響應(yīng)面法優(yōu)選達原飲顆粒的提取工藝

歐陽煒　朱雅玲　洪篤云

摘要 目的：優(yōu)選達原飲顆粒的最佳提取工藝。方法：采用Box-Behnken響應(yīng)面法，以浸膏得率與厚樸酚、和厚樸酚含量的總評歸一值為評價指標(biāo)，對達原飲顆粒提取工藝條件進行優(yōu)選。結(jié)果：得到達原飲顆粒的最優(yōu)值為提取次數(shù)2.42次，提取時間0.96 h，加溶劑量10倍，預(yù)測值OD=0.948，根據(jù)實際生產(chǎn)選擇最優(yōu)條件為提取時間55 min，加水量10倍，提取2次，OD=0.895。結(jié)論：優(yōu)選得到的提取工藝經(jīng)驗證重復(fù)性高，結(jié)果穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞 達原飲顆粒;提取工藝;Box-Behnken響應(yīng)面法;含量測定;厚樸酚;和厚樸酚;瘟疫;經(jīng)典方

Abstract Objective：To optimize extraction process of Dayuan Granules.Methods：Based on Box-Behnken design-response surface method，the sum of the extraction yield，magnolol，and magnolol content were the evaluation index and the extraction process conditions of Dayuanyin Granules was optimized.Results：The optimal value of Dayuanyin Granules was 2.42 extraction times，0.96 h extraction time，10 times the amount of solvent added，and the predicted value OD=0.948.According to the actual production，the optimal conditions were selected as 55 minutes extraction time and 10 times the amount of water added.Extracted twice，OD=0.895.Conclusion：The optimized extraction process has been verified to have high repeatability and stable results.

Keywords Dayuan Granules; Extraction technology; Box-behnken response surface method;Content determination; Magnolol; Honokiol; Pestilence; Classic prescriptions

中圖分類號：R284文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.011

達原飲是明代吳又可《溫疫論》中的經(jīng)典方，處方組成：檳榔、厚樸、草果、知母、芍藥、黃芩、甘草。具有開達膜原，辟穢化濁的功效。古代用于治療瘟疫、時疫，為疏利疫邪之要方?，F(xiàn)代主要用于辨證為濕熱穢濁，郁伏膜原引發(fā)的發(fā)熱癥狀[1-2]。在各種流感病毒流行越來越猛烈的今天，西藥在治療上越顯乏力，在“SARS”“H7N9”“新型冠狀病毒”時期，中醫(yī)藥都發(fā)揮出了優(yōu)勢，開發(fā)有臨床療效的經(jīng)方驗方意義深遠(yuǎn)[3-5]。本研究將采用Box-Behnken響應(yīng)面法（BBD-RSM）對達原飲的制備工藝進行優(yōu)選，并開發(fā)為院內(nèi)制劑。BBD-RSM法是一種評估考察因素非線性影響的響應(yīng)曲面方法，并根據(jù)函數(shù)表達式計算最優(yōu)值，然后找到各考察因素間的最佳組合。因此，BBD-RSM能找到整個區(qū)域上的最佳水平。因擁有比正交實驗高的精密度，比其他響應(yīng)面法較少的實驗次數(shù)，不需要多次連續(xù)實驗，且可以對實驗結(jié)果進行預(yù)測，常用于提取工藝尋找最優(yōu)工藝[6]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海）、ZK-82A真空干燥箱（上海）、Bp211D電子分析天平（德國）。

1.2 試劑 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院（厚樸酚：批號110729-201714、和厚樸酚：批號110730-201614）。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3 分析樣品藥材 檳榔、厚樸、草果、知母、芍藥、黃芩、甘草由廣東省第二中醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)檢驗均符合《中華人民共和國藥典》2015版一部各飲片項下要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸酚與和厚樸酚的含量測定[7]

2.1.1 色譜條件色譜柱 Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：甲醇-水（70∶30）;波長：294 nm;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min。

2.1.2 對照品溶液制備分別精密稱取兩對照品，加甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，制成含厚樸酚924.1 mg/L的對照品溶液和含和厚樸酚463.6 mg/L對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備精密稱取達原飲提取液2 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，精密稱重后超聲（500 W，40 kHz）30 min，放至常溫，精密稱重并加甲醇補重至超聲前重量，搖勻，濾過，取濾液。

