單細胞測序技術與中醫(yī)藥前沿研究

李捷　唐勇　劉潔

摘要 單細胞測序技術是在單個細胞水平上，對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序的新技術，能夠揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態(tài)，是研究細胞異質性的有力工具。近十年來涌現(xiàn)出大量基于這項技術的生物細胞異質性研究，應用于腫瘤學、胚胎發(fā)育、神經生物學、免疫學等多個研究領域。在中醫(yī)藥領域科研中剛開始嶄露頭角，已經有利用單細胞測序進行中醫(yī)方劑、中藥作用機制等的科學研究。通過介紹單細胞測序技術概況以及現(xiàn)階段在醫(yī)學領域研究中的應用，論述單細胞測序在中醫(yī)學研究中的可應用方向，拓展中醫(yī)研究思路和方法，為探索中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究提供了新的支撐，大大加快傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代生命科學技術的結合。

關鍵詞 單細胞測序概述;單細胞測序應用;方藥作用機制;中醫(yī)診斷原理;針灸作用機制

Abstract Single-cell sequencing technology is a new technique for high-throughput sequencing of genome，transcriptome and epigenome at the level of a single cell.It can reveal the gene structure and gene expression state of a single cell，and is a powerful tool for the study of cell heterogeneity.In the past decade，a large number of researches on biological cell heterogeneity based on this technology have emerged，which have been applied in oncology，embryonic development，neurobiology，immunology and other research fields.In the field of traditional Chinese medicine（TCM） scientific research is just beginning to emerge，there has been the use of single cell sequencing of prescriptions，the mechanism of action of traditional Chinese medicine and other scientific research.Through the introduction of single-celled sequencing technology and its application at present in the field of medical research，discusses the single-celled sequencing in TCM can be used in the study of the direction，to expand the research ideas and methods of TCM，to explore the modernization of TCM research provides new support，greatly accelerate the combination of TCM and modern life science and technology.

Keywords Single cell sequencing overview; Single cell sequencing application; Prescription mechanism; Diagnosis principle of TCM; Acupuncture mechanism

中圖分類號：R2-03文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.001

中醫(yī)藥是我國傳承了五千年的瑰寶，它的療效及其科學性經住了歷史長河的考驗，但是由于中醫(yī)藥的理論和作用機制很多都尚不明確，導致中醫(yī)藥還未被世界完全認可，甚至有很多國人都不信任中醫(yī)藥，所以把現(xiàn)代先進科學技術與中醫(yī)藥相結合，進一步探索中醫(yī)藥理論作用機制是發(fā)揚中醫(yī)的重要一環(huán)。現(xiàn)代科學對于生命的認識從群體、個體、器官組織水平一直發(fā)展到目前的細胞水平乃至分子生物學水平，其研究是一個從宏觀到微觀，從現(xiàn)象到本質逐層深入的過程。隨著基因組計劃以及一代、二代轉錄組研究在器官、組織水平的開展，單細胞水平的基因組和轉錄組研究逐漸成為關注焦點。在中醫(yī)藥領域研究中，隨著分子生物學前沿技術的大量應用，人們已經從多層次、多角度對中醫(yī)學的辨治理論及方藥的作用機制等進行了深入探討，取得了眾多令人矚目的研究成果。近年來單細胞測序技術應用于中醫(yī)藥研究，已經解決了部分中醫(yī)科研中遇到的難題。本文介紹了單細胞測序技術及在各個領域中的發(fā)現(xiàn)，例舉其在中醫(yī)藥研究的應用和探索，討論了未來中醫(yī)與單細胞技術結合的思路。

