反式白藜蘆醇對(duì)血管性癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

吳競(jìng)婧 徐平

(遵義醫(yī)科大學(xué) 1第三附屬醫(yī)院 遵義市第一人民醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

血管性癡呆發(fā)病率高、病因復(fù)雜，主要因缺血性腦卒中及全腦性缺氧缺血導(dǎo)致發(fā)病，多數(shù)患者伴明顯的偏癱、感覺不適等癥狀，嚴(yán)重影響患者的日常生活〔1〕。目前，血管性癡呆的防治仍無特效藥物，臨床上多為患者使用鈣離子拮抗劑、膽堿酯酶抑制劑等治療，但獲得的治療效果均達(dá)不到預(yù)期〔2〕。隨著現(xiàn)代臨床對(duì)中醫(yī)藥治療的重視，結(jié)合中藥獨(dú)有的特性，有醫(yī)家指出，可以為血管性癡呆使用中藥治療，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多方式、副作用少等特點(diǎn)〔3〕。白藜蘆醇藥理作用廣泛，包括抗炎、神經(jīng)保護(hù)、自由基清除、抗氧化、機(jī)體損傷保護(hù)、影響骨代謝等〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以改善血管性癡呆大鼠空間認(rèn)知功能損害，通過改善大鼠突觸可塑性來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔5〕。反式白藜蘆醇是白藜蘆醇的一種結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)，這種反式白藜蘆醇對(duì)β-淀粉樣肽(Aβ)致癡呆大鼠海馬旁回有保護(hù)作用〔6〕。推測(cè)將其用于血管性癡呆的治療也可獲得一定神經(jīng)元保護(hù)作用，但目前國(guó)內(nèi)無相關(guān)研究可作為依據(jù)支持。本研究探討反式白藜蘆醇對(duì)血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性健康SD大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK(京)2018-0010，周齡均為10 w，體重220～260〔平均(240±20)〕g，購(gòu)回后放于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。全部動(dòng)物的采集與處理符合相關(guān)文件與文獻(xiàn)中的規(guī)定〔7,8〕。

1.2主要用藥與試劑 反式白藜蘆醇，由陜西慈元生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供，純度為98%，批號(hào)為20180911；苦味酸，由廣州華拓生物有效公司生產(chǎn)提供；熒光夜、RNAiso試劑液購(gòu)自大連寶生物公司；DNA聚合酶優(yōu)化引物、Caspase-3均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Aβ25～35由美國(guó)Sigma公司提供。

1.3主要儀器 腦立體定位儀，由深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀由美國(guó)BIO-RAD公司提供，逆轉(zhuǎn)錄儀由德國(guó)EPPENDORF公司提供。

1.4方法

1.4.1血管性癡呆大鼠模型建立 方法〔9〕采用反復(fù)夾閉頸雙側(cè)總動(dòng)脈合并腹腔內(nèi)注射硝普鈉的方式來制作模型。術(shù)前禁食12 h，腹腔注射適量的水合氯醛，頸部消毒，做切口將頸動(dòng)脈分離，硝普鈉腹腔注射。無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流，10 min后再灌注10 min，重復(fù)3次，在傷口上撒適量的青霉素粉末，傷口逐層縫合后回籠保溫飼養(yǎng)。造模后1 d經(jīng)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)建模情況〔10〕。

1.4.2分組方法 隨機(jī)將全部購(gòu)入的54只大鼠中10只作為空白對(duì)照組，不進(jìn)行建模；其他44只大鼠均建立血管性癡呆大鼠模型，最終建模成功40只。隨機(jī)將建模成功的大鼠分為4組，各組10只，分別為模型組、低劑量反式白藜蘆醇組(低劑量組)、中劑量反式白藜蘆醇組(中劑量組)、高劑量反式白藜蘆醇組(高劑量組)。

1.4.3給藥方法 用0.9%氯化鈉將反式白藜蘆醇溶解為1%的反式白藜蘆醇溶液，建模成功后，開始為大鼠灌胃給藥，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的灌胃給藥劑量分別為：10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)；空白對(duì)照組與模型組給予等體積的氯化鈉注射液，共灌胃給藥10 d。

1.4.4相關(guān)指標(biāo)檢查 (1)取材：在制模后第11天取材：使用10%水合氯醛將大鼠麻醉之后，斷頭、取腦，將大鼠的顱骨打開，迅速將海馬組織取出，并放入滴加RNA萃取的1 ml EP試管內(nèi)，在-80℃的環(huán)境下速凍保存待檢。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)。(2)相關(guān)指標(biāo)檢查：①蘇木素-伊紅染色觀察大鼠海馬病理改變：取大鼠腦組織，經(jīng)石蠟包埋、切片后行蘇木素-伊紅染色，在光鏡下觀察各組大鼠海馬的病理改變。②使用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定大鼠海馬區(qū)的DNA聚合酶γ及Caspase-3表達(dá)。根據(jù)試劑盒說明書詳細(xì)操作提取并純化DNA，測(cè)定DNA含量，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增。使用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)目的基因相對(duì)表達(dá)量。③NMDAR1：a.Western印跡法測(cè)定海馬神經(jīng)元膜蛋白NMDAR1表達(dá)：成功分離各組海馬神經(jīng)元總膜蛋白，加入膜蛋白溶解液溶解，混合上樣緩沖液與等量蛋白樣品，浴鍋加熱10 min，電泳分離后封閉，與NMDAR1抗體、β-actin抗體在4℃條件下反應(yīng)過夜，洗膜后與羊抗兔IgG室溫下反應(yīng)，使用軟件分析，得到NMDAR1與β-actin比值，即NMDAR1/β-actin；b.免疫組化測(cè)定海馬NMDAR1蛋白表達(dá)：石蠟切片脫臘復(fù)水，修復(fù)后冷卻并沖洗，緩沖液浸泡3次，室溫下孵育，封閉并滴加NMDAR1一抗，孵育過夜沖洗后顯色，滴加二抗，孵育后顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察，陽性表達(dá)即棕褐色。使用圖像分析軟件作半定量分析，隨機(jī)選取每張切片5個(gè)海馬區(qū)不重復(fù)視野，分別取值并得到平均值，以平均吸光度(IA)積分表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。c.實(shí)時(shí)定量 PCR測(cè)定海馬組織NMDAR1 mRNA表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組海馬組織病理形態(tài) 空白對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)均無變化，均正常；模型組大鼠的海馬區(qū)細(xì)胞層次清晰度不佳且數(shù)量明顯變少，胞體縮小明顯，細(xì)胞排列較散亂，有神經(jīng)元丟失及核固縮的情況發(fā)生；反式白藜蘆醇使用后，大鼠海馬區(qū)細(xì)胞層次減少、細(xì)胞形態(tài)、排列稀松等情況有改善，見圖1。

