尿素循環(huán)限速酶CPS1在胃黏膜腸上皮化生及癌變過程中的表達特征

方旭前， 羅方秀， 李芹芹， 馬乾宸， 陳培戰(zhàn)， 袁 菲

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院北院病理科，上海 201801；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院病理科；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院北院中心實驗室

腸型胃癌的發(fā)生經(jīng)歷了多步驟、多階段的過程。Correa等[1]于1975年提出的胃癌發(fā)生模型被廣為接受，其中腸型胃癌的發(fā)生歷經(jīng)慢性非萎縮性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生、低度異型增生[低級別上皮內瘤變(LGIN)]、高度異型增生[高級別上皮內瘤變(HGIN)]、癌變、浸潤性腺癌等多個階段。其中腸上皮化生是胃癌的重要癌前病變之一，可導致胃癌風險增加10倍[2]。尾型同源盒轉錄因子2(CDX2)是一種腸上皮特異性轉錄因子，CDX2在胃黏膜中異源性表達可驅動腸上皮化生而形成腸道表型。許多研究表明，CDX2是腸上皮化生特異性標志物，在>85%腸化生腺上皮中呈強陽性表達[3-4]。氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)是尿素循環(huán)第1個限速酶，在組織病理中曾命名為肝細胞石蠟抗原1(HepPar1)或肝細胞抗原(hepatocyte antigen，Hep)，用于識別肝源性腫瘤。HepPar1也是小腸分化的一個敏感標志物，可特異性識別Barrett食管或慢性胃炎伴生的腸化生，是食管黏膜和胃黏膜腸化生的早期診斷標志物[5]，提示CPS1可能參與食管癌及結腸癌的癌變過程。Srivastava等[6]發(fā)現(xiàn),CPS1在Barrett食管中高表達，在異型增生、食管腺癌中表達下調，認為CPS1表達下調是食管癌癌變標志物。在結腸癌癌變過程，May等[7]發(fā)現(xiàn),伴發(fā)高度異型增生或癌變的潰瘍性結腸炎患者的結腸黏膜中CPS1呈高表達，認為CPS1表達上調是預測潰瘍性結腸炎是否會向異型增生或癌變發(fā)展的分子標志物。提示CPS1在不同腫瘤的發(fā)生過程中表達模式不一。本研究以經(jīng)典的腸化標志物CDX2為對照，評價CPS1在慢性萎縮性胃炎伴生的腸化生及癌變過程中的表達特性，以進一步研究其在腸型胃癌演變過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 入組病例124例不同病變胃黏膜組織來自瑞金醫(yī)院北院2018年1月至2020年1月的胃鏡活檢標本，結合胃鏡檢查和病理組織學檢查，診斷為胃淺表黏膜慢性炎10例、小腸黏膜慢性炎10例、結腸黏膜慢性炎10例、慢性萎縮性胃炎伴腸化生32例、低度異型增生30例、高度異型增生32例。所取組織標本均經(jīng)瑞金醫(yī)院北院倫理委員會的審批。

172例腸型胃癌組織選自南通腫瘤醫(yī)院2000年12月至2005年4月收治的患者。大多數(shù)患者在先前的研究中已有報道[8]。入組人群為初診胃癌患者，尚未接受任何治療。如患者有其他類型的惡性腫瘤病史，且接受過新輔助化療或手術治療，則將其排除在外。所有病例均經(jīng)術后病理證實。從入院記錄中獲取基線資料，從病歷中提取臨床和病理數(shù)據(jù)，由臨床醫(yī)師根據(jù)實驗室檢查和圖像進一步評估。所取組織標本均經(jīng)南通腫瘤醫(yī)院倫理委員會的審批。

1.2 組織芯片的建立胃癌術后組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、病理組織學檢查確定腫瘤核心區(qū)及鄰近癌旁區(qū)。委托生物芯片上海國家工程研究中心進行芯片的點樣與制作。

1.3 免疫組化染色采用Leica Bond Ⅲ全自動免疫組化儀進行免疫組化(IHC)染色。石蠟包埋組織層厚3～5 μm切片。CPS1抗體(Abcam，美國)，克隆號GR147297-2，工作濃度1∶200。CDX2抗體(Abcam，美國)，克隆號BP6023，工作濃度1∶400。具體實驗步驟按儀器說明書。

1.4 結果判斷根據(jù)陽性細胞染色強度和陽性細胞的百分率進行評分[9]。彌漫強陽性：染色強度強，陽性細胞彌漫分布(3分)；局灶陽性：染色強度強，陽性細胞局灶分布(2分)；弱陽性：染色強度弱-中(1分)；陰性：不著色或非特異性染色(0分)。所有結果均經(jīng)由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師獨立判讀。

