大戟大棗湯含藥血清通過PI3k／Akt 通路對乳腺癌細胞凋亡的影響

馬立威 陳 哲 李 京 由 丹 薛竹宏張洪濤葛鵬玲?劉吉成?

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學， 黑龍江 哈爾濱150040； 2.齊齊哈爾醫(yī)學院， 黑龍江 齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院， 黑龍江 齊齊哈爾161099； 4.齊齊哈爾市第一醫(yī)院， 黑龍江 齊齊哈爾161005）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增高，已嚴重危害廣大女性的健康［1］。2018 年最新數(shù)據(jù)顯示，全球癌癥發(fā)病率中乳腺癌發(fā)病率以11.6%位居第2 位，同時以6.6% 的死亡率位居癌癥死亡率第5 位［2］。臨床上以手術治療、化療、放療為主，但放化療常伴有損傷正常細胞的不良反應，治療效果并不理想［3?4］，故尋找安全有效的治療藥物一直是相關研究熱點。近年來，中西醫(yī)結合治療乳腺癌成為我國腫瘤研究的前沿和熱點，探尋有抗乳腺癌活性的中草藥可為相關研究提供物質基礎［5］。由于中藥較低的毒副作用，從中篩選抗腫瘤活性成分已逐漸成為人們關注的熱點領域［6?8］，目前植物來源的抗腫瘤藥物已超過30%，其中長春新堿、喜樹堿、紫杉醇等已成為多種腫瘤化療的一線藥物［9］。目前中醫(yī)藥在乳腺癌治療中的作用受到廣泛關注，復方中藥也己經成為相關綜合治療中的一個重要組成部分［10］。傳統(tǒng)中藥狼毒大戟屬大戟科植物，其根長期以來被用于治療各種疾病，包括水腫、腹水、肝癌、肺癌等疾病［11?12］，大戟科植物均性苦寒，善滌臟腑之水邪，為峻下逐水藥，有較大的毒性，故臨床上組方時常配伍大棗以緩和其峻烈的藥性，降低其毒副作用，但減毒作用的機制目前尚不清楚。中藥配伍在中醫(yī)臨床用藥中也是最常見的形式，具有增療效、降毒性、調控作用方向等優(yōu)點。由甘遂、大戟、芫花、大棗組成的仲景名方《十棗湯》 中就應用了大棗的味甘、性濕、補脾和胃、益氣生津、滋心潤肺、養(yǎng)血安神、悅顏色、通九竅、助十二經而和百藥的功效來緩和甘遂、大戟、芫花的峻烈之性及諸藥毒性的作用，減少脾胃對毒性藥物的反應，使其攻下而不傷正，同時民間也有用狼毒蒸棗后食棗來治療相關腫瘤。前期對狼毒大戟的抗腫瘤活性的研究多以從中提取的單體化合物為研究對象，而將其作為復方制劑來研究抗腫瘤活性尚未見報道，故本實驗以大戟大棗湯含藥血清作為實驗藥物，探討其抗乳腺腫瘤效果，并初步闡明其作用機制。

1 材料

1.1 細胞株及動物 乳腺癌MCF?7 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，于液氮中保存。SPF 級SD 大鼠，體質量（300±50）g，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物醫(yī)學部，生產許可證號SCXK（黑）2013?001，飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學院實驗動物中心，使用許可證號SYXK（黑）2016?001，適應性喂養(yǎng)3 d 后進行實驗。實驗、飼養(yǎng)及其他處理過程中產生的廢棄物及處死的大鼠均統(tǒng)一裝入指定袋中，按規(guī)定進行處理。實驗動物處置符合醫(yī)學倫理學標準。

1.2 藥物 狼毒大戟Euphorbia fischerianaSteud.全株采于黑龍江省泰康縣，取其入藥部位（根）；大棗Ziziphus jujubaMill.購自藥材批發(fā)市場（狗頭棗，產地陜西綠音，批號20160509?1），經齊齊哈爾醫(yī)學院天然藥物化學實驗中心郭麗娜教授鑒定為正品。