2.1.4 陰性樣品溶液制備按達原飲提取液的提取方法，去除厚樸，制成陰性提取液，按照“2.1.3”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取濃度為2、4、8、10、12、14 μL的厚樸酚對照品溶液、2、8、12、16、20、24 μL的和厚樸酚對照品溶液，橫坐標(biāo)為對照品濃度（μg/mL），縱坐標(biāo)為峰面積值，求得回歸方程：厚樸酚Y=39 727X+6 102.4，r=0.999 6;和厚樸酚Y=41 225X+1 622.1，r=0.999 7。厚樸酚在1.848～12.94 μg范圍內(nèi)，和厚樸酚在0.927 2～11.13 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗精密吸取厚樸酚（924.1 mg/L）對照品溶液，和厚樸酚（463.6 mg/L）對照品溶液各10 μL，按照2.1.1項連續(xù)進樣6次，測得厚樸酚峰面積及和厚樸酚峰面積，RSD分別為0.64%、0.71%（n=6），符合RSD<2%的要求，該儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液7份，按2.1.1項在制備后的0、2、4、6、8、10、12 h進樣分析，測得厚樸酚的RSD1.31%（n=6），和厚樸酚峰面積的RSD1.52%（n=6），供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗按上面方法制得達原飲供試品溶液6份，進樣測定并計算厚樸酚與和厚樸酚的含量。厚樸酚含量的RSD為0.81%（n=6）、和厚樸酚含量的RSD為1.62%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.9 加樣回收試驗取已知含量的達原飲提取液，分別加入適量厚樸酚與和厚樸酚對照品溶液（厚樸酚924.1 mg/L、和厚樸酚463.6 mg/L），制備供試品溶液并進行測定，計算加樣回收率，結(jié)果表明厚樸酚與和厚樸酚的平均回收率分別為101.2%，99.3%，RSD分別為1.35%、1.29%。

厚樸酚、和厚樸酚與其他組分的色譜圖見圖1。其中供試品的和厚樸酚出峰時間為4.32 min，峰面積為289 255.2，厚樸酚出峰時間為5.11 min，峰面積為321 883.01。

2.2 浸膏得率的測定

精密吸取達原飲濃縮液20 mL置己恒重的蒸發(fā)皿，水浴蒸干，按《中華人民共和國藥典》2015年版四部干燥失重測定法計算干膏得率。計算公式：干膏得率（%）=（W×V）/（20×Wt）×100%（W為20 mL濃縮液中干浸膏重量，V為定容體積，Wt為藥材重量）。

2.3 Box-Behnken效應(yīng)面法試驗[8-10]

2.3.1 Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計 采用Design-Expert8.0.6軟件中的Box-Behnken試驗設(shè)計方案，選取提取時間（A）、加水量（B）、提取次數(shù)（C）作為影響因素，采用總評歸一值法（overalldesirability，OD）處理多指標(biāo)數(shù)據(jù)。浸膏得率及含量指標(biāo)越大越好，采用Hassan方法，求歸一值[11]。公式：di=（yi-ymin）/（ymax-ymin），OD=（d1d2d3……dk）1/k，i=1，2，3，…，n，k為指標(biāo)數(shù)。見表1。

2.3.2 模型擬合及分析

運用Design-Expert8.0.6軟件，以總評OD值為響應(yīng)值，采用多元二次回歸方程得到因素與響應(yīng)值的方程為：OD=-2.275+1.657A+0.037 2B+1.761C-0.020 3AB-0.273AC-4.539×10-3BC-0.414A2+7.846×10-4B2-0.300 3C2，從表2中可以看出A、B、C、AC、A2、C2均具有統(tǒng)計學(xué)意義，影響提取效果為C>A>B，F(xiàn)=64.59，模型項P<0.000 1，模型高度顯著，實驗誤差小。失擬項F=1.76，P=0.293 9>0.05，表明失擬項無統(tǒng)計學(xué)意義，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8，說明模型擬合度好，回歸方程能準(zhǔn)確預(yù)測實際情況。綜上所述，模型可以有效的優(yōu)化出達原飲顆粒的最佳提取工藝，且實用性強。

