郭 鑫, 諸葛姝芮, 齊旭升
(湖北省十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院兒科, 湖北 十堰 442000)
咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma,CVA)是一種以咳嗽為主要病癥的特殊支氣管哮喘,又稱之為咳嗽型哮喘。臨床主要癥狀為慢性持續(xù)性干咳,多以夜間咳嗽為主??人宰儺愋韵愃朴诘湫偷南l(fā)病機(jī)制,主要與致敏、氣道炎癥和氣道重塑密切相關(guān)[1]。氣道重塑會(huì)造成氣道結(jié)構(gòu)的改變,氣道壁增厚,平滑肌增生以及炎性浸潤(rùn)等;研究限制抑制炎癥反應(yīng)可以有效改善CVA癥狀[2]。目前NF-κB是一種與炎性反應(yīng)關(guān)系密切的信號(hào)通路分子,NF-κB信號(hào)通路廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi),參與多種基因的調(diào)控,對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡、組織炎癥反應(yīng)等起著重要作用。目前臨床使用糖皮質(zhì)激素可以有效治療CVA,有學(xué)者認(rèn)為糖皮質(zhì)激素可以抑制炎癥反應(yīng)達(dá)到治療CAV的效果,有學(xué)者認(rèn)為糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)特征實(shí)現(xiàn)治療CVA[3]。但目前關(guān)于糖皮質(zhì)激素治療CVA的機(jī)制尚不完全明確。本文通過(guò)構(gòu)建咳嗽變異性哮喘模型大鼠,用抗支糖漿與糖皮質(zhì)激素地塞米松聯(lián)合使用,研究抗支糖漿聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對(duì)咳嗽變異性哮喘模型大鼠的機(jī)制,為CVA患者的治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。
1.1材料:SD大鼠50只,購(gòu)于由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022;抗支糖漿、地塞米松片分別購(gòu)于重慶制藥廠有限公司和廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司。卵蛋白、氫氧化鋁干粉購(gòu)于美國(guó)sigma公司;β-actin、NF-κB、MMP-9和VEGF、蛋白抑制劑等(Santa Cruz公司,美國(guó));HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG(Thermo公司,美國(guó));細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(Bio -Rad,美國(guó)),霧化器(Boy 037G6000,德國(guó)Pari公司)DNM-9606酶標(biāo)分析儀(北京朗普新技術(shù)有限公司中國(guó));濕轉(zhuǎn)儀(AB公司,美國(guó));凝膠成像系統(tǒng)(DNR公司,以色列),電泳儀(Bio-red,美國(guó)),其他儀器購(gòu)于德國(guó)eppendorf公司。
1.2方 法
1.2.1動(dòng)物分組及模型構(gòu)建:將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組,10只每組分別為:對(duì)照組、模型組、抗支糖漿組、糖皮質(zhì)激素組和聯(lián)合用藥。對(duì)照組用生理鹽水致敏(1mL腹腔注射)和霧化激發(fā)。其余四組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)第1天、7d和14d腹腔注射1mL致敏溶液(10ug OVA和1mg氫氧化鋁),第21天起作為激發(fā)時(shí)間起點(diǎn),大鼠放在霧化吸入箱內(nèi)用霧化器霧化吸入30g/L OVA溶液5mL,3次/周,30min/次,連續(xù)激發(fā)三周;激發(fā)前30min;抗支糖漿組灌胃200uL/次;糖皮質(zhì)激素組灌胃等容積量的地塞米松片1.5mg/次;聯(lián)合用藥組灌胃200uL的抗支糖漿和1.5mg的地塞米松;對(duì)照組和模型組灌胃等體積量的生理鹽水。
1.2.2樣本采集:末次哮喘激發(fā)后24h,將大鼠處死,打開大鼠胸腔,完整取出大鼠的肺用于組織蛋白提取檢測(cè)或用4%的多聚甲醛固定,石蠟包埋切片,用于免疫組化分析。
1.2.3組織學(xué)檢測(cè):大鼠的肺組織經(jīng)HE染色處理后,每個(gè)組織樣本選擇3張切片,采用美國(guó)圖像采集及圖像分析系統(tǒng),用光筆描繪出氣道基底膜的周長(zhǎng)及平滑肌的內(nèi)外分界線,測(cè)定基底膜周徑(Pbm)、內(nèi)管壁的面積(Wai)、支氣管平滑肌的面積(Wam);用后兩個(gè)數(shù)值除以基底膜周徑,用于樣本組織的支氣管壁厚度、平滑肌厚度。