1.3 試劑 MEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號1708108）；胎牛血清（美國Hyclone 公司，批號NIJ1221）；雙 抗（美 國 Hyclone 公 司，批 號1170005）；BCA 蛋白定量試劑盒（中國北京康為試劑公司，批 號00071407）；抗 體（PI3k、p?FoxO3a253、anti?MouseIgG H＃＃L、anti?Rabbit IgG ＃＃H）（英國Abcam 公司，批號分別為GR277867?5、GR324092?2、247029?14、GR267728?13）；p?Akt473（美國CST 公司，批號16）；LY2940042（美國CST公司，批號15），固定液、通透液（碧云天生物技術有限公司，編號分別為P0098、P0096）；紫杉醇（中國北京雙鷺藥業(yè)公司，批號20170301）；DAPI（美國Thermo 公司，批號1890343）；ActinGeen488（美國Gene Copoeia 公司，批號1501136T）。

1.4 儀器 R?300 型旋轉蒸發(fā)（瑞士Buchi 公司）；safire2 型酶標儀（奧地利Tecan 公司）；IX51型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Observer A1型熒光顯微鏡、LSM710 型激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss 公司）；Image Xpress Micro 型高內涵細胞成像系統(tǒng)（美國MD 公司）；ChemiDoc MP 型全自動熒光及化學發(fā)光系統(tǒng)（美國Bio?Rad 公司）。

2 方法

2.1 大戟大棗湯的制備 狼毒大戟與大棗按質量比1 ∶1 混合（狼毒大戟1 kg、大棗1 kg、水10 L），浸泡30 min 后煎煮2 h，待水煎液冷卻后重復上述步驟1 次，將水煎液過濾后取濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮至2 L，即得（1 g 生藥／mL）。

2.2 含藥血清的制備 將SD 大鼠隨機分成陰性組（灌胃給予等量生理鹽水）及大戟大棗湯高、中、低劑量組（10.0、5.0、2.5 g／kg），每組5只，每日早、晚各灌胃給藥1 次，連續(xù)3 d。末次給藥1 h后，水合氯醛麻醉大鼠，無菌條件下腹主動脈采血，分離血清，貯存于-80 ℃冰箱中，使用前56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm 濾器除菌后使用。

2.3 細胞分組 MCF?7 細胞復蘇后，用MEM 的完全培養(yǎng)基（含10% FBS，1%青／鏈霉素混合液）常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次，剩余細胞于液氮中凍存?zhèn)溆??？瞻讓φ战M，10%FBS＋90%MEM 培養(yǎng)基；陰性對照組，10% 陰性組血清＋90% MEM 培養(yǎng)基；大戟大棗湯低劑量組，10%大戟大棗湯低劑量組含藥血清＋90%MEM 培養(yǎng)基；大戟大棗湯中劑量組，10%大戟大棗湯中劑量組含藥血清＋90%MEM 培養(yǎng)基；大戟大棗湯高劑量組，10%大戟大棗湯高劑量組含藥血清＋90%MEM 培養(yǎng)基；陽性對照組，10%陰性組血清＋90%MEM 培養(yǎng)基＋8 μg／mL 紫杉醇；陰性對照＋LY294002 組，40 μmol／L LY294002＋10%陰性組血清＋90%MEM 培養(yǎng)基；大戟大棗湯低劑量＋LY294002 組，40 μmol／L LY294002＋10%大戟大棗湯低劑量組含藥血清＋90%MEM 培養(yǎng)基；大戟大棗湯中劑量＋LY294002 組，40 μmol／L LY294002＋10%大戟大棗湯中劑量組含藥血清＋90%MEM 培養(yǎng)基；大戟大棗湯高劑量組＋LY294002 組，40 μmol／L LY294002＋10% 大戟大棗湯高劑量組含藥血清＋90%MEM 培養(yǎng)基。