2.4 效應(yīng)面分析及實驗預(yù)測

采用Design-Expert8.0.6軟件，根據(jù)回歸分析結(jié)果，固定其中的某1個因素，繪制另外2個因素對總評OD值影響的三維曲面和等高線圖（圖2）。當(dāng)?shù)雀呔€圖呈橢圓形，越接近最佳值，面的彎曲度就越大。圖中紅點為最高點，等高線呈橢圓形，3D圖陡峭，表示交互作用顯著。在C因素方向的響應(yīng)面曲線明顯比A、B因素方向較陡，說明C因素對響應(yīng)值OD的影響高于A、B因素。從圖2中可以看出，AC具有顯著性交互作用，這和方差分析的結(jié)果相一致。經(jīng)軟件計算得到達原飲顆粒的提取工藝參數(shù)最優(yōu)值為提取次數(shù)2.42次，提取時間0.96 h，加水量10倍，預(yù)測值OD=0.948。因提取次數(shù)需要取整數(shù)，經(jīng)單因素試驗，提取3次相比于提取2次效果并不很顯著，將提取次數(shù)定為2次。最終選擇為提取2次，55 min/次，加水量10倍。根據(jù)回歸分析結(jié)果，得效應(yīng)面圖。見圖2。

2.5 驗證試驗

通過軟件對上述優(yōu)選工藝進行處理分析，得到試驗預(yù)測值為OD=0.895。按優(yōu)選工藝再進行3次驗證試驗，與預(yù)測值的偏差為0.002 7%，偏差較小，表明所選工藝穩(wěn)定性好，可信度高。見表3。

3 討論

達原飲中檳榔辛散濕邪，化痰破結(jié)，使邪速潰，為君藥。檳榔主要成分為檳榔堿，但檳榔堿在高溫下易分解，易溶于水隨著水蒸氣而揮發(fā)，達原飲顆粒經(jīng)水煎煮提取，檳榔堿減少50%以上，且檳榔堿為小分子生物堿，在C18柱上不易保留，不適合作為含量測定指標(biāo)[12-13]。厚樸芳香化濁，理氣祛濕為臣藥。厚樸酚與和厚樸酚在厚樸中含量較高，性質(zhì)穩(wěn)定，國內(nèi)外研究較多，常作為含量測定指標(biāo)，故選取之[14-15]。

可以將復(fù)雜的未知函數(shù)，在小區(qū)域內(nèi)進行一次或二次多項式模型擬合，對實驗考察的各個水平進行連續(xù)分析，在一個區(qū)域內(nèi)直觀地反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，找到最優(yōu)值。而常用的正交試驗是線性模型設(shè)計，考察的只是已設(shè)定好的水平組合，得到的不一定是最優(yōu)組合。響應(yīng)面法常用的有星點設(shè)計響應(yīng)面法和Box-Behnken響應(yīng)面法，Box-Behnken響應(yīng)面法適用于3～7因素的實驗設(shè)計，實驗次數(shù)較星點設(shè)計法少，實驗結(jié)果不會超出設(shè)定水平，實驗結(jié)果更能為生產(chǎn)提供依據(jù)[16]。雖然在試驗次數(shù)上，響應(yīng)面法比正交試驗法有所增加，但在中藥提取中，涉及的考察因素之間的相互影響，一般都是非線性的，Box-Behnken響應(yīng)面法得到更理想的實驗結(jié)果，且能提供各因素的交互作用影響，為實際生產(chǎn)提供更多的有效信息。

經(jīng)典名方因歷史悠久，對某些疾病的療效確切，國家政策的扶持等原因，被大量開發(fā)研究。但目前的含量考察僅以提取率和主成分含量作為標(biāo)準(zhǔn)，不能很好體現(xiàn)中藥復(fù)方制劑的特點。近兩年提出中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑和物質(zhì)基準(zhǔn)的概念，標(biāo)準(zhǔn)湯劑是基于中藥飲片水煎液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更符合作為制劑開發(fā)的含量考察標(biāo)準(zhǔn)。物質(zhì)基準(zhǔn)目的是保證中藥材、中藥飲片、標(biāo)準(zhǔn)顆粒間的一致性。建立更完善的考察標(biāo)準(zhǔn)，將有利于經(jīng)典方開發(fā)成有臨床價值的制劑[17-18]。

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（2019-04-11收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）