縮合單寧降解方法研究進(jìn)展

李 特， 宋見喜， 張卓睿， 姜貴全*

(1.吉林省木質(zhì)材料科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北華大學(xué)，吉林 吉林 132013; 2.北華大學(xué) 林學(xué)院，吉林 吉林 132013)

單寧是一種相對(duì)分子質(zhì)量為500～3 000的天然植物多酚類化合物，按其結(jié)構(gòu)的不同可分為水解單寧和縮合單寧[1]?？s合單寧是以黃烷-3-醇為結(jié)構(gòu)單元通過C4～C6或C4～C8的C—C連接而成的寡聚物或多聚物[2-3]，廣泛存在于植物的果、皮中[4-5]。其中，高相對(duì)分子質(zhì)量縮合單寧空間位阻大、透過性差，導(dǎo)致生物活性較低、經(jīng)濟(jì)價(jià)值小，可通過降解得到相對(duì)分子質(zhì)量較小的單寧低聚體或單體，如抗氧化[6]、抗腫瘤活性較高并在醫(yī)藥、食品、日化用品等方面有廣泛應(yīng)用[7]的兒茶素和抗氧化作用較強(qiáng)的表兒茶素[8]，使其充分發(fā)揮抗菌[9-12]、清除自由基[13-15]等作用，從而大大提高其生物活性和生物利用度[16-17]。因此降解對(duì)縮合單寧高附加值利用十分重要。近年來，國(guó)內(nèi)外許多研究人員以微生物降解和化學(xué)降解為主要降解方法對(duì)縮合單寧進(jìn)行了深入研究，取得了很多成果。本文介紹了近年來縮合單寧降解領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀，從降解產(chǎn)物的平均聚合度、活性等主要參數(shù)入手，討論微生物降解、酸降解、堿降解、貴金屬催化降解、樹脂催化降解等對(duì)縮合單寧的影響，以期為縮合單寧的降解及高附加值利用提供參考。

1 縮合單寧的微生物降解

1.1 縮合單寧的真菌降解

雖然縮合單寧的結(jié)構(gòu)復(fù)雜[18]降解困難，但已有研究表明某些真菌能降解這些多酚類物質(zhì)[19-20]。在1913年Knudson[21]首次報(bào)道單寧可被黑曲霉降解。蘭平等[22]用青霉和米曲霉降解葡萄皮單寧，采用薄層色譜分離和分光光度計(jì)(香草醛法)相結(jié)合的方式進(jìn)行檢測(cè)，以葡萄皮單寧的降解產(chǎn)物之一兒茶素質(zhì)量濃度和轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，研究不同條件下的降解效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：青霉降解效果更好，在培養(yǎng)溫度為28 ℃、培養(yǎng)24 h、pH值6.5和單寧質(zhì)量濃度為12.5 g/L的條件下，兒茶素質(zhì)量濃度最高可達(dá)0.32 g/L，轉(zhuǎn)化率為52.3%。

1.2 縮合單寧的細(xì)菌降解

1987年Field等[23]發(fā)現(xiàn)縮合鞣質(zhì)可被厭氧淤泥細(xì)菌群降解。McSweeney等[24]首次發(fā)現(xiàn)了以縮合單寧為單一碳源的瘤胃細(xì)菌，這為之后縮合單寧的細(xì)菌降解提供了思路。陳度宇等[25]以牛羊糞為菌源，用梯度馴化法分離篩選到1株能以縮合單寧為唯一碳源生長(zhǎng)的腸桿菌屬的革蘭氏陰性菌，并通過正丁醇-鹽酸法和液相色譜法檢測(cè)兒茶素含量和縮合單寧降解率，72 h時(shí)對(duì)落葉松單寧的降解率可達(dá)90%以上，且有兒茶素生成。這是首次得到可有效降解縮合單寧為兒茶素的細(xì)菌，開辟了降解菌的新道路。

2 縮合單寧的化學(xué)降解

2.1 縮合單寧的酸降解

酸降解法是縮合單寧降解的主要方法之一，因操作簡(jiǎn)單、設(shè)備價(jià)格低廉、降解率高而備受關(guān)注。

2.1.1鹽酸降解

2.1.1.1降解原理 Matthews等[26]在HCl存在下以間苯三酚和芐基硫醇為親核試劑分別降解縮合單寧，研究發(fā)現(xiàn)縮合單寧末端基團(tuán)以兒茶素和表兒茶素形式釋放，延伸端形成加合物(圖1)，通過高效液相色譜(HPLC)等檢測(cè)可知芐基硫醇為親核試劑時(shí)降解率更高，為之后酸降解奠定了基礎(chǔ)。