2.4 Hoechst333342／PI 染色檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，調整細胞濃度為2×104／mL，按100 μL／孔接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁穩(wěn)定后按“2.3” 項下分組，每組平行設置6 個孔，待含藥血清作用48 h 后終止（含LY294002 的各組需在實驗結束前1 h加入）。將預先配好的Ho?chest33342 染色液加到各待測孔中，每孔10 μL，37 ℃避光孵育10 min，加入預先用Buffer 液配制好的PI 染色液，每孔5 μL，室溫避光孵育10 min。上機檢測時按所用孔板型號對應錄入儀器，選擇激發(fā)波長、拍攝通道、拍攝物鏡倍數(shù)（10×）、拍攝區(qū)域，調整聚焦后，進行拍攝，并利用高內涵細胞成像系統(tǒng)分析軟件對細胞熒光強度進行分析。

2.5 吖啶橙?溴乙錠染色觀察細胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的細胞，調整細胞濃度為1.0×105／mL，均勻鋪到6 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁穩(wěn)定后，分組、加藥。實驗分為空白對照組，陰性對照組，大戟大棗湯低、中、高劑量組，陽性對照組，加入含藥血清，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h 后終止作用。將吖啶橙、溴乙錠按照1 ∶1 的比例混合后，用試劑盒自帶Buffer 稀釋10 倍，渦旋混勻，加到6孔板中，每孔200 μL，室溫避光孵育5 min 后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 免疫熒光法檢測蛋白的表達 完全培養(yǎng)基調整生長狀態(tài)良好的細胞濃度為1.0×105／mL，每孔200 μL，均勻加入共聚焦顯微鏡專用的48 孔細胞培養(yǎng)板（黑壁底透），放入細胞培養(yǎng)箱待細胞貼壁穩(wěn)定后進行實驗。分為陰性對照組，大戟大棗湯低、中、高劑量組，陽性對照組，含藥血清作用48 h 后終止作用。將48 孔板經固定液固定、通透液通透后，用1% BSA 的PBS 在37 ℃下封閉30 min，加入一 抗（p?FoxO3a、p?Akt、PI3k），4 ℃冰箱中孵育過夜，二抗對應加入細胞板各孔內，室溫避光孵育60 min，并按照試劑說明書（DAPI、ActinGeen488）對細胞核及細胞骨架進行染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄接受不同處理的MCF?7 細胞的形態(tài)變化及熒光強度并拍照，拍照時將激光強度調成一致。

2.7 Western blot 檢測蛋白表達 取生長狀態(tài)良好的MCF?7 細胞，調整細胞濃度為2.0×105／mL，每個培養(yǎng)皿（100 mm）加8.0 mL 完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁穩(wěn)定后進行實驗。分為陰性對照組、陰性對照組＋LY294002、大戟大棗湯中劑量組、大戟大棗湯中劑量組＋LY294002，加入含藥血清的培養(yǎng)基作用48 h后終止（含LY294002 的各組在細胞培養(yǎng)結束前1 h 加入），每個培養(yǎng)皿里加1.0 mL 含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，提取細胞總蛋白后按照BCA 試劑盒說明書操作，計算各樣品的蛋白濃度。蛋白經100 ℃水浴變性后，在聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行分離，然后經過轉膜、封閉、一抗（GAPDH、p?FoxO3a、p?Akt）反應、二抗反應后進行曝光、獲取圖片。

2.8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，根據(jù)方差齊性檢驗結果，組間比較應用Dunnet?t法，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大戟大棗湯含藥血清聯(lián)合LY294002 對MCF?7 細胞凋亡的影響 空白對照組、陰性對照組中細胞幾乎沒有凋亡，Hoechst333342 染色的藍色熒光強度較弱，同時由于PI 不能透過細胞膜完整的細胞，故紅色熒光強度也很弱，但可見細胞飽滿，呈清晰完整的圓形或橢圓形。對于大戟大棗湯低、中、高劑量組及陽性對照組，細胞均可見藍色熒光，且隨著含藥血清劑量的增加，藍色亮染的細胞數(shù)目明顯增多，同時被PI 染色的細胞數(shù)量也增多，紅色熒光強度也逐漸增強，個別組細胞可見核碎裂、核解體等現(xiàn)象；對于與LY294002 聯(lián)合作用的各組（陰性對照＋LY294002 組、大戟大棗湯低劑量＋LY294002 組、大戟大棗湯中劑量＋LY294002組、大戟大棗湯高劑量＋LY294002 組）細胞，LY294002 作用濃度不變，也隨著含藥血清劑量的增加，細胞形態(tài)及熒光強度變化情況同單獨給予含藥血清的各組細胞變化趨勢相似，但變化程度明顯增加，見圖1。經高內涵分析可知，與陰性對照組比較，隨著含藥血清劑量的增加各組細胞熒光強度值逐漸增 強（P＜0.05，P＜0.01）；對于與LY294002 聯(lián)合作用的各組細胞，在LY294002 作用濃度不變的情況下細胞熒光強度值與陰性對照＋LY294002 組比較，也隨著含藥血清劑量的增加而增強（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

