腎茶黃酮預(yù)防急性腎缺血模型大鼠再灌注損傷作用及其機(jī)制

郭銀雪 葛平玉 詹繼紅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1腎內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550001；2泌尿外科)

急性腎損傷是多種因素引發(fā)的腎功能急劇快速下降綜合征，而腎臟缺血?jiǎng)t是急性腎損傷發(fā)生的重要原因之一〔1,2〕。對(duì)急性腎缺血再灌注損傷進(jìn)行防治可能有助于減少急性腎缺血再灌注引發(fā)的急性腎衰竭及其相關(guān)不良預(yù)后。腎茶已被證實(shí)在急慢性腎炎、泌尿系統(tǒng)結(jié)石疾病、感染疾病等泌尿系統(tǒng)疾病治療中可取得良好效果〔3,4〕。因此，推測(cè)腎茶提取物腎茶黃酮應(yīng)用于急性腎缺血再灌注損傷可能有效。因此，本研究采用腎茶提取物腎茶黃酮進(jìn)行急性腎缺血大鼠模型再灌注損傷的治療，觀察了其對(duì)腎功能、氧化應(yīng)激等的影響及其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 以48只SPF級(jí)SD大鼠為研究對(duì)象，均購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，購(gòu)買(mǎi)后均單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)條件為溫度維持在22～25℃，相對(duì)濕度維持在50%～60%，正常進(jìn)行光照，期間注意保持空氣流通，大鼠均自由飲水和攝食。飼養(yǎng)的籠子進(jìn)行編號(hào)并在籠子上標(biāo)注說(shuō)明，根據(jù)隨機(jī)數(shù)表，將飼養(yǎng)的大鼠分為研究組(n=24)和對(duì)照組(n=24)。研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)。兩組基線資料比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，有可比性，見(jiàn)表1。

表1 兩組基線資料比較

1.2儀器和試劑 標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，艾本德5424離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)艾本德公司，恒溫箱購(gòu)于南京泰斯特試驗(yàn)設(shè)備有限公司，超低溫冰箱購(gòu)于青島海爾特種電器有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，德國(guó)歐寶xl-600 全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于北京瑞博泰克生物科技有限公司，Bax單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體購(gòu)于艾美捷科技有限公司，Bax 二抗、Bcl-2二抗均購(gòu)于美國(guó)CST中國(guó)分公司，顯微鏡購(gòu)于上海光學(xué)儀器廠，微量移液器購(gòu)于德國(guó)艾本德公司，血肌酐檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，人腎損傷分子(KIM)-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海研卉生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1腎缺血再灌注模型建立 兩組適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后均制造為腎缺血再灌注模型，具體操作如下：術(shù)前1 d大鼠均禁食1個(gè)晚上，對(duì)手術(shù)操作臺(tái)及器械進(jìn)行嚴(yán)格消毒，采用50 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，確認(rèn)麻醉適宜后綁起大鼠四肢并固定于操作臺(tái)。于大鼠腹部正中處行一長(zhǎng)約3 cm的縱向切口，顯露右腎及腎蒂，常規(guī)行右腎切除，并無(wú)損傷左腎動(dòng)脈夾閉1 h后松開(kāi)血管。確認(rèn)腎臟灌注良好后縫合關(guān)閉切口。

1.3.2干預(yù)方法 研究組在再灌注24 h開(kāi)始腹腔注射0.1 g/ml腎茶黃酮配比液2 ml，每12 h 1次，2次/d。對(duì)照組同期腹腔注射等量0.9%生理鹽水。腎茶黃酮配比液的制作方法如下：取腎茶藥材以粉碎機(jī)粉碎后過(guò)10目篩備用，取5 g粉末，以乙醇為提取溶劑進(jìn)行回流提取，提取結(jié)束后將提取液蒸干并稱(chēng)重，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)得總黃酮含量〔5〕，并以0.9%生理鹽水配置成0.1 g/ml腎茶黃酮配比液。