圖1 單鏈型縮合單寧降解原理圖[26]

2.1.1.2鹽酸單獨(dú)降解 魏冠紅[27]選用HCl、1號(hào)強(qiáng)酸性樹脂和冰醋酸分別降解葡萄籽縮合單寧，經(jīng)HPLC分析HCl降解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)在單體和低聚體集中出現(xiàn)的保留區(qū)無明顯的吸收峰，說明HCl不能使高聚體降解為單體和低聚體，可能由于HCl酸性較強(qiáng)；冰醋酸降解產(chǎn)物平均聚合度由6.31降至3.82，但沒降到1～3之間，可能由于冰醋酸酸性較弱；1號(hào)強(qiáng)酸性樹脂降解產(chǎn)物平均聚合度由6.26降至2.30，達(dá)到了聚合度1～3的要求。文魁山[28]同樣用HCl降解葡萄籽縮合單寧，純HCl降解產(chǎn)物平均聚合度由5.65降至4.57(效果不顯著),原因是HCl中H+只能促使縮合單寧鏈接末端解離出非常小部分的單體，很難與碳正離子形成二聚體,在無親核試劑的情況下碳正離子中間體重新生成高聚體，導(dǎo)致低聚體很難被檢測(cè)到。因此，僅依靠HCl很難使縮合單寧得到有效降解。

2.1.1.3親核試劑表兒茶素/HCl降解 相對(duì)分子質(zhì)量大的縮合單寧在降解過程中會(huì)產(chǎn)生一種不穩(wěn)定的碳正離子中間體，若沒有親核試劑的存在則會(huì)沿著逆反應(yīng)重新生成大分子物質(zhì)，而黃烷-3-醇作為縮合單寧的單體，當(dāng)以它為親核試劑時(shí)，并不會(huì)引入新的雜質(zhì)，因此以黃烷-3-醇為結(jié)構(gòu)單元的兒茶素和表兒茶素也可作為理想的親核試劑。近幾年，親核試劑表兒茶素(EC)/HCl降解縮合單寧很受歡迎，在不引入雜質(zhì)的條件下，不僅降低了產(chǎn)物的平均聚合度，而且有一定的選擇性。Qi等[29]用EC/HCl降解高粱縮合單寧，在74 ℃、pH值1.24、反應(yīng)61min、EC與縮合單寧質(zhì)量比值0.89的最優(yōu)條件下，兒茶素、EC和低聚體總產(chǎn)率達(dá)(86.0±1.2)%。齊亞靜[30]以表兒茶素為親核試劑，在鹽酸存在下降解高粱縮合單寧，經(jīng)NP-HPLC離子源串聯(lián)質(zhì)譜(MS)法同樣檢測(cè)出產(chǎn)物中有縮合單寧單體、二聚體、三聚體等。文魁山[28]用EC/HCl降解葡萄皮縮合單寧，平均聚合度從5.65降至1.74，可定向降解為更有價(jià)值的原花青素B2。

2.1.1.4其他親核試劑降解 研究人員還對(duì)其他親核試劑進(jìn)行了探索[31]，Zhang等[32]以2-巰基乙醇為親核試劑，在HCl存在的條件下降解落葉松樹皮縮合單寧，通過紅外光譜表征得出解聚產(chǎn)物為兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素等。文魁山[28]用兒茶素/HCl降解葡萄籽縮合單寧，以降解產(chǎn)物的平均聚合度為檢測(cè)指標(biāo)并通過UPLC判斷產(chǎn)物成分，結(jié)果為：平均聚合度降低了3.97個(gè)單位(效果顯著)，可定向降解為原花青素B1。Billerach等[33]分別探討了以薄荷呋喃、間苯三酚和2-巰基乙醇為親核試劑，在HCl條件下對(duì)原花青素B2的降解效果，在40 min內(nèi)原花青素B2幾乎完全被薄荷呋喃降解(降解率>98.8%)，降解產(chǎn)物表兒茶素-薄荷呋喃的產(chǎn)率為91.6%，EC產(chǎn)率為88.1%；而其他2種親核試劑降解效果均不理想，反應(yīng)平衡時(shí)只降解了部分縮合單寧，降解產(chǎn)物表兒茶素-間苯三酚發(fā)生了逆反應(yīng)，產(chǎn)生的新低聚物影響了原有的平衡(圖2)。研究人員進(jìn)一步探討了這3種親核試劑對(duì)更復(fù)雜葡萄籽縮合單寧的降解效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MF、PG和2-巰基乙醇與含縮合單寧的葡萄籽提取物質(zhì)量比分別為1 ∶1、10 ∶1和55 ∶1時(shí)，能快速完全降解單寧。該研究證明了薄荷呋喃降解縮合單寧的潛力，MF不僅易得，而且效率高、無顯著逆轉(zhuǎn)。