空白對(duì)照組

2.2各組海馬組織Caspase-3、DNA聚合酶γ mRNA表達(dá)比較 空白對(duì)照組Caspase-3、DNA聚合酶γ mRNA表達(dá)最低，后由低至高依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組，模型組最高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組海馬神經(jīng)元NMDAR1蛋白及mRNA表達(dá)比較 空白對(duì)照組NMDAR1蛋白及mRNA表達(dá)最低，后由低至高依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組，模型組最高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 各組Caspase-3、DNA聚合酶γmRNA、海馬神經(jīng)元NMDAR1蛋白及mRNA表達(dá)比較

空白對(duì)照組

3 討 論

血管性癡呆是主要癡呆類型，是目前唯一證實(shí)能夠預(yù)防的癡呆類型，早期為患者制定合理干預(yù)治療計(jì)劃，對(duì)逆轉(zhuǎn)患者病情有重要意義〔11〕。對(duì)于血管性癡呆的治療，西醫(yī)注重腦卒中的預(yù)防，并給予患者神經(jīng)元保護(hù)、腦循環(huán)改善、腦代謝改善等諸多方面的治療，以膽堿酯酶抑制劑、鈣離子拮抗劑等為代表〔12〕。這些藥物雖然可以改善患者認(rèn)知功能，但卻無法有效抑制患者神經(jīng)細(xì)胞的遲發(fā)性壞死與繼發(fā)性凋亡〔13〕。故血管性癡呆的防治仍是臨床治療的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。反式白藜蘆醇是天然多酚類植物保衛(wèi)素，有著抗老年癡呆、抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌等諸多生物活性，是理想先導(dǎo)化合物，與反式白藜蘆醇類似物相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了其具有的理想的生物活性〔14〕。反式白藜蘆醇是白藜蘆醇的主要結(jié)構(gòu)之一，較白藜蘆醇的另一結(jié)構(gòu)——順式白藜蘆醇具有更強(qiáng)的生活性，尤其是在氧化、抗自由基作用方面已被證實(shí)并受到認(rèn)可〔15〕。在2015年，王剛等〔16〕建立了阿爾茨海默病小鼠模型，給予模型反式白藜蘆醇治療，結(jié)果顯示，反式白藜蘆醇對(duì)阿爾茨海默病小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶改善效果理想，且這種記憶改善效果隨著反式白藜蘆醇使用劑量的增加而增加。上述結(jié)果間接反映了反式白藜蘆醇治療血管性癡呆的可能性。Caspase-3是Csapases級(jí)聯(lián)反應(yīng)下關(guān)鍵的凋亡程度之一，起到最終樞紐的作用；而DNA聚合酶γ則是已知的DNA聚合酶中唯一在線粒體有表達(dá)并參與復(fù)制、修復(fù)線粒體DNA的酶，二者表達(dá)的變化與神經(jīng)元損傷情況有關(guān)〔17〕；NMDAR是離子型谷氨酸受體，一方面參加了中樞神經(jīng)的學(xué)習(xí)與記憶功能，另一方面參與了腦局部缺氧缺血時(shí)谷氨酸的興奮性毒性反應(yīng)，在腦局部缺血性損傷過程中，其在細(xì)胞間隙谷氨酸中過表達(dá)為主要表現(xiàn)，激活的NMDAR會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外離子平衡被破壞，從而誘發(fā)神經(jīng)毒性效應(yīng)，進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞損傷程度及死亡〔18〕。可見NMDAR的高表達(dá)可能提示神經(jīng)元的損傷或老化。本研究結(jié)果提示反式白藜蘆醇對(duì)血管性癡呆患者海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用可能通過抑制或下調(diào)Caspase-3、DNA聚合酶γmRNA與NMDAR1表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。因目前尚無較多研究可以為本研究提供依據(jù)，也無較多可作比較的文獻(xiàn)，因此本研究結(jié)果的真實(shí)性與可靠性可能有偏差，還需要在未來多進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。

綜上所述，反式白藜蘆醇可能通過下調(diào)血管性癡呆大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元NMDAR1、Caspase-3及DNA聚合酶γ表達(dá)，來發(fā)揮海馬神經(jīng)元保護(hù)之效。