豬流行性腹瀉病毒IgG抗體間接ELISA檢測方法的建立

芮聰杰 潘孝成 沈?qū)W懷

摘要 為建立檢測豬血清中豬流行性腹瀉病毒（PEDV）IgG抗體的間接ELISA方法，以PEDV重組N蛋白和純化全病毒為包被抗原，采用方陣滴定法優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了2種檢測豬血清中PEDV IgG抗體的間接ELISA方法。結(jié)果顯示，純化全病毒和重組N蛋白抗原的最佳包被濃度分別為1.00和4.92 μg/mL，檢測樣品最佳稀釋度分別為1∶100和1∶50，重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，PEDV陽性血清的最低檢測稀釋倍數(shù)分別為1∶1 600和1∶800，對豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒等陽性血清均無交叉反應(yīng)性，2種方法對臨床樣品檢測符合率為95.92%。這表明2種方法均具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性，可用于檢測和評價(jià)血清中特異性PEDV IgG抗體。

關(guān)鍵詞 豬流行性腹瀉病毒;IgG抗體;間接ELISA

中圖分類號 S852.65+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）19-0103-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.026

Abstract In order to establish indirect enzymelinked immunosorbent assy（iELISA） for detecting specific IgG antibody level against porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in pigs serum， the two indirect ELISA methods were established with the purified PEDV and recombinant N protein of PEDV as coating antigen. The results showed that the optimal coating antigen concentrations were 1.00 and 4.92 μg/mL respectively， and the optimal dilutions of sample were 1∶100 and 1∶50 respectively. The coefficients of variation of the intraand interbatch repetitive tests were all less than 10%， the minimum dilution ratio of PEDV positive sample were 1∶1 600 and 1∶800 respectively. The two indirect ELISA methods had no crossreaction with those positive sera of transmissible gastroenteritis virus，porcine pseudorabies virus，and so on. The coincidence rate of the two indirect ELISA methods was 95.92%. The results suggested that the two indirect ELISA methods were specific， sensitive， and repeatable. They could be used to detect and evaluate the IgG antibody against PEDV in pigs serum.

Key words Porcine epidemic diarrhea virus;IgG antibody;Indirect ELISA

基金項(xiàng)目 安徽省科技重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目 （1704a07020066）;安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院平臺項(xiàng)目（2020YL094）;安徽省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（AHCYTX-05-09）;安徽省科技重大專項(xiàng)（17030701008）。

作者簡介 芮聰杰（1989—），男，河南漯河人，碩士，從事畜禽傳染病研究。*通信作者，副研究員，博士，從事畜禽傳染病研究。

收稿日期 2020-03-10

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種以水樣腹瀉、脫水、嘔吐為主要特征的急性、高度接觸性腸道傳染病，各個(gè)品種和各個(gè)年齡階段的豬均易感，尤其對剛出生至10日齡以內(nèi)的哺乳仔豬影響最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為高病死率，病死率可高達(dá)100%[1-3] 。1971年首次在英國發(fā)現(xiàn)PED[4]，我國自20世紀(jì)80年代初以來陸續(xù)有關(guān)于PEDV分離和鑒定的報(bào)道[5]，2010年底開始PED在中國、美國、墨西哥、日本、加拿大、哥倫比亞、韓國、烏克蘭等國家和地區(qū)相繼暴發(fā)豬流行性腹瀉大流行疫情[6-7]，給我國及世界上眾多國家的生豬養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自2014以來，雖然豬流行性腹瀉疫情在我國一直比較平穩(wěn)，但由于疫苗免疫對豬流行性腹瀉的控制成效并不顯著，免疫豬場的發(fā)病哺乳仔豬仍呈現(xiàn)高發(fā)病率和高病死率，豬流行性腹瀉病目前在我國呈常態(tài)化，仍是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要疫病之一[8]。豬流行性腹瀉的早期診斷和豬群抗體水平的檢測，對該病的預(yù)防與控制起著關(guān)鍵性作用。ELISA 檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)快速、操作相對簡單以及可對血清進(jìn)行批量檢測等特點(diǎn)，因而在人和動(dòng)物疫病的血清學(xué)抗體檢測中應(yīng)用廣泛。筆者以PEDV重組N蛋白和純化全病毒為包被抗原，分別建立了檢測血清中PEDV IgG抗體的間接ELISA方法，旨在為有效開展PED防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PEDV純化全病毒、PEDV 重組N蛋白、PEDV陰性血清及PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）陽性血清樣品由畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存;四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購于索萊寶生物科技有限公司;山羊抗豬IgG-HRP購于Abcam公司;Tween-20購于德國Bio froxx公司;牛血清白蛋白（BSA）購于美國Sigma公司;96孔ELISA包被板購于Corning公司。