1.3.3指標(biāo)檢測(cè) 再灌注24 h、48 h、72 h、96 h分別隨機(jī)處死大鼠6只。取各組大鼠腎組織常規(guī)制成石蠟切片，檢測(cè)時(shí)將石蠟切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟水化處理，一抗為兔抗大鼠Bax或Bcl-2多克隆抗體(1∶50稀釋)，二抗為生物素化羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(1∶100稀釋)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，隨意取5個(gè)高倍視野進(jìn)行染色觀察，以超過(guò)20%細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色為陽(yáng)性,Bax和Bcl-2均染色定位于胞質(zhì)。心臟采血4 ml常規(guī)進(jìn)行離心和取血清冷藏待測(cè)處理，血清丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸比色分析法，SOD活力測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，血清肌酐(SCr)、KIM-1等腎功能指標(biāo)水平等各血清指標(biāo)的檢測(cè)均采用全自動(dòng)生化分析儀，具體檢測(cè)操作嚴(yán)格按照儀器及試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組腎功能變化比較 兩組灌注24 h組腎功能比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，研究組灌注48 h、72 h、96 h的血清SCr、KIM-1等腎功能指標(biāo)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2兩組腎組織Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率變化比較 兩組灌注24 h組腎組織Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，研究組灌注48 h、72 h、96 h的腎組織Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高，而同期腎組織Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3兩組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平變化比較 兩組灌注24 h組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，研究組灌注48 h、72 h、96 h的血清SOD活力水平顯著升高而同期血清MDA水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)腎功能、腎組織Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

2.4研究組血清SCr、KIM-1水平與Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的關(guān)系 研究組血清SCr、KIM-1水平與Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792，-0.831，P<0.05)，與Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率則呈正相關(guān)(r=0.805，0.879，P<0.05)。

2.5研究組血清SCr、KIM-1水平與血清SOD活力、MDA的關(guān)系 研究組血清SCr、KIM-1水平與血清SOD活力水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.811，-0.842，均P<0.05)，與血清MDA水平則呈正相關(guān)(r=0.863，0.795，均P<0.05)。

3 討 論

腎臟是高灌注器官，其血流量達(dá)到心臟的1/4，對(duì)缺血和缺血再灌注損傷十分敏感〔6,7〕。腎缺血再灌注損傷是急性腎損傷的常見(jiàn)病因，急性腎缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腎臟血流量的明顯減少、腎小球?yàn)V過(guò)功能降低、腎小管功能堵塞等，這些因素均可導(dǎo)致腎臟缺血缺氧及其相關(guān)病理改變的發(fā)生〔8～10〕。本研究結(jié)果顯示，急性腎缺血再灌注損傷發(fā)生后腎功能損傷明顯，若無(wú)及時(shí)有效干預(yù)可能進(jìn)一步引發(fā)腎衰竭而危及生命安全。因此，對(duì)急性腎缺血再灌注損傷進(jìn)行及時(shí)有效的防治十分重要。

研究表明腎茶在急慢性腎臟疾病中均可取得較好的效果，可提高免疫力，改善腎功能等，且其低毒安全，臨床推廣具有良好基礎(chǔ)〔11,12〕。本研究證實(shí)了腎茶在腎臟疾病中的應(yīng)用效果，這與張少貴等〔13〕的研究結(jié)果一致。Bax、Bcl-2均與腎組織細(xì)胞凋亡損傷密切相關(guān)〔14〕。因此，腎茶黃酮可能通過(guò)抑制急性腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織細(xì)胞凋亡而達(dá)到改善其腎功能的目的。SOD活力和MDA均為反映氧化應(yīng)激狀態(tài)指標(biāo)〔15,16〕。因此，腎茶黃酮可能通過(guò)降低急性腎缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)而達(dá)到其保護(hù)腎功能的目的。然而基于本研究樣本量偏小、觀察時(shí)間較短等，腎茶黃酮對(duì)急性腎缺血再灌注損傷大鼠腎功能的影響及其可能機(jī)制尚需進(jìn)一步大樣本量的研究證實(shí)。

本研究提示腎功能狀況可能與腎組織細(xì)胞凋亡損傷及氧化應(yīng)激損傷狀況密切相關(guān)，急性腎缺血再灌注損傷腎功能受腎組織細(xì)胞凋亡損傷及氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，從而進(jìn)一步證實(shí)了抑制腎組織細(xì)胞凋亡損傷及改善氧化應(yīng)激狀態(tài)干預(yù)可改善性腎缺血再灌注損傷腎功能的可能性。

綜上所述，腎茶黃酮預(yù)防急性腎缺血模型大鼠再灌注損傷效果良好，其機(jī)制是可能通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2表達(dá)及降低氧化應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到預(yù)防急性腎缺血再灌注損傷作用，腎茶黃酮可能作為急性腎損傷防治藥物。