四逆散對FD大鼠十二指腸杯狀細胞及MUC2的影響

朱春洋　趙魯卿　趙靜怡　張聲生

摘要 目的：探討四逆散對功能性消化不良（FD）大鼠十二指腸杯狀細胞及黏蛋白2（MUC2）表達的影響。方法：將30只SD大鼠隨機分為正常組、模型組及四逆散觀察組，每組10只。采用幼年碘乙酰胺灌胃聯(lián)合夾尾應激刺激方法誘導FD動物模型，正常組及模型組給予生理鹽水灌胃，四逆散觀察組予四逆散中藥水煎劑灌胃。取大鼠局部十二指腸組織進行HE染色觀察以十二指腸組織基本形態(tài)，AB-PAS染色觀察杯狀細胞數(shù)量情況，免疫組織化學（IHC）觀察MUC2蛋白表達情況，定量PCR（qPCR）檢測MUC2 mRNA表達情況。結(jié)果：HE染色顯示3組大鼠十二指腸基本形態(tài)未見明顯異常;與正常組比較，模型組大鼠十二指腸杯狀細胞數(shù)量明顯減少;MUC2 mRNA及免疫陽性表達均明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，四逆散觀察組以上指標均較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：四逆散可能通過增加FD大鼠杯狀細胞數(shù)量和增加MUC2的表達，改善十二指腸黏液屏障，從而對FD起到治療作用。

關(guān)鍵詞 功能性消化不良;四逆散;十二指腸;杯狀細胞;黏蛋白2;黏液屏障;大鼠;機制研究

Abstract Objective：To investigate the effects of Sini Powder on goblet cells and the expression of mucin 2 （MUC2） in the duodenum of functional dyspepsia （FD） rats.Methods：A total of 30 SD rats were randomly divided into 3 groups with 10 rats in each group，including a control group，a model group and a Sini Powder treatment group.The FD animal model was induced by intragastric juvenile iodoacetamide gavage combined with tail clip stress stimulation.Normal group and model group were given intragastric saline.The Sini Powder treatment group rats was given Chinese medicine decoction of Sini Powder for intragastric administration.The local duodenal tissue of rats was taken for HE staining to observe the basic morphology of the duodenal tissue，for AB-PAS staining to observe the number of goblet cells，for immunohistochemistry （IHC） to observe the expression of MUC2 protein，for quantitative PCR （qPCR） detection of MUC2 mRNA expression.Results：HE staining showed that the basic morphology of the duodenum of rats was normal in the 3 groups.Compared with the normal group，the number of duodenal goblet cells in the model group was significantly reduced; MUC2 mRNA and immunopositive expression were significantly lower than the control group （P<0.01，P<0.01），the difference was statistically significant.Compared with the model group，the above indexes of the Sini Powder treatment group were significantly higher than the model group （P<0.01，P<0.05），the difference was statistically significant.Conclusion：Sini Powder can restore mucus barrier by increasing the number of goblet cells in duodenum，regulating the expression of MUC2 so as to treat FD.

Keywords Functional dyspepsia; Sini Powder; Duodenum; Goblet cell; MUC2; Mucus barrier; Rat; Mechanisms research

中圖分類號：R289.4;R573.9文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.012

功能性消化不良（Founctional Dyspepsia，F(xiàn)D）是消化科最常見的疾病之一，發(fā)病率居高不下[1]。現(xiàn)代醫(yī)學治療FD多以對癥治療為主，包括抑酸、促動力、抗抑郁等治療尚不能滿足臨床需要。四逆散出自《傷寒論》，具有透邪解郁、調(diào)和肝脾之效，是臨床治療FD的常用方劑。前期研究發(fā)現(xiàn)[2]，四逆散能夠修復FD大鼠十二指腸黏膜屏障功能，調(diào)節(jié)上皮緊密連接，改善十二指腸微炎性反應狀態(tài)。杯狀細胞及其分泌的黏蛋白2（Mucin 2，MUC2）是十二指腸上皮化學及機械屏障的重要組成部分，對維持十二指腸屏障的完整性對十二指腸的正常功能具有重要意義[3]。但四逆散對十二指腸杯狀細胞及MUC2的影響尚未可知。本研究從觀察十二指腸杯狀細胞數(shù)量及MUC2表達入手，探討四逆散治療FD可能的靶點及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取健康雄性SD大鼠30只，7日齡，SPF級，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，飼養(yǎng)于于中國中醫(yī)科學院基礎醫(yī)學研究所屏障級實驗動物室。飼養(yǎng)環(huán)境：恒濕（65%～70%）、恒溫（22±1）℃，12 h光照/黑暗循環(huán)，所有動物均自由飲食飲水。適應性飼養(yǎng)3 d后開始造模。

1.1.2 藥物

四逆散（由柴胡、白芍、枳實、甘草組成），購買于首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院草藥房。按照人與大鼠用藥劑量換算方法[4]，以臨床等效劑量作為治療FD動物模型用藥劑量，制備水煎劑，生藥含量0.42 g/mL。