1 單細胞測序技術

1.1 單細胞測序技術概述

單細胞測序技術是指對單細胞基因組或轉錄組進行測序，從而獲得基因組、轉錄組或其他多組學信息，以揭示細胞群體差異和細胞進化關系。單細胞測序技術主要包括單細胞基因組測序、轉錄組測序和表觀遺傳學測序，它們各自有各自的特點，滿足了多種科研需求。2009年，Tang等[1]首次通過改進先前用于微陣列分析的單細胞轉錄組擴增方法，分析了來自小鼠四細胞胚胎階段的單個卵裂球的轉錄組。2011年，Islam等[2]建立了單細胞標記的逆轉錄測序方法，即STRT-seq（Single-cell Tagged Reverse Transcription Sequencing），能夠大規(guī)模檢測各種混合細胞樣本。在此之后，2012年，Ramskold等[3]開發(fā)了一種新的單細胞測序技術Smart-seq（Switching Mechanism at 5′ end of the RNA Transcript），檢測來自單細胞水平的RNA和單個循環(huán)腫瘤細胞的全長mRNA，增加了轉錄本序列的覆蓋度。2013年，《科學》（Science）雜志將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首，《自然方法》雜志將單細胞測序的應用列為年度最重要的方法學進展[4]。2014年，Jaitin等[5]建立了名為MARS-seq（Massively Parallel Single Cell RNA-seq）單細胞測序的方法，該方法可用于分析數(shù)千個單個細胞的體內轉錄狀態(tài)。2015年，哈佛醫(yī)學院的研究人員將微流控技術結合納升級液滴和條碼微珠，推出Drop-seq[6]和inDrop[7]技術，微珠直接捕獲mRNA，全部反應均在一個液滴中完成，產物濃度更高，且成本大大降低。2017年，Gierahn等[8]提出10xGemCode技術，該技術將條碼反應液滴以油滴封裝，反轉效率更高，可實現(xiàn)數(shù)千個免疫細胞的分析。2018年，Han等[9]開發(fā)的Microwell-seq是一個高吞吐量、低成本的scRNA-seq平臺，提高了單細胞檢測技術的豐度，但與涂有油滴的單細胞測序技術相比，它也降低了一個數(shù)量級的檢測成本。Rosenberg等[10]的SPLit-seq技術基于低成本組合條形碼的原理可對數(shù)十萬個細胞直接捕獲，不需要將單個細胞用油滴包裹形成獨立的單元極大簡化了步驟和節(jié)約了成本，實現(xiàn)每個細胞檢測成本小于1美分。直到今天單細胞測序技術更加準確、高效、多元化、低成本。到今天，單細胞測序已經廣泛用于癌癥、胚胎發(fā)育、神經生物學和免疫學等多個領域并取得了重大的突破。

1.2 單細胞測序類型

1.2.1 單細胞全基因組測序

單細胞基因組測序是從分離的單細胞中提取DNA后，擴增單細胞的全基因組，通過第二代DNA測序技術進一步進行測序分析[11]。這種測序技術主要用于發(fā)現(xiàn)DNA分子水平的異常。不僅可以發(fā)現(xiàn)疾病相關的突變，并且可以鑒定突變伴隨的細胞亞群，從而為疾病治療提供更特異的靶點[12]。首先是Navin等[13]通過流式細胞分離，對200個癌細胞分別進行單細胞全基因組測序，研究癌癥的進化，發(fā)現(xiàn)癌細胞分化過程中的異質性。后來Yang等[14]分別從一名46歲外源性型宮頸癌患者的新鮮腫瘤組織中采集了放療前和放療后的宮頸細胞，對每個細胞進行單細胞全基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)放療前和放療后的腫瘤細胞幾乎是2個獨立的克隆，放療前的主要亞群被殺死，放療前的次要亞群成為放療后的主要亞群。放射治療后，在腫瘤細胞中POU class 5 homeobox 1B（POU5F1B）中檢測到人乳頭瘤病毒（HPV）融合位點。結果表明，在POU5F1B中整合HPV的腫瘤細胞在放療后存活，放療前后腫瘤細胞表現(xiàn)出明顯的特征。這些結果為研究驅動宮頸癌放療耐藥的具體分子事件提供了新的思路。