圖2 縮合單寧的親核試劑降解(以薄荷呋喃獲得的產(chǎn)品為例)[33]

2.1.2亞硫酸降解 張惠[34]用甲酸、醋酸和亞硫酸分別降解蓮房縮合單寧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲酸和醋酸僅使蓮房縮合單寧平均聚合度由5.95分別降至4.24和4.63，降解效果不顯著；而以亞硫酸為降解劑，在反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間50 min的條件下，平均聚合度由5.95降至3.04。Luo等[35]用亞硫酸降解葡萄籽及皮中的縮合單寧，在溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、樣品與亞硫酸質(zhì)量比為1 ∶0.2條件下，共得到10種二聚體或三聚體原花青素，其中大多數(shù)產(chǎn)量高、純度高(90%以上)。

2.2 縮合單寧的堿降解

堿法降解成本低、操作簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是降解條件不易把控。White等[37]意外發(fā)現(xiàn)原花青素在一定濃度NaOH作用下產(chǎn)生1%的單體和5%的二聚體。紀(jì)秀鳳等[38]探索了NaOH、Na2CO3、NaHCO3、NaHSO3、Na2SO3對(duì)紅樹莓籽縮合單寧的降解效果，結(jié)果表明：Na2SO3降解效果最佳，當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.13%，反應(yīng)時(shí)間42 min，溫度60 ℃時(shí)，平均聚合度由5.44降至2.14±0.11，降解前高聚合度的縮合單寧對(duì)α-葡萄糖苷酶(α-Glu)和α-淀粉酶(α-Amy)的IC50值分別為0.730和0.578 g/L，降解產(chǎn)物對(duì)α-Glu和α-Amy的IC50值分別為0.291和0.342 g/L，降解產(chǎn)物兒茶素、表兒茶素及其聚合體對(duì)α-Amy和α-Glu活性的抑制作用更高，該發(fā)現(xiàn)為降血糖新藥物的開發(fā)提供了依據(jù)。Liu等[39]研究了不同NaOH/尿素配比的混合水溶液對(duì)馬占相思單寧的解聚效果，結(jié)果表明：縮合單寧的重均分子質(zhì)量從1 725和704 u下降到1 523 和327 u，平均聚合度從7降至2，主要原因是C4—C8斷裂以及一些C4—C6、醚鍵被破壞(圖3)。張杰等[40]探索了NaOH對(duì)霞多麗葡萄籽縮合單寧(原花青素)的影響，在NaOH濃度10 mol/L，預(yù)處理溫度60 ℃，處理時(shí)間15 min的最優(yōu)條件下，原花青素平均聚合度由5.39±0.12降至1.30±0.014。

圖3 NaOH降解機(jī)理示意圖[40]

2.3 縮合單寧的貴金屬催化氫解

氫化降解縮合單寧的方法對(duì)安全性要求較高，但操作方便簡(jiǎn)潔，對(duì)儀器設(shè)備腐蝕小。由于縮合單寧A環(huán)的C8位為親核中心，C環(huán)的C4位為親電中心，因此通過貴金屬催化和氫氣氫解將C4—C8斷裂，從而使相對(duì)分子質(zhì)量大的縮合單寧催化氫解為兒茶素、表兒茶素和相對(duì)分子質(zhì)量小的縮合單寧。在1982年Foo[41]成功以貴金屬為催化劑對(duì)光葉石楠中縮合單寧進(jìn)行降解，這為縮合單寧的降解提供了新思路。杜曉等[42]用Pd/C催化氫解落葉松樹皮縮合單寧(多聚原花青素)制備低聚原花青素，產(chǎn)物主要為兒茶素、表兒茶素和原花青定B1等，清除3種氧自由基(超氧自由基、羥基自由基、脂類自由基)的能力明顯高于降解前， IC50分別為0.048、8.06和0.19 g/L。姜貴全[43]也做了相似的實(shí)驗(yàn)并分析了降解機(jī)理，催化劑Pd/C通過破壞縮合單寧的C4—C8實(shí)現(xiàn)對(duì)縮合單寧的降解，降解產(chǎn)物平均聚合度由7.99降至2.66，降解率為67.46%。Li等[44]用Pd/C催化氫解高粱麩皮縮合單寧，低聚物產(chǎn)率最高為38.8%，剩余聚合物為16.6%。Zhu等[45]提供了一種新方法，用低成本的Ru/C催化氫解落葉松樹皮縮合單寧,結(jié)果表明：在反應(yīng)溫度150 ℃，反應(yīng)時(shí)間1 h，Ru/C負(fù)載量為1%時(shí)，降解率可達(dá)74.1%，降解物清除ABTS自由基的IC50值為0.032 g/L,優(yōu)于常用的氧化劑。

