一測多評法同時測定克感額日敦片中9 種成分

季正棟 蘇 丹 唐麗丹 房燕冬

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院藥劑科， 江蘇 常州213003； 2.常州四藥制藥有限公司研發(fā)中心， 江蘇 常州213004）

克感額日敦片由梔子、苦參、土木香、訶子、懸鉤子木、川楝子、山柰7 味藥材加工而成，主要用于瘟病初期、感冒發(fā)燒、咳嗽、全身酸痛、頭痛、咽喉腫痛、胸脅刺痛等臨床病癥的治療，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1］及文獻(xiàn)［2?5］僅對其所含單一成分進(jìn)行定量分析。中藥制劑組成復(fù)雜，有效成分繁多，多種成分協(xié)同發(fā)揮作用以達(dá)到臨床療效，故僅檢測單一成分難以對其質(zhì)量進(jìn)行全面評價，但傳統(tǒng)多指標(biāo)成分控制方法存在對照品用量大、質(zhì)量不穩(wěn)定、不易獲得、價格昂貴等不足。

一測多評法利用中藥有效成分之間存在的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系，有效地解決了上述難題，同時該方法不僅普遍用于同類型成分的同時測定，在不同類型成分中也逐步得到應(yīng)用［6?9］。因此，本實驗采用一測多評法，以梔子苷為內(nèi)標(biāo)，建立梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯的相對校正因子，測定克感額日敦片中上述成分含有量，以期為該制劑全面質(zhì)量控制提供新的方法和思路。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；LC?20AD 型高效 液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；CP225D 型電子天平（德國Sarto?rius 公司）；KQ?500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。土木香內(nèi)酯（批號110760?201811，純 度99.4%）、異土木 香內(nèi)酯（批 號110761?201806，純 度97.4%）、梔子苷（批 號110749?201919，純度97.1%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。梔子新苷（批號CFS201901，純度98.0%）、苦參醇I（批號CFS201702，純度98.0%）對照品均購自武漢天植生物技術(shù)有限公司；羥異梔子苷（批號17101622，純度99.1%）、京尼平龍膽雙糖苷（批號18030422，純度98.4%）、苦參酮（批號18060822，純度97.7%）、槐屬二氫黃酮G（批號18060622，純度99.7%）對照品均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司?？烁蓄~日敦片（每片重0.25 g，批號34181003、34181106、34190205）購自內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯對照品適量，甲醇制成各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.232、0.898、1.634、2.982、0.454、1.876、0.412、0.998、1.766 mg／g 的貯備液，各精密吸取2.5 mL，甲醇稀釋，即得（各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別 為 11.6、44.9、81.7、149.1、22.7、93.8、20.6、49.9、88.3 μg／g）。

2.1.2 供試品溶液 取片劑適量，除去薄膜衣后研細(xì)，精密稱取0.4 g，精密加入25 mL 甲醇［10?11］，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min［10?11］，放 冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按片劑處方工藝，分別制備缺梔子、缺苦參、缺土木香的陰性樣品，按“2.1.2” 項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Agilent ZORBZX SB?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.05%磷酸（B），梯度洗脫（0～10.0 min，9.0%A；10.0～29.0 min，9.0%～35.0% A；29.0～51.0 min，35.0%～52.0% A；51.0～65.0 min，52.0%～60.0%A；65.0～75.0 min，60.0%～9.0%A）；體積流量0.9 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長238 nm（0～29.0 min，梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷）［12?14］、295 nm（29.0～51.0 min，苦參醇I、苦參酮、槐屬二 氫黃酮G）［15］、220 nm（51.0～75.0 min，異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯）［16］；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰峰形對稱，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分計均不低于4 000，色譜圖基線平穩(wěn)，陰性無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1” 項下貯備液適量，甲醇制成20 倍質(zhì)量濃度差的對照品溶液Ⅰ～Ⅵ，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.1.1” 項下對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯峰面積RSD 分別為1.26%、0.93%、0.57%、0.55%、1.17%、0.96%、1.22%、1.01%、0.63%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批片劑，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯含有量RSD 分別為1.58%、1.25%、0.96%、0.89%、1.38%、1.14%、1.61%、1.37%、0.99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取新配供試品溶液1 份，于0、2、4、6、10、12 h 在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯峰面積RSD 分別為1.23%、1.01%、0.61%、0.59%、1.22%、0.94%、1.18%、0.97%、0.70%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取各成分含有量已知的同一批片劑，除去薄膜衣后研細(xì)，精密稱取9 份，每份0.2 g，精密加入對照品溶液（梔子新苷0.128 mg／mL、羥異梔子苷0.506 mg／mL、京尼平龍膽雙糖苷0.932 mg／mL、梔子苷1.966 mg／mL、苦參醇I 0.302 mg／mL、苦參酮1.194 mg／mL、槐屬二氫黃酮 G 0.238 mg／mL、異土木 香內(nèi)酯0.682 mg／mL、土木香內(nèi)酯1.126 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果，梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯平均加樣回收率（RSD）分別為96.94%（1.26%）、99.13%（1.42%）、98.96%（0.99%）、99.37%（0.86%）、97.92%（1.50%）、100.00%（0.76%）、98.67%（0.90%）、98.99%（0.84%）、97.86%（1.00%）。