1.1.3 試劑與儀器

Trizol（美國Ambion公司，貨號：15596026）、GoScript Reverse Transcription System（美國Promega公司，貨號：A5001）、GoTaq Qpcr Master Mix（美國Promega公司，貨號：A6001）、AB-PAS染液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1049）、免疫組織化學試劑（長沙伯瑞克公司，貨號：BIH0003）、MUC2抗體（博士德生物工程有限公司，貨號：BM5029）、HE染液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1005-500）、通用型組織固定液（合肥Biosharp公司，貨號：BL539A）、粘附載玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司，188105型）、蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司，10212440C型）、石蠟切片機（德國Leica公司，RM2255型）、顯微鏡（德國Carl Zeiss公司，Axio Scope A1）、石蠟包埋機（德國Leica公司，EG1150C型）、攤片機（德國Leica公司，HI1210型）、紫外分光光度計（德國eppendorf公司，6138000018型）、定量PCR檢測儀（美國Bio-Rad公司，CFX96型）、高通量組織研磨儀（深圳信儀測控技術(shù)有限公司，Scientz-48型）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將10日齡大鼠隨機分為正常組、FD模型組和四逆散觀察組，每組10只。10日齡起正常組予以2%蔗糖溶液灌胃;FD模型大鼠采用幼年碘乙酰胺灌胃聯(lián)合夾尾應激刺激法造模[5]。模型組和四逆散觀察組予0.1%的碘乙酰氨與2%的蔗糖混合液灌胃，均為1次/d，持續(xù)6 d。至7周齡起，進行夾尾刺激。大鼠每籠5只，以長海綿鉗夾大鼠遠端1/3處尾巴，使其激怒，并與同籠大鼠廝打以激怒全籠。持續(xù)刺激30 min/次。刺激1次/4 h，3次/d，連續(xù)造模7 d。

1.2.2 給藥方法

夾尾刺激7 d后，四逆散觀察組予四逆散水煎劑灌胃（1 mL/100 g），正常組與FD組予以等容積0.9%生理鹽水灌胃，均為1次/d，共灌胃7 d。四逆散觀察組與FD模型組灌胃期間繼續(xù)予以夾尾刺激。

1.2.3 檢測指標及方法

1）HE染色觀察十二指腸組織形態(tài)：

剪取大鼠十二指腸組織，于4%多聚甲醛中固定，脫水、包埋、切片（厚度8 μm）;常規(guī)脫蠟至水，依次經(jīng)蘇木精及伊紅染液染色，二甲苯透明，中性樹脂封片，于顯微鏡下拍照觀察。

2）AB-PAS染色法觀察杯狀細胞：

取大鼠十二指腸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，依次經(jīng)阿利新藍染液浸染、0.5%高碘酸水溶液氧化、雪夫試劑暗處浸染，經(jīng)蘇木精復染核，鹽酸乙醇分化，氨水返藍，二甲苯透明后中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察拍照。

3）免疫組織化學法觀察MUC2蛋白表達：

與大鼠十二指腸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鈉溶液抗原修復，滴加過氧化物酶阻斷劑，封閉，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察拍照。采用Image pro plus軟件分析各組照片的平均光密度值（IOD/Area）。

4）qPCR檢測MUC2 mRNA表達：

取大鼠十二指腸組織，trizol法提取組織總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進行qPCR反應。采用2-△△Ct進行RNA相對表達量分析。MUC2上游引物：5′-GGCTCTGCTCTCTGTGTTATAG-3′，下游引物：5′-CAGTTTGGGAAGAAGGTAGGG-3′;β-actin上游引物：5′-AGTTGCGTTACACCCTTT C-3′，下游引物：5′-CACCTTCACCGTTCCAGT-3′。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)標準差（±s）表示，采用單因素方差分對各組數(shù)據(jù)進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察十二指腸組織形態(tài)

HE染色結(jié)果顯示，各組大鼠十二指腸基本形態(tài)均未見明顯異常。見圖1。

2.2 3組大鼠十二指腸AB-PAS染色

與正常組比較，模型組大鼠十二指腸內(nèi)杯狀細胞數(shù)量明顯減少;經(jīng)四逆散治療后，觀察組十二指腸杯狀細胞數(shù)量明顯上升。見圖2。

2.3 3組大鼠MUC2 mRNA水平

模型組大鼠十二指腸局MUC2 mRNA相對表達量明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），觀察組MUC2 mRNA水平較模型組明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.4 3組大鼠十二指腸MUC2蛋白表達

與正常組比較，模型組大鼠十二指腸MUC2蛋白平均光密度值（IOD/Area）明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，觀察組大鼠十二指腸MUC2蛋白平均光密度值明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖3及表2。