1.5 統(tǒng)計學分析采用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 8對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，用Mann Whitney testU檢驗檢測不同癌變階段CPS1和CDX2的表達差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CPS1和CDX2的表達情況在胃黏膜中，CPS1和CDX2均無陽性表達。CPS1在10例小腸黏膜中均表達(包括3例十二指腸、5例空腸和2例回腸)，其中空腸部位表達最為明顯，但在結腸黏膜中不表達。CDX2在小腸、結腸黏膜中均表達。CPS1和CDX2在腸化生中均呈強陽性表達，陽性率分別為100%(32/32)和87.5%(28/32)(見圖1)。在小腸黏膜中，CPS1只有吸收細胞呈胞質顆粒陽性，而杯狀細胞為陰性。在腸化生中，CPS1于整個腸化生區(qū)域內呈彌漫強陽性表達，比在小腸黏膜中表達更加顯著。CPS1和CDX2在小腸型(Ⅰ型)、結腸型(Ⅱ型)腸化生中均彌漫強陽性表達，不同類型腸化生間(完全型腸化生與不完全型腸化生)表達程度差異無統(tǒng)計學意義(見圖2A、2B)。CPS1和CDX2在異型增生或腸型胃癌的腸化生中亦呈彌漫強陽性表達。本研究納入30例低度異型增生中28例合并腸化生，32例高度異型增生中17例合并腸化生，CPS1和CDX2在異型增生合并腸化生中的陽性率分別為100%(45/45)和93.3%(42/45)。

2.2 CPS1和CDX2在胃癌癌前病變及胃癌中的表達CPS1在低度異型增生中，21例(70.0%)呈彌漫強陽性，與周圍非瘤變的腸化腺上皮表達程度差異無統(tǒng)計學意義，而9例(30.0%)呈局灶陽性。在高度異型增生中，4例(12.5%)呈彌漫強陽性，7例(21.9%)呈局灶陽性，7例(21.9%)呈弱陽性，14例(43.8%)陰性(見圖2C～2H)。CPS1的表達在各個階段間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。同比，CDX2在28例(87.5%)腸化生及30例(100%)低度異型增生腺上皮中呈胞核強陽性。CDX2在高度異型增生中，25例(78.1%)強陽性，7例(21.9%)局灶或弱陽性。CDX2表達在低、高度異型增生間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0118，見表1)。

圖1 CPS1和CDX2 在胃、小腸、結腸黏膜及腸化生病灶中的表達(放大100倍)Fig 1 The expressions of CPS1 and CDX2 in gastric, intestinal, colonic mucosa and intestinal metaplasia

注：A:完全型腸化生：彌漫強陽性;B:不完全型腸化生:彌漫強陽性;C：LGIN:彌漫強陽性;D：LGIN:局灶陽性;E：HGIN:彌漫強陽性;F：HGIN:局灶陽性;G:HGIN:弱陽性;H:HGIN:陰性。圖2 CPS1 在不同類型腸化生及異型增生病變組織中的表達(放大200倍)Fig 2 The expression of CPS1 in different types of intestinal metaplasia and dysplasia

表1 CPS1和CDX2在胃癌癌前病變及胃癌中的表達[例數(shù)(%)]Tab 1 The expressions of CPS1 and CDX2 in gastric cancer and precancerous lesions [n(%)]

2.3 CPS1表達與腸型胃癌臨床參數(shù)相關性分析CPS1在172例腸型胃癌中，14例(8.1%)呈彌漫強陽性，14例(8.1%)呈局灶陽性，37例(21.5%)呈弱陽性，107例(62.2%)陰性。CPS1陰性組與TNM分期(P=0.031)和浸潤深度(P=0.037)顯著相關，但與年齡、性別、淋巴結轉移、遠處轉移無關(P>0.05)(見表2)。

表2 CPS1表達與腸型胃癌臨床參數(shù)相關性分析[例數(shù)(%)] Tab 2 Correlation between the expression of CPS1 and clinical parameters in intestinal type gastric cancer [n(%)]

3 討論

腸上皮化生是Barrett食管或慢性萎縮性胃炎重要的組織學特征，在形態(tài)學上表現(xiàn)為胃黏膜上皮轉變?yōu)樾∧c或結腸黏膜上皮組織。腸化生若未經(jīng)合適的治療可能發(fā)展成不典型增生或癌，是腸型胃癌重要癌前病變之一。大部分腸化生根據(jù)形態(tài)特征如帕內特細胞或杯狀細胞很容易判讀，但少數(shù)情況下腸化生腺體較少，細胞形態(tài)較小，借助有效的腸化生標志物可以降低判讀的難度。目前，認為腸化生標志物根據(jù)分化方向可分為兩類：一類為胃源性相關蛋白，如SOX2[10]、黏蛋白MUC5AC和MUC6[11]。一類為腸源性相關蛋白，如腸特異性轉錄因子CDX2[12]、黏蛋白MUC2和絨毛蛋白Villin[13]。在腸化生階段，控制胃表型的胃源性相關蛋白表達下調，而控制腸表型的腸源性相關蛋白表達上調，實現(xiàn)了胃表型的去分化和腸表型的再分化。