圖1 Hoechst333342／PI 染色觀察各組細胞凋亡的形態(tài)學Fig.1 The observation of cell apoptosis morphology in each group by Hoechst333342／PI staining

表1 大戟大棗湯含藥血清聯(lián)合LY294002 對MCF?7 細胞凋亡的影響（， n＝6）Tab.1 Effects of DEFSJ medicated serum combined with LY294002 on MCF?7 cells apoptosis（， n＝6）

表1 大戟大棗湯含藥血清聯(lián)合LY294002 對MCF?7 細胞凋亡的影響（， n＝6）Tab.1 Effects of DEFSJ medicated serum combined with LY294002 on MCF?7 cells apoptosis（， n＝6）

注：與陰性對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與陰性對照＋LY294002 組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 大戟大棗湯含藥血清對MCF?7 細胞形態(tài)的影響 空白對照組、陰性對照組細胞呈均勻綠色熒光；大戟大棗湯低、中、高劑量組隨著含藥血清劑量的增加，紅色熒光逐漸增強，合并后的圖形可見橘紅色熒光增加，同時隨著含藥血清劑量的增加細胞密度也出現(xiàn)了減少；陽性對照組細胞貼壁能力下降，形態(tài)變得圓潤，細胞數(shù)量減少，紅色熒光較強，合并后也呈較明顯的橘紅色熒光。見圖2。

圖2 吖啶橙?溴乙錠染色觀察各組細胞形態(tài)學變化Fig.2 Observation of the cellular morphological changes of each group by acridine orange?ethidium bromide staining

3.3 大戟大棗湯含藥血清對MCF?7 細胞PI3k／Akt信號通路的影響 如圖3～6 所示，與陰性對照組比較，大戟大棗湯低、中、高劑量組及陽性對照組MCF?7 細胞中PI3k、p?Akt、p?FoxO3a 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），隨著含藥血清劑量的增加逐漸降低。免疫熒光檢測時加入了DAPI、Action 探針染色，可見明顯的細胞形態(tài)輪廓，大戟大棗湯低、中、高劑量組隨著大戟大棗湯含藥血清劑量的增加，被DAPI 染色的細胞亮度均逐漸增強，細胞形態(tài)也出現(xiàn)了皺縮，細胞密度有所降低，并出現(xiàn)少量細胞碎片等典型的細胞凋亡的形態(tài)特征。

圖3 免疫熒光法檢測各組MCF?7 細胞PI3k 蛋白表達Fig.3 Detection of PI3k protein expression in MCF?7 cells of each group by immunofluorescence

圖4 免疫熒光法檢測各組MCF?7 細胞p?Akt 蛋白表達Fig.4 Detection of p?Akt protein expression in MCF?7 cells of each group by immunofluorescence

圖5 免疫熒光法檢測各組MCF?7 細胞p?FoxO3a 蛋白表達Fig.5 Detection of p?FoxO3a protein expression in MCF?7 cells of each group by immunofluorescence