2.4 縮合單寧的生物酶解法降解

Osman等[46]研究發(fā)現(xiàn)漆酶可將原花青定B2降解為原花青定A2二聚體和其他醌類氧化產(chǎn)物，漆酶首先氧化一個(gè)酚羥基，然后從2號(hào)碳中提取電子進(jìn)行去質(zhì)子化反應(yīng)形成中間體醌甲基化物；較低的黃烷-3-醇單元的7號(hào)碳的羥基在較高單元的2號(hào)碳處的親核反應(yīng)導(dǎo)致原花青定A2的形成。2016年蘇惠娟[47]成功篩選出N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶用于降解葡萄籽縮合單寧。試驗(yàn)將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的nanA基因片段構(gòu)建在3種不同質(zhì)粒上形成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá),經(jīng)鎳柱純化得到N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶；然后用此酶降解葡萄籽高聚縮合單寧并優(yōu)化降解條件，結(jié)果表明：反應(yīng)溫度50 ℃、pH值10、反應(yīng)8 h條件下，得到35.67 mg/g單體和14.49 mg/g二聚體。這是一種全新的綠色生物降解法，降解得率高、催化效率快，極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 縮合單寧的樹脂催化降解

2018年姜貴全等[48]探討了CR57樹脂催化降解落葉松樹皮縮合單寧制備低聚原花青素，每100 mL多聚原花青素中加入18 mL樹脂，反應(yīng)溫度76 ℃、反應(yīng)1.8 h，在此條件下降解產(chǎn)物的平均聚合度為3.76，經(jīng)色譜和MS檢測(cè)可知，產(chǎn)物中含兒茶素、表兒茶素、原花青素B1等，降解機(jī)理為CR57樹脂是球狀大孔強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，類似于固體酸，其良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較優(yōu)的催化活性使縮合單寧能夠進(jìn)到球體內(nèi)部與H+反應(yīng)，H+進(jìn)攻單寧A環(huán)C8位形成碳正離子，C環(huán)的C4位為親電中心，使單寧單元C4—C8斷裂生成低聚體；降解產(chǎn)物清除DPPH·、·OH和ABTS·的IC50值分別為 72.56、12.64和2.52 mg/L，其能力略低于葡萄籽提取物，高于Vc。樹脂催化降解法操作簡(jiǎn)便、對(duì)儀器腐蝕性小、成本低、反應(yīng)條件溫和，是綠色高效的降解新方法。

4 結(jié)語與展望

通過對(duì)縮合單寧降解的研究歷程分析得出：1) 目前已有大量研究證明縮合單寧可被降解為生物活性更高的小分子單體或低聚體，這對(duì)縮合單寧的高附加值利用具有非常深遠(yuǎn)的意義。2) 微生物降解法雖環(huán)保、成本低，但很難尋找合適菌株且不確定性很高。酸降解法因操作簡(jiǎn)單、降解率高、對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于縮合單寧的解聚反應(yīng)，如以鹽酸加表兒茶素或兒茶素親核試劑作為降解劑，既不引入雜質(zhì)，又可以選擇性生成目標(biāo)產(chǎn)物；但酸降解的不易回收性會(huì)造成工業(yè)污染，不利于環(huán)保。堿降解法反應(yīng)速率快、產(chǎn)量高、成本低廉，但可能存在著單寧降解與自縮聚的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，導(dǎo)致降解量很小。3) 貴金屬催化降解法因操作簡(jiǎn)便、定向生成低聚體等優(yōu)點(diǎn)在催化、化學(xué)、能源等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但不可忽略的是降解反應(yīng)條件苛刻，且貴金屬成本高。因此制備更綠色環(huán)保、可回收、反應(yīng)條件溫和、穩(wěn)定性高的催化劑是亟待解決的問題。

目前大部分研究者集中于研究酸降解和貴金屬催化降解法，但貴金屬成本較高，可采用向少量貴金屬中摻入過渡金屬的方法降低成本(如向Pd中加入Fe或Cu)，再結(jié)合固體酸(如硫酸化氧化鋯)以便于催化劑的回收和重復(fù)利用。另外，生物酶解法因無污染、得率高等優(yōu)點(diǎn)被視為環(huán)境友好型技術(shù)，未來可通過DNA重組技術(shù)克隆單寧酶及基因進(jìn)一步研究可靶向降解、友好、環(huán)保的高活性、耐高溫的單寧酶。