1.2.2 單細胞全轉錄組測序

單細胞全轉錄組測序是從分離出的單細胞中進行單細胞分離和RNA提取后，需要先將捕獲到的mRNA逆轉錄成cDNA，然后通過PCR或其他轉錄方法對整個轉錄組進行擴增[8]。該技術在揭示細胞類型、確定細胞亞群、準確反映細胞間的異質性、描述細胞命運譜系等方面發(fā)揮了重要作用[15]。Paul等[16]發(fā)表在細胞（Cell）雜志上的工作，利用單細胞轉錄組測序對早期髓系祖細胞群體進行分析，將傳統(tǒng)定義的共同髓系祖細胞及其下游的粒系-單核系祖細胞和巨核-紅系祖細胞詳細劃分為18種亞群，并發(fā)現(xiàn)其對紅細胞、巨核細胞、單核細胞等下游細胞均具有不同程度的轉錄特異性。近期Dominguez等[17]利用單細胞轉錄組學，在動物模型中繪制了胰腺導管腺癌（PDAC）進展過程中的成纖維細胞結構，通過轉化生長因子和表達含有15（LRRC15）蛋白的富含亮氨酸的重復序列，確定了一組癌相關成纖維細胞（CAFs）。LRRC15* CAFs存在于22例PDAC患者的>80.000個單細胞和70例患者的免疫組織化學標本中，均證實了LRRC15* CAFs存在于人類患者中。此外。由6種癌癥類型的600多名患者參與的免疫治療臨床試驗顯示，LRRC15* CAF的表達水平升高與抗pd-l1治療的不良反應有關。這項工作對于靶向腫瘤微環(huán)境的非免疫元件以促進癌癥患者對免疫檢查點阻斷治療的反應具有重要的意義。

1.2.3 單細胞表觀基因組測序

表觀基因組測序主要針對DNA修飾和DNA甲基化和組蛋白修飾等方面進行研究，表觀基因組測序可以探索稀有細胞類型的表觀基因組變化并破解細胞群體中的表觀遺傳異質性[18]。Nagano等[19]的Hi-C法是最先被提出的單細胞表觀基因組測序方法，可在百萬堿基分辨率的基礎上識別單細胞水平的染色體相互作測序，引入單細胞Hi-C，結合全基因組的統(tǒng)計分析和單拷貝X染色體的結構建模，以表明單個染色體在巨堿基尺度上保持區(qū)域組織，但在更大的尺度上顯示可變的細胞間染色體結構，單細胞Hi-C數(shù)據(jù)在染色體基因組學和顯微學研究之間架起了橋梁，展示了動態(tài)染色體結構下的模塊化組織，以及這種結構與基因組活動模式之間的概率聯(lián)系。隨后，Guo等[20]用單細胞亞硫酸鹽測序法（scRRBS）可以檢測到單個小鼠胚胎干細胞（mESC）基因組中多達150萬個CpG位點的甲基化狀態(tài)，還可以檢測單倍體精子細胞中單個CpG位點的甲基化狀態(tài)，無論是未甲基化的還是完全甲基化的。此外，還發(fā)現(xiàn)，在小鼠受精卵的個體前核內，可以追蹤到受精后母體和父方基因組的去甲基化動力學，無論在雄性還是雌性原核中，基因區(qū)域的去甲基化過程都比基因間區(qū)域的去甲基化過程快。這種方法為探索單個細胞在胚胎發(fā)育等生理過程或腫瘤發(fā)生等病理過程中的單堿基分辨率的動態(tài)甲基化環(huán)境鋪平了道路。

