSH剩余量也較低,表明其對ROS的清除能力不及海洋微擬球藻。相應(yīng)的,該微藻細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較高含量的MDA(見圖4),這是過多積累的ROS攻擊生物大分子造成嚴(yán)重脂質(zhì)過氧化的結(jié)果。暴露于GO的鹽生杜氏藻中出現(xiàn)的細(xì)胞膜明顯破損、核膜模糊不清等現(xiàn)象(見圖7)也與此有關(guān)。至于2種海洋微藻細(xì)胞內(nèi)的淀粉積累量增加(見圖7 (B)、(D)),則是微藻對GO脅迫的一種適應(yīng)機(jī)制。很多研究已證實(shí)[38,39],在氮磷營養(yǎng)鹽不足、高鹽度等生長逆境下,藻細(xì)胞會將光合作用固定的碳源更多用于儲能物質(zhì)(淀粉或脂質(zhì))積累,以抵御外界環(huán)境變化和實(shí)現(xiàn)機(jī)體自我保護(hù)。

    4 結(jié)論與展望

    (1)GO對鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻生長均有抑制,72 h EC50分別為13.04和79.10 mg·L-1。

    (2)GO不會抑制海洋微藻光合活性,卻能促進(jìn)微藻光合色素合成,并以淀粉粒形式積累。

    (3)GO暴露引起微藻谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)明顯變化,包括GSH大量消耗、GPx活性受抑、GST和GR活性上揚(yáng)。高濃度GO脅迫下細(xì)胞內(nèi)MDA含量激增,脂質(zhì)過氧化嚴(yán)重。

    (4)鹽生杜氏藻對GO的高敏感性與其缺少細(xì)胞壁以及GSH過度消耗有很大關(guān)系。

    (5)本研究結(jié)果有助于人們加深對GO海洋生態(tài)效應(yīng)的認(rèn)識,今后應(yīng)采用更多海洋微藻進(jìn)行研究,并探討環(huán)境因子對GO毒性的影響,為客觀評價GO的海洋生態(tài)風(fēng)險提供充分依據(jù)。

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