3 討論

中醫(yī)認為FD屬“胃痞”“胃痛”等范疇，主要責之肝、脾、胃，其中以脾虛為本，肝郁為機[6]。脾胃主中焦，乃后天之本，脾胃虛損則升降失和，納運不調(diào)，氣郁不行，則發(fā)為痞滿，如《丹溪心法》云“脾氣不和，中央痞塞，皆土邪之所為也”。《雜兵源流犀濁·腫脹源論》“痞滿，脾病也”。而脾胃賴肝之疏泄調(diào)達，若肝氣郁結(jié)，疏泄失職，橫犯脾胃，則三者功能失調(diào)，病證愈顯。故臨床治療FD也多從疏肝健脾理氣入手。此外，本研究通過碘乙酰胺灌造成幼鼠胃腸道的輕微炎性反應，從中醫(yī)角度上看，屬于外邪犯胃，造成脾胃損傷，致脾胃素虛;而大鼠成年后，通過夾尾應激刺激造成了大鼠焦慮、緊張、激怒等情緒，“七情內(nèi)傷，脾胃先病”，而致肝郁脾虛，氣機郁滯不行。

FD發(fā)病機制相對復雜，目前認為是腦腸互動異常、胃動力異常、胃順應性下降、內(nèi)臟敏感性增高等因素綜合作用的結(jié)果[7]。而近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)十二指腸結(jié)構(gòu)和功能的異常在FD的發(fā)病中也起到了重要作用，尤其是十二指腸屏障功能的損傷[8]。Ishigami等[9]發(fā)現(xiàn)FD患者的十二指腸黏膜通透性較正常人群明顯增加，這說明FD患者十二指腸屏障功能遭到了破壞。當十二指腸屏障受損時，會引起十二指腸對酸、脂質(zhì)的高敏感、激活炎性細胞等功能異常，從而引起或加重FD的癥狀[10]。黏液屏障是十二指腸屏障能的重要組成部分之一，可以起到潤滑和保護腸黏膜上皮，參與細胞間信號傳導和相關(guān)免疫因子調(diào)控等重要作用[11]。腸黏液屏障是腸屏障功能的重要組成部分，杯狀細胞分泌的MUC2是其最主要的成分，具有減緩H+擴散速度、減輕腸道內(nèi)酸高敏感狀態(tài)、維持腸道內(nèi)菌群平衡等重要作用[12-13]。雖然目前研究結(jié)果提示FD患者存在十二指腸屏障功能的異常，但對其黏液屏障功能的進一步研究尚不足。本研究發(fā)現(xiàn)碘乙酰胺聯(lián)合夾尾應激刺激聯(lián)合方法誘導FD大鼠模型，引起了其十二指腸杯狀細胞的減少及其代謝產(chǎn)物MUC2表達的降低。

四逆散是中醫(yī)經(jīng)典方劑之一，臨床運用千年，功擅調(diào)肝理脾，是治療FD的常用中醫(yī)組方之一。方中柴胡解郁行氣，枳實降胃導滯，二者共用以暢氣樞機;芍藥柔肝斂陰，甘草緩急和中，柔緩并濟，諸藥共用以調(diào)肝理脾，降胃和中。四逆散治療FD具有較扎實的臨床研究基礎。李瑞鋒[14]研究發(fā)現(xiàn)四逆散治療FD具有良好的臨床療效，其在癥狀緩解和防止復發(fā)方面與單純西藥比較均具有顯著優(yōu)勢。陳麗[15]研究發(fā)現(xiàn)四逆散組方能夠改善FD伴抑郁狀態(tài)患者的臨床癥狀，并改善抑郁等不良情緒。此外，四逆散治療FD具有多靶點、多成分協(xié)同起效的特點。四逆散組方之一的枳實能夠促進FD大鼠胃Cajal間質(zhì)細胞增殖，并調(diào)節(jié)其SCF/c-Kit信號通路的表達[16]。四逆散有效成分（辛弗林、芍藥苷、甘草酸）通過調(diào)節(jié)5-HT通路中5-HT、TPH1、5-HT3R等多靶點起到降低內(nèi)臟敏感性的作用[17]。但目前針對四逆散治療FD的相關(guān)研究主要集中于其對胃動力、敏感性等，其是否能夠影響杯狀細胞及其分泌產(chǎn)物MUC2尚未可知。本研究顯示，經(jīng)四逆散治療的FD大鼠與模型組比較，十二指腸杯狀細胞數(shù)量明顯增加，MUC2免疫陽性表達（IOD/Area）明顯上升，MUC2 mRNA表達水平顯著上升，這提示四逆散對杯狀細胞及其分泌產(chǎn)物MUC2的影響可能是其治療FD的部分機制。這些研究結(jié)果一定程度上加深了對四逆散多靶點治療機制的認識，也為本方的臨床應用提供了更多依據(jù)。

綜上所述，四逆散對十二指腸杯狀細胞及其分泌產(chǎn)物MUC2可能是其治療FD的機制之一。但由于本研究僅評價了十二指腸杯狀細胞及其分泌產(chǎn)物的改變，故對其上游通路的影響尚不明確;且中草藥具有多成分構(gòu)成的特點，其藥物之間的相互作用仍需進一步深入研究。

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（2019-04-20收稿 責任編輯：楊覺雄）