1.2.4 單細胞多組學測序

近年來，單細胞技術使多組同步測序成為現(xiàn)實，這有助于更詳細地闡明單個細胞的基因組、轉錄組和表觀基因組之間的關系。單細胞三重組學測序是利用單個細胞釋放到上清液中的mRNA進行轉錄組測序。然后，用單細胞還原表征亞硫酸氫鹽測序法在含有基因組DNA的沉淀中檢測DNA甲基化序列和基因拷貝數(shù)的變化。最后，可以同時獲得單細胞基因組、轉錄組和DNA甲基化模式的數(shù)據(jù)以及它們之間復雜的網絡關系[21]。如Hou等[22]利用單細胞多組學測序，同時分析單個哺乳動物細胞的基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）、DNA甲基化組和轉錄組發(fā)現(xiàn)，大規(guī)模的拷貝數(shù)變異會導致獲得或丟失基因組區(qū)域內基因RNA表達的比例變化，而這些拷貝數(shù)變異通常不會影響這些區(qū)域的DNA甲基化。此外，將單細胞多組學測序應用于25個來源于人肝細胞癌組織樣本的癌細胞，根據(jù)CNVs、DNA甲基化組或單個細胞的轉錄組鑒定了這些細胞中的2個亞群。單細胞多組學測序在單細胞水平上同時詢問其組成成分的基因組、甲基化組和轉錄組，成為破解發(fā)育和癌癥中細胞群的異質性和復雜性的有力工具。單細胞多組學測序也可以用來研究腫瘤的進展和轉移。近期Bain等[23]優(yōu)化單細胞多組學測序研究人類結直腸癌細胞，全基因組的DNA甲基化水平在單個遺傳亞系中相對一致，然后對10例直腸癌患者的DNA進行了測序，發(fā)現(xiàn)其癌細胞的全基因組DNA去甲基化模式是一致的。癌細胞DNA去甲基化程度與正常組織中異染色質相關組蛋白修飾H3K9me3的密度和重復元素長時間穿插的核元素1的密度明顯相關，提示DNA甲基化譜在單一遺傳譜系或次世代內相對穩(wěn)定。原發(fā)腫瘤和轉移瘤DNA甲基化水平的差異可能主要是由亞家族成分的差異引起的，而非轉移過程中的去甲基化或去甲基化。由此可以證明用單細胞多組學測序重建遺傳譜系和追蹤其表觀基因組和轉錄組動力學的可行性。

1.3 單細胞測序技術基本流程

單細胞測序技術是近年來迅速發(fā)展的生命科學前沿技術，它在單細胞水平揭示細胞的基因結構和基因表達狀態(tài)，反映細胞間的異質性具有獨特的優(yōu)勢，為生命科學的研究打開了新的大門。該技術一般流程可分為單細胞分離、核酸擴增、高通量測序、數(shù)據(jù)分析這幾個步驟[24-25]。簡要流程見圖1。

2 單細胞測序在醫(yī)學領域中的應用

2.1 腫瘤

首先應用最廣的是腫瘤方向的研究，在腫瘤研究中的應用表明，遺傳或基因組變異可導致腫瘤組織內具有不同遺傳和表型特征的細胞，使腫瘤組織具有高度異質性。這種高度的異質性可能與腫瘤發(fā)生和轉移的機制有關[26-31]，傳統(tǒng)的測序方法只能檢測到細胞的數(shù)量，得到一組細胞的平均信號，掩蓋腫瘤細胞的異質性。單細胞測序技術可以很好的彌補傳統(tǒng)測序方法的不足，通過檢測腫瘤細胞的異質性，繪制腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境的細胞圖譜，進一步明確腫瘤組織內的細胞群，尋找特異性標志物，解釋腫瘤發(fā)生、轉移等一系列問題。最早Navin等[13]使用單細胞mRNA測序（scRNA-seq）了解乳腺癌的起源首次單核測序分析基因組拷貝數(shù)變異，研究2例乳腺癌患者的腫瘤種群結構和進化。結果在腫瘤中發(fā)現(xiàn)了間斷的克隆進化，并證實了轉移細胞是從主要的晚期擴展中出現(xiàn)的。近期，Zhang等[31]對結直腸癌患者的免疫和基質人群進行了scRNA-seq分析，確定了特異性巨噬細胞和常規(guī)樹突狀細胞（cDC）亞群作為腫瘤微環(huán)境中細胞串音的關鍵遞質。在小鼠腫瘤中定義可比較的髓細胞群，能夠表征它們對髓細胞靶向免疫治療的反應。他們使用抗csf1r的具有炎性反應信號的優(yōu)先耗竭巨噬細胞進行治療，但保留小鼠和人類中表達促血管生成/致瘤基因的巨噬細胞群，CD40激動劑抗體的治療優(yōu)先激活cDC人群，增加Bhlhe40類th1細胞和CD8記憶T細胞。這項發(fā)現(xiàn)對人和小鼠關鍵的骨髓亞群的綜合分析確定了調節(jié)腫瘤免疫的關鍵細胞相互作用，并確定了髓樣靶向免疫治療的機制。綜上所述，單細胞測序在探究腫瘤的發(fā)生和轉移具有獨特的優(yōu)勢。