3.4 大戟大棗湯含藥血清聯(lián)合LY294002 對PI3k／Akt 信號通路相關蛋白表達的影響 如圖7 所示，LY294002 加入前，單獨大戟大棗湯中劑量組作用的MCF?7 細胞與單獨陰性對照組比較，細胞p?Akt、p?FoxO3a 蛋白表達均降低；LY294002 加入后，陰性對照組＋LY294002 組與陰性對照組比較，細胞p?Akt、p?FoxO3a 蛋白表達降低；大戟大棗湯中劑量組＋LY294002 與大戟大棗湯中劑量組比較，細胞p?Akt、p?FoxO3a 蛋白表達也有所降低。

圖6 大戟大棗湯含藥血清對MCF?7 細胞PI3k、p?Akt、p?FoxO3a 蛋白表達的影響Fig.6 Effects of DEFSJ medicated serum on protein expression of PI3k，p?Akt，and p?FoxO3a in MCF?7 cells

圖7 大戟大棗湯含藥血清聯(lián)合LY294002 對p?Akt、p?FoxO3a蛋白表達的影響Fig.7 Effects of DEFSJ medicated serum combined with LY294002 on protein expression of p?Akt and p?FoxO3a in MCF?7 cells

4 討論

誘導腫瘤細胞凋亡已經成為抗腫瘤藥物研究的主流方向，無論是傳統(tǒng)細胞毒藥物或是靶向治療藥均通過誘導腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮作用，因此誘導細胞凋亡是評價抗腫瘤藥物療效的主要指標［13］。乳腺癌發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多步驟的復雜過程，其發(fā)病作用機制并不完全清晰，細胞增殖與凋亡的失衡是其關鍵性因素，故抑制細胞過度增殖及誘導細胞凋亡在相關治療中具有重要意義［4］。本研究通過高內涵細胞成像系統(tǒng)定性及定量的分析，考察了Hochest33342／PI 染色后大戟大棗湯含藥血清對細胞凋亡的影響，結果大戟大棗湯含藥血清可以誘導MCF?7 細胞凋亡。通過AO／EB 染色進一步發(fā)現(xiàn)，隨著含藥血清劑量的增加，細胞形態(tài)變化明顯，細胞數(shù)量逐漸減少，代表凋亡增多的紅色熒光強度逐漸增強，因此，初步證實大戟大棗湯含藥血清可誘導MCF?7 細胞發(fā)生凋亡。細胞凋亡是受基因調控的一種程序性死亡，受到一系列的信號傳導途徑調控，其中作為細胞內重要信號轉導通路之一的PI3k／Akt 信號通路，不僅對正常細胞的生長、存活、增殖及凋亡有調控作用，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也產生重要的影響［14］。也有研究指出，乳腺癌中PI3k／Akt 信號通 路的活 化高達70%［15］，而FoxO3a 是PI3k／Akt 信號通路下游一個重要的因子，同時PI3k／Akt 信號通路也是調節(jié)FoxO3a 的最主要途徑，是腫瘤凋亡、周期調控的關鍵因子之一?；罨疐oxO3a 可上調細胞凋亡因子，同時調節(jié)細胞周期因子，從而促進細胞凋亡和周期阻滯，抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［16］。本研究通過高內涵細胞成像系統(tǒng)結合Hochest33342／PI 染色分析了大戟大棗湯含藥血清對細胞凋亡的影響時，添加了PI3k特性抑制劑LY294002，發(fā)現(xiàn)加入LY294002 比同劑量單獨含藥血清組對細胞的凋亡作用明顯增強。同時，本研究采用了熒光染色標記的方法，通過激光共聚焦顯微鏡檢測PI3k／Akt 信號通路相關蛋白表達的變化，顯示大戟大棗湯含藥血清作用MCF?7細胞PI3k、p?Akt、p?FoxO3a 蛋白的熒光強度隨著含藥血清劑量增加逐漸降低，即蛋白表達量逐漸降低。最后，又通過Western blot 檢測LY294002 加入后對PI3k／Akt 信號通路相關蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)對比同劑 量單獨 含藥血清組，p?Akt、p?FoxO3a 蛋白表達均有所降低，表明PI3k／Akt 信號通路參與了大戟大棗湯含藥血清誘導MCF?7 細胞凋亡作用調控。