1.2 間接ELISA方法的建立及優(yōu)化

采用方陣滴定法，確定間接ELISA的PEDV N蛋白及純化全病毒2種抗原的最佳包被濃度（0.50～9.84 μg/mL），包被液[0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液（CBS，pH 9.6）]，抗原包被條件（37 ℃孵育2 h后4 ℃ 16 h、4 ℃ 16 h、37 ℃孵育2 h），封閉液的選擇[1%BSA、5%BSA、5%脫脂奶粉（SMP）]，待檢血清樣品的稀釋濃度（1∶50～1∶800），待檢血清樣品的反應(yīng)時(shí)間（15～90 min），山羊抗豬IgG-HRP稀釋濃度（1∶500～1∶10 000），山羊抗豬IgG-HRP作用時(shí)間（15～90 min），TMB顯色時(shí)間（5～20 min）。

1.3 臨界值的確定

按以PEDV N蛋白及純化全病毒為包被抗原建立的2種IgG抗體間接ELISA檢測方法操作，對44份PEDV IgG抗體陰性血清樣品進(jìn)行檢測，每份樣品做2個(gè)重復(fù)孔，計(jì)算出所檢測陰性樣品OD450 nm值的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。樣品OD450 nm值≥+3×SD為陽性;樣品OD450 nm值≤+2×SD為陰性;樣品OD450 nm值介于二者之間為可疑。

1.4 敏感性試驗(yàn)

將PEDV抗體為陽性的血清樣品倍比稀釋，按照已建立的2種IgG抗體間接ELISA檢測方法操作，測定OD450 nm值，根據(jù)陰陽性臨界值，判斷其陰陽性，確定2種方法的最低檢測稀釋度。

1.5 特異性試驗(yàn)

按已建立的2種IgG抗體間接ELISA檢測方法操作，對畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備的TGEV、PRV、CSFV、FMDV、PRRSV陽性血清樣品進(jìn)行檢測，設(shè)立PEDV陽性和陰性血清對照，測定OD450 nm值，根據(jù)陰陽性臨界值，判斷其陰陽性，評估2種方法的特異性。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

選取4份陽性血清樣品及1份陰性血清樣品，每份樣品做4個(gè)重復(fù)，按照已建立的2種IgG抗體間接ELISA檢測方法操作，使用同一批次PEDV N蛋白和濃縮純化的全病毒抗原，包被同一批次的酶標(biāo)板，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，另外包被不同批次的酶標(biāo)板，進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)。

1.7 臨床樣品檢測

按照已建立的2種IgG抗體間接ELISA檢測方法操作，對采自安徽地區(qū)的6家開展PEDV免疫豬場的共245份豬血清樣品進(jìn)行檢測，測定OD450 nm值，根據(jù)陰陽性臨界值，判斷其陰陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接ELISA方法的建立及反應(yīng)條件確定

經(jīng)測定該試驗(yàn)保存的濃縮純化PEDV全病毒和重組N蛋白濃度分別為3.95和1.23 mg/mL，以其為包被抗原，分別建立檢測PEDV IgG抗體的間接ELISA檢測方法。采用方陣滴定法，確定了最佳反應(yīng)條件（表1）。