2.2 生殖和胚胎醫(yī)學

單細胞測序技術可以在單細胞水平上對生殖細胞和胚胎細胞的全基因組進行測序和定量，這將有助于了解生殖細胞的發(fā)生以及生殖和遺傳疾病的篩查、診斷和治療。單細胞測序用于生殖和胚胎發(fā)育領域在鑒定細胞類型、探究細胞異質性、推斷細胞發(fā)育軌跡方面具有獨特的優(yōu)勢。例如Vento-Tormo等[32]用單細胞測序技術對妊娠早期胎盤細胞進行了單細胞轉錄組分析，并繪制了胎盤細胞圖譜。通過細胞圖譜發(fā)現(xiàn)了位于不同蛻膜層和蛻膜自然殺傷細胞的血管周細胞和基質細胞的3個亞群，且具有獨特的免疫調節(jié)和趨化特性，揭示了蛻膜和胎盤的細胞組織，以及對胎盤形成和生殖成功至關重要的相互作用。這些發(fā)現(xiàn)對了解早期妊娠過程有重要意義。

2.3 神經生物學

在神經系統(tǒng)中，單個神經元之間存在差異，單細胞測序技術可以研究許多不同時期的神經細胞，并繪制詳細的單細胞圖，以了解和識別大腦中不同類型的神經元及其連接分子[33]。如Luo等[34]通過高通量單細胞甲基化測序將小鼠和人類額葉皮層神經元細胞的亞型分化。他們在人類額葉皮層中發(fā)現(xiàn)了一組新的神經元，并基于神經元的甲基化組重新定義了神經元類型。近期Perlman等[35]分析了包括髓鞘形成高峰時間在內的不同年齡段的人類腦組織，發(fā)現(xiàn)了3個不同的細胞亞群，包括早期OPC（e-OPC）組、晚期OPC組（l-OPC）和成熟的OL（MOL）組，并將具有階段特異性功能的少突細胞譜系細胞的轉錄組特征聯(lián)系起來，豐富了e-OPCs的基因本體論術語包括細胞周期和發(fā)育，l-OPCs包括細胞外基質和細胞黏附，而MOLs包括髓鞘化和細胞骨架。e-OPCs多局限于早幼粒細胞形成的胎兒組，l-OPCs多見于兒童年齡組，與早幼粒細胞形成的高峰年齡相對應。這些發(fā)現(xiàn)強調了醇系細胞在髓鞘形成高峰之前、期間和之后的轉錄組變異性，有助于識別實現(xiàn)髓鞘形成所需的新途徑。綜上所述，單細胞測序技術是研究神經細胞種類，發(fā)育、再生、分化的有力工具。