2.4 相對校正因子測定 精密吸取“2.3.2” 項下對照品溶液Ⅰ～Ⅵ，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以梔子苷為內(nèi)標(biāo)，計算其他8 種成分的相對校正因 子fk／s，公式為fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck為其他成分含有量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含有量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見表2。

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性試驗

2.5.1 儀器、色譜柱 精密吸取“2.1.2” 項下對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，考察Agilent 1200、LC?20AD 色譜儀，以 及 Agilent ZORBZX SB?C18、Waters Symmetry C1、Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對相對校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知均無明顯影響（RSD＜3%）。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 體積流量 精密吸取“2.1.2” 項下對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，考察體積流量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL／min 對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜3%）。

表4 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.6 色譜峰定位 精密吸取“2.1.2” 項下對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，以梔子苷為內(nèi)標(biāo)，采用相對保留時間法對色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見表5。

2.7 樣品含有量測定 取3 批片劑，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法測定含有量，結(jié)果見表6。由此可知，2 種方法所得結(jié)果接近，相對平均偏差（RAD）均小于3%。

表5 各成分相對保留時間Tab.5 Relative retention time of various constituents

表6 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.6 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分篩選 在克感額日敦片中，君藥梔子的主要成分為梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷等環(huán)烯醚萜，臣藥苦參的主要成分為苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G 等異戊烯基黃酮，佐藥土木香的主要成分為土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯等倍半萜內(nèi)酯。參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則，本實驗選取上述9 種成分作為指標(biāo)進(jìn)行檢測。

3.2 色譜峰定位方法篩選 本實驗分別采用相對保留時間法、保留時間差法定位色譜峰，發(fā)現(xiàn)后者在不同儀器、色譜柱下測得的RSD 明顯高于前者。因此，選擇相對保留時間法進(jìn)行定位。

3.3 供試品溶液制備方法篩選 本實驗比較了提取溶 劑（甲 醇［10?11，15］、70% 甲 醇［13］、95% 乙 醇、70%乙醇［12，16］），發(fā)現(xiàn)甲醇提取時雜質(zhì)干擾較小，各成分提取充分；比較了提取方式（超聲［10?16］、加熱回流），發(fā)現(xiàn)加熱回流提取時雜質(zhì)干擾嚴(yán)重；比較了 提取時 間（45 min［11］、60 min［15］、90 min），發(fā)現(xiàn)苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G提取60、90 min 時的效果差異不大，但明顯高于45 min，可能與克感額日敦片中苦參采用細(xì)粉直接入藥方式有關(guān)。最終確定，供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取60 min。

3.4 檢測波長篩選 本實驗采用二極管陣列檢測器，在190～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷在238 nm 處有較大吸收，苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G 在291～297 nm 處有較大吸收，異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯在190～220 nm 處有較大吸收。為了避免末端吸收對檢測結(jié)果的影響，結(jié)合文獻(xiàn)［12?16］，本實驗選擇220、238、295 nm，同時發(fā)現(xiàn)單一波長難以對克感額日敦片中9 種成分同時進(jìn)行測定，故采用“2.2” 項下多波長切換模式。

4 結(jié)論

本實驗首次采用一測多評法同時測定克感額日敦片中梔子新苷、羥異梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯的含有量，該方法簡便準(zhǔn)確，可大大降低檢驗成本，為該制劑全面質(zhì)量控制提供新的方法和思路。