2.2 陰陽性臨界值的確定

用該試驗(yàn)建立的2種間接ELISA方法分別檢測44份陰性血清樣品，結(jié)果顯示以PEDV全病毒作為包被抗原，當(dāng)樣品OD450 nm≥0.440時(shí)判定為陽性，當(dāng)樣品OD450 nm≤0.365時(shí)判定為陰性，當(dāng)樣品OD450 nm介于二者之間時(shí)判為可疑;以重組N蛋白為包被抗原，當(dāng)樣品OD450 nm≥0.434時(shí)判定為陽性，當(dāng)OD450 nm≤0.355時(shí)判定為陰性，當(dāng)樣品OD450 nm介于二者之間時(shí)判為可疑。

2.3 特異性試驗(yàn)

用該試驗(yàn)建立的2種間接ELISA方法在相同的反應(yīng)條件下，分別對TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV陽性血清樣品進(jìn)行檢測，并設(shè)置PEDV陰陽性血清樣品作為對照，結(jié)果顯示，除陽性血清樣品外，其余樣品結(jié)果均呈陰性（表2），表明該試驗(yàn)建立的2種間接ELISA方法均具有較好的特異性。

2.4 敏感性試驗(yàn)

對該試驗(yàn)建立的2種間接ELISA方法進(jìn)行敏感性檢測，結(jié)果顯示（圖1），以PEDV全病毒作為包被抗原，當(dāng)陽性血清樣品稀釋到1∶1 600時(shí)仍可檢測為陽性（OD450 nm=0.497）;以PEDV重組N蛋白為包被抗原，當(dāng)陽性血清樣品稀釋到1∶800時(shí)仍可檢測為陽性（OD450 nm=0.478）。這說明建立的2種間接ELISA方法均具有良好的敏感性。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

由表3可知，2種間接ELISA方法的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均為2.50%～8.23%，變異系數(shù)均小于10%，表明該試驗(yàn)建立的2種間接ELISA方法均具有良好的可重復(fù)性。

2.6 臨床樣品的檢測

用該試驗(yàn)建立的2種間接ELISA方法，分別檢測245份來自5家豬場的血清樣品，結(jié)果顯示以PEDV全病毒作為包被抗原，檢測樣本的陽性率為81.22%（199/245）;以重組N蛋白為包被抗原，檢測樣本的陽性率為79.59%（195/245）。這2種方法的檢測符合率為95.92%（235/245）。

3 討論

核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白是PEDV4種主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，研究表明其在病毒的復(fù)制以及誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)上發(fā)揮重要的作用，在感染早期能夠誘導(dǎo)集體產(chǎn)生針對N蛋白的高水平抗體，因而利用N 蛋白建立PEDV 診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景[9-12]，試驗(yàn)所用PEDV重組N蛋白為畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，且已證實(shí)其與PEDV陽性血清有良好的反應(yīng)特異性[13]。病毒上誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體的表位為B淋巴細(xì)胞表位，是構(gòu)象表位，PEDV 的重組表達(dá)蛋白，不論是原核或真核表達(dá)的蛋白，雖然氨基酸序列相同，但由于其空間構(gòu)象可能不同，重組表達(dá)蛋白上所包含的B淋巴細(xì)胞表位，其所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，可能與病毒感染所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體存在不同或不完全相同。PEDV的全病毒，由于病毒蛋白為天然構(gòu)象，因而保留其全部的抗原表位，也使得以其為包被抗原建立的抗體檢測ELISA方法，臨床上檢測特異性更強(qiáng)，陽性檢出率更高[14]。

該試驗(yàn)以純化的PEDV全病毒和重組N蛋白抗原作為包被抗原，分別建立了檢測豬血清中IgG抗體的間接ELISA方法，其陽性樣品檢測的最低稀釋度分別為1∶1 600和1∶800，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%（2.50%～8.23%），與TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV陽性樣品無交叉反應(yīng)，說明該試驗(yàn)建立的2種檢測PEDV IgG抗體的間接ELISA方法均具有良好的敏感性、重復(fù)性和特異性，均可用于檢測和評估血清中PEDV感染和免疫產(chǎn)生的IgG抗體水平。雖然以PEDV全病毒為包被抗原的陽性檢出率（81.22%）略高于重組N蛋白（79.59%），但差異不顯著，且2種方法對臨床樣品的檢測符合率較高（95.92%），因此可根據(jù)實(shí)際情況選擇應(yīng)用。

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