2.4 免疫學

單細胞測序技術可以幫助我們探索生理和病理狀態(tài)下免疫細胞狀態(tài)和分化軌跡。Stewart等[36]使用單細胞測序描繪了人類腎臟的時空免疫拓撲結構，揭示了上皮細胞內免疫基因的解剖學定義的表達模式，在胎兒和成熟的腎臟中，組織內存在的髓樣和淋巴樣免疫細胞網絡都是明顯的，并且在出生后，上皮免疫協(xié)同抗菌巨噬細胞和中性粒細胞定位于腎臟最易感染的區(qū)域，轉錄程序的獲得促進了感染防御能力，進一步完善了人類腎臟的免疫系統(tǒng)是如何分區(qū)以應對免疫挑戰(zhàn)的概覽。Reyes等[37]發(fā)現(xiàn)了敗血癥患者的免疫細胞類型的轉錄狀態(tài)變化，利用單細胞RNA測序來分析膿毒癥患者的外周血單個核細胞（PBMCs，106 545個細胞）和樹突狀細胞（19 806個細胞），并根據(jù)它們的基因表達譜聚類，定義了16種免疫細胞狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)了一種獨特的CD14單核細胞狀態(tài)，這種狀態(tài)在膿毒癥患者中得到了擴展，確定了一組用于分離和定量單核細胞狀態(tài)的表面標記，并對其表觀基因組和功能表型進行了表征，并提出了一個從人類骨髓誘導單核細胞狀態(tài)的模型。這項研究證明了單細胞基因組學在發(fā)現(xiàn)疾病相關的細胞學特征方面的實用價值，并為深入了解細菌敗血癥免疫失調的細胞基礎提供了思路。

以上列舉了單細胞測序應用最廣泛的幾個領域，近年來，隨著技術的不斷發(fā)展不僅促進醫(yī)學領域的發(fā)展，也廣泛用于微生物學、農林牧漁等，大大推進了生命科學的發(fā)展進程。作為“在單個細胞水平上對基因組進行測序”的單細胞測序技術能夠解決傳統(tǒng)測序的下列難題：1）能得到每個細胞所獨有的特質; 2）可以研究難以在實驗室培養(yǎng)擴大，樣品量又不能滿足全基因組測序分析的要求的樣本，例如腫瘤循環(huán)細胞、組織微陣列、早期發(fā)育的胚胎細胞等; 3）能檢測到微量的基因表達了罕見非編碼RNA[38]。其獨特的優(yōu)勢開啟了生命科學探索的新天地。

3 單細胞測序在中醫(yī)藥研究中的應用

結合現(xiàn)代醫(yī)學的科研思路，利用單細胞測序技術的優(yōu)勢可以從單個細胞水平闡明中醫(yī)學方藥、針灸等的作用機制的難題，為中醫(yī)藥研究提供新的探索思路。

3.1 單細胞測序在中醫(yī)復方作用機制的應用

中醫(yī)臨床治療疾病，以中藥復方為主要手段。實踐證明，大多數(shù)疾病的療效，是通過大量中藥有效成分來發(fā)揮作用的，因此不能通過傳統(tǒng)的單靶標藥物篩選來研究中藥有效成分，而應從多靶點的研究策略出發(fā)。長期以來，由于中藥復方成分過于復雜，為其機制研究帶來很大難度。中藥復方的作用是對人體整體的證候狀況而采用的整體調節(jié)，實質上也最終對基因組的整體作用[39]。利用單細胞測序技術可以解決一些復方機制研究的限制。如Liang Q等[40]證明左歸丸可改變能量代謝基因的表達，防止高糖小鼠胚胎細胞死亡。他們發(fā)現(xiàn)左歸丸對成人及其后代的糖耐量受損（IGT）都有益處，但是其作用機制尚不明確。把所有受精卵隨機分為3組：對照組、模型組和藥物組。每組9個受精卵。各組受精卵的培養(yǎng)培養(yǎng)基為：對照組采用細胞培養(yǎng)基，模型組采用補充高糖15.6 mmol/L的細胞培養(yǎng)基，藥物組采用與模型組相似但添加了含0.01% v/v左歸丸的大鼠血清的培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)五天后（2-細胞期胚胎），采用顯微操作技術單細胞分離，進行單細胞RNA轉錄組測序。用DESeq2進行差異基因表達分析，結果，高糖可以下調核糖體通路的基因，而左歸丸可以逆轉這種下調，從而防止高糖引起的胚胎細胞死亡。此外，高糖可影響糖代謝，影響線粒體功能，而左歸丸主要通過三羧酸循環(huán)上調呼吸鏈基因和氧化磷酸化促進糖代謝從而對葡萄糖負荷引起的胚胎細胞死亡有保護作用。單細胞RNA測序技術不僅揭示了高糖影響2-細胞期胚胎的基因調控變化，而且為深入了解左歸丸在糖耐量受損模型上的潛在分子機制提供了思路。