與以往的標志物不同，CPS1是較明確的肝源性標志物，雖然在小腸黏膜中有一定程度的表達。有研究比較CPS1在分化成熟的肝、小腸中的表達程度和酶的活性，肝是小腸的10～20倍[14]。Chu等[15]首先報道Hep(即CPS1)作為腸化生標志物的優(yōu)點。在正常胃、食管黏膜中不表達，在Barrett食管和胃炎性腸化生中高表達。相比MUC2僅在杯狀細胞中表達，Hep在含杯狀細胞的柱狀上皮細胞中均彌漫強陽性表達，因此Hep對腸化腺體的標記更加明顯。除此外，我們還檢測了異型增生及胃癌癌旁的腸化腺體，均能檢測到CPS1的彌漫強陽性表達，進一步肯定了CPS1是腸上皮化生特異性標志物。在腸上皮化生階段，與CDX2相比，CPS1的靈敏度更高。我們仔細觀察了CDX2漏檢的幾例標本，存在腸化腺體較小、杯狀細胞不夠明顯的情況。且CPS1在完全型腸化生與不完全型腸化生中均呈彌漫強陽性表達。因此CPS1是一個覆蓋全面、高靈敏度的腸上皮化生標志物。

CDX2是較為公認的腸化生標志物，在不同亞型的腸化生中差異有統(tǒng)計學意義[16]。在本研究中，CDX2在87.5%(28/32)腸化生及100%(30/30)低度異型增生上皮中呈胞核強陽性，在高度異型增生階段雖然維持表達，但43.8%(14/32)樣本出現(xiàn)局灶或弱陽性表達。相比之下，CPS1在腸化生惡性轉變過程中表達丟失更為明顯。CPS1在腸型胃癌的癌變進程中不斷表達下調，CPS1的表達程度在癌變的各個階段差異均有統(tǒng)計學意義，提示CPS1表達下調可能是腸化生惡性轉變的標志物。我們的研究與Srivastava等[6]在Barrett食管及相關異型增生、食管腺癌中表達模式一致，與May等[7]在潰瘍性結腸炎癌變過程中表達模式相反。Abu-Zeid等[17]探索了CPS1在結腸癌癌變過程中表達模式，發(fā)現(xiàn)CPS1在正常結腸黏膜中不表達，但在47.5%的結腸癌、41.7%的高度異型增生性息肉和23.5%的低度異型增生性息肉中表達。在結腸癌中，CPS1表達與預后較好的臨床參數(shù)如無淋巴結轉移、較低的TNM分期相關[17]。因此研究者認為,CPS1可能參與異型增生的啟動,但在腫瘤的進展和轉移過程中扮演抑癌基因的角色。我們在172例腸型胃癌患者中分析了CPS1表達與臨床參數(shù)的相關性，發(fā)現(xiàn)CPS1表達下調與更高的TNM分期和浸潤深度顯著相關，提示CPS1表達下調預后較差。與上述研究結論相似，CPS1可能是腸型胃癌的一個抑癌基因。

過去的研究認為，腸上皮化生是胃源性相關蛋白與腸源性相關蛋白參與的分化再編程的過程[18-19]。胃、腸、肝及胰腺均來源于卵黃囊內臟內胚層。有研究顯示,人胃上皮細胞可轉變成多潛能的內胚層祖細胞,進一步被誘導分化為成熟的肝細胞、胰腺細胞和腸道上皮細胞[20]。我們猜測在胃幽門螺桿菌和膽汁酸反流這兩個最常見的腸化生因素的刺激下，胃上皮細胞去分化為內胚層祖細胞，此時具有多向分化的潛能。雖然在形態(tài)學上僅能觀察到腸表型，但在分子層面并不能否認其他表型存在的可能性。脂肪酸結合蛋白(FABP)根據(jù)組織學特征可分為肝臟型、心臟型、表皮型和小腸型。而肝臟型FABP(FABP1)被發(fā)現(xiàn)在Barrett食管中高表達，進一步研究顯示它是比CDX2靈敏度和特異度更高的Barrett診斷標志物[21]，且FABP1在異型增生和食管腺癌階段表達下調，表達模式與CPS1一致[6]。肝細胞核因子4α(HNF4α)在成體表達于肝臟、腎臟、胰腺、小腸和結腸，在分化成熟的肝細胞高表達，與肝特異基因的表達密切相關。目前研究發(fā)現(xiàn)，HNF4α是Barrett化生形成的關鍵早期步驟,在食管中異位表達HNF4α，可以在成年小鼠食管上皮中誘導出柱狀表型[22]。因此腸化生過程中，是否有肝表型的分化，而在癌變過程肝表型的迅速丟失與癌變有怎樣的關系，有待進一步研究。

綜上所述，本研究報道了CPS1與CDX2在胃黏膜腸上皮化生及癌變過程中的表達特征,發(fā)現(xiàn)CPS1是一個覆蓋全面、高靈敏度的腸上皮化生標志物。在異型增生階段，CPS1呈現(xiàn)更顯著的表達丟失，提示CPS1表達下調可能是腸化生惡性轉變的標志物。在腸型胃癌中，CPS1表達下調與更高的TNM分期和浸潤深度顯著相關，提示CPS1可能是腸型胃癌的一個抑癌基因。CPS1可能在腸型胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但其表達調節(jié)的具體機制、CPS1是腸化的始動因素還是伴生現(xiàn)象、是否受腸化生相關轉錄因子調控、在癌變過程中逐漸丟失的目的和分子機制等仍有待進一步研究。