3.2 單細胞測序應用于中藥作用機制的研究

幾千年的中醫(yī)藥學有其獨特的優(yōu)勢，但受到有效成分及作用機制不明確等因素影響而不能被西醫(yī)體系所普遍接受。因此，在中藥研究方面，篩選治療疾病的有效藥物并探討其作用機制歷來是其重要內容。目前，由于出現(xiàn)了系統(tǒng)的多靶點藥物設計策略，全球對傳統(tǒng)草藥的興趣有所增加。中藥成分、相應的蛋白靶點、靶點參與的生物過程、藥物靶點相互作用和靶點-靶點相互作用是了解中藥分子機制的必要條件。

單細胞測序完善了各類相關數(shù)據(jù)庫。由于基于網絡的多靶點藥物設計方法可以整合不同平臺上的相關信息，因此，它們將更有助對比分析出中藥治療疾病的作用機制。Sun Y等[41]以阿爾茨海默?。ˋD）中草藥研究為例，通過對臨床試驗抗AD中草藥的研究，論證了基于網絡的中醫(yī)不同數(shù)據(jù)源整合的價值，提示雪蓮可能主要通過改善癥狀的方式產生抗阿爾茲海默作用，而丹參的作用靶點主要參與炎性反應和癌相關通路，銀杏在這些的基本途徑中靶點分布更為多樣化，表明其抗阿爾茲海默作用更為廣泛。

單細胞測序在中藥物種鑒定、種質資源開發(fā)和系統(tǒng)發(fā)育關系等方面的研究也具有獨特的優(yōu)勢，如：Ai H L等[42]利用單細胞測序和基因組裝算法[43]的出常見中藥射干的完整的質體基因組。瓜蔞，是治療各種疾病的基本中藥。Yang等[44]研究已經確定了該菌葉綠體基因組的完整序列?？偦蚪M長度為157 481 bp，包含一對26 268 bp的反向重復序列（IRs），分別被大單拷貝（LSC）和小單拷貝（SSC）分離，分別為86 478 bp和18 467 bp。共預測130個基因，其中蛋白編碼基因85個，rRNA基因8個，tRNA基因37個。進一步的系統(tǒng)發(fā)育分析證實了天牛屬葫蘆科。其完整的葉綠體基因組將在植物系統(tǒng)發(fā)育和種群遺傳研究的分子標記開發(fā)中發(fā)揮重要作用?；诰W絡的各種數(shù)據(jù)庫和組學數(shù)據(jù)的整合，這不僅有助于對疾病發(fā)病機制的整體理解，而且為今后中藥在藥物發(fā)現(xiàn)中的應用提供了新的線索。

4 小結

單細胞測序技術是在單個細胞水平上，對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序的新技術，能夠揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態(tài)。單細胞測序技術在中醫(yī)藥研究中的應用是一個特別值得探索的領域，對細胞的異質性的研究能夠解決中醫(yī)藥科研上的某些難題。目前中醫(yī)藥領域已經有利用單細胞測序技術對中藥、方劑的作用機制的探索。將技術方法與傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究有機結合，在中醫(yī)藥基礎和臨床研究的思路與方法上有所創(chuàng)新，隨著技術的進步和成熟，將會對中醫(yī)藥研究帶來重大突破。利用現(xiàn)代的新技術為傳統(tǒng)的中醫(yī)學抽象的理論尋找物質基礎，可大大加快中醫(yī)學被現(xiàn)代醫(yī)學和全世界接受的進程。

5 討論

目前，單細胞測序在中醫(yī)藥領域的應用還非常少，但是卻有巨大的發(fā)展?jié)摿?，我們可以從其他領域的研究成果中獲得靈感，探索中醫(yī)藥未知的領域。例如：

5.1 中醫(yī)診斷學

中醫(yī)診斷學是根據(jù)中醫(yī)學的理論，研究診察病情、判斷病種、辨別證候的基礎理論、基本知識和基本技能的一門學科，中醫(yī)辨證論治是中醫(yī)診斷學重要的組成部分，但是辨證論治原理需要用現(xiàn)代科學技術來證明其科學性。以中醫(yī)辨證治療骨關節(jié)炎為例：骨關節(jié)炎在中醫(yī)屬“痹癥”范疇，中醫(yī)將骨性關節(jié)炎辨證分為四型，分別是：風寒濕痹、氣血瘀阻、濕熱痹阻和肝腎虧虛?？梢岳脝渭毎麥y序來探究不同證型的分子生物學依據(jù)。參考Quanbo等[45]對骨關節(jié)炎（OA）患者的軟骨細胞進行單細胞全轉錄組測序、分析，使用嚴重程度指數(shù)和對應分析研究了OA景觀的轉錄計劃與臨床結果之間的關系，得出了關于臨床結果的預測指標，明確了不同細胞類型在OA早期診斷和治療中的作用，病變的滑膜組織相對于正?；そM織之間，以及不同疾病的滑膜組織之間，其組成的細胞群類型是有區(qū)別的，可以通過對不同時期的不同的細胞類型進行測序分析，得到不同時期滑膜中具有特異性基因表達的不同細胞群，從而對疾病進行分期，了解疾病不同時期的差異性表達的結果。如果將其應用于一個大的患者群體中，單細胞測序還可以揭示功能性病理標記，從而區(qū)分疾病不同的臨床軌跡和治療反應[46-47]。同樣，我們將單細胞測序用于中醫(yī)辨證分型的研究，不僅能闡釋其科學性，還能使其更加規(guī)范化與標準化。

5.2 方藥、針灸等治療疾病的機制研究

中醫(yī)內服的湯劑、外治針灸療法對各個系統(tǒng)的疾病均有明顯的臨床療效，但是由于其作用機制與靶點尚不明確，加上治療手段沒有標準化，這些問題成為中醫(yī)走向世界的阻礙。現(xiàn)代科學技術單細胞測序技術與中醫(yī)相結合，進一步促進中醫(yī)藥機制研究，以腫瘤防治為例：從中藥中提取分離得到的抗腫瘤成分，包括三尖杉堿、紫杉醇、羥基喜樹堿和長春堿類等，已經成為療效明確的抗腫瘤藥物[48]。參考Guo等[49]對來自14個藥物治療前非小細胞肺癌患者的外周血、癌旁組織和癌組織中T細胞進行了單細胞轉錄組測序，描繪了已知的免疫治療靶點基因在不同T細胞亞群中的表達分布，揭示了不同的免疫治療藥物可能靶向的細胞類群。中醫(yī)藥治療手段的靶點和機制等研究，可以利用單細胞測序來實現(xiàn)。

單細胞測序技術用于中醫(yī)藥研究仍然存在一定的局限，該技術操作復雜而且成本較高，高擴增偏倚、低準確度。目前階段能夠檢測的細胞數(shù)量受到一定限制，因此難以避免不同樣本、個體以及不同研究間存在數(shù)據(jù)偏差。希望隨著技術的優(yōu)化，標準的統(tǒng)一以及樣本量的增加，這種偏差逐漸減小。隨著測序技術的不斷發(fā)展，單細胞測序技術必然會更加高效、高保真、低成本。單細胞測序技術為中醫(yī)藥研究領域揭開新的篇章，我們相信隨著單細胞測序技術的不斷優(yōu)化，多組學研究的結合以及時空層面的多維應用，為中醫(yī)機制的探索提供了有力的支持。如果我們有計算工具可以整合基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、微生物組學、藥物基因組學和臨床樣本的相關信息，這些數(shù)據(jù)將更有助于在分子網絡的背景下理解中醫(yī)的整體、互補和協(xié)同本質，將大大加快中醫(yī)藥走向世界的進程。

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（2020-05-10收稿 責任編輯：徐穎）