1.2.4組織樣本蛋白表達(dá)檢測(cè):肺組織用剪刀剪取小塊,提取組織總蛋白,酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行蛋白定量。12% SDS-PAGE電泳分離,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,4℃條件依次加入封閉液孵育2h,一抗孵育過(guò)夜(稀釋比例均為1∶1000),二抗孵育2h(稀釋比例均為1∶5000)。以β-actin為內(nèi)參蛋白,用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,在凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)分析蛋白條帶。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于服從正態(tài)分布的連續(xù)型資料,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較,當(dāng)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),進(jìn)一步采用SNK方法進(jìn)行兩兩比較;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1肺組織病理學(xué)改變:光鏡下分析HE的組織染色結(jié)果,如圖1所示:與對(duì)照組的氣道上皮完整,無(wú)明顯改變相比,模型組的肺組織及周邊組織結(jié)構(gòu)紊亂,氣道上皮組織壞死、脫落,存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),平滑肌面積增大,厚度增厚。其他治療三組的管腔規(guī)整,氣道壁及平滑肌無(wú)明顯增厚,氣道上皮存在少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
圖1 各組大鼠肺組織HE染色分析(×200)
2.2圖像分析檢測(cè)結(jié)果:通過(guò)圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分析各組大鼠肺組織樣本的平滑肌和支氣管壁厚度情況,結(jié)果如表1所示:與對(duì)照組組相比,其余4組的支氣管壁和平滑肌顯著增厚(P<0.05);與模型組相比較,單獨(dú)用藥組和聯(lián)合用藥組的支氣管壁和平滑肌的增厚情況明顯改善,其組織厚度明顯降低(P<0.05),且聯(lián)合用藥組的增厚情況明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥組(P<0.05);而抗支糖漿和地塞米松之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析無(wú)意義(P>0.05),表明抗支糖漿與糖皮質(zhì)激素地塞米松的聯(lián)合用藥能夠抑制哮喘大鼠模型的平滑肌和支氣管壁增厚。
圖2 westernblot蛋白分析
表1 各組大鼠支氣管壁和平滑肌增厚情況
2.3westernblot蛋白表達(dá)分析:Westernblot分析各組大鼠肺組織中IκB、NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)情況,結(jié)果如圖2所示:與對(duì)照組相比,其余4組IκB表達(dá)量顯著降低,模型組基本不表達(dá)IκB蛋白,NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白明顯增高(P<0.05);與模型組相比,單獨(dú)用藥組與聯(lián)合用藥組IκB蛋白表達(dá)增加,NF-κB、MMP-9和VEGF明顯降低(P<0.05);單獨(dú)用藥組間蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化,聯(lián)合用藥組IκB表達(dá)增加量和NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)減少量明顯高于其他用藥組(P<0.05)。表明抗支糖漿與糖皮質(zhì)激素地塞米松的聯(lián)合用藥能夠抑制IκB蛋白的降解,下調(diào)NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)。
表2 westernblot蛋白分析
咳嗽變異性哮喘又稱咳嗽性哮喘,1972年Gluser首次報(bào)道了該病并命名為變異性哮喘,是指以慢性咳嗽為主要或唯一臨床表現(xiàn)的一種特殊類型哮喘[4]??人宰儺愋韵R床主要癥狀為慢性持續(xù)性干咳,多以夜間咳嗽為主,患者在運(yùn)動(dòng)后咳嗽的程度會(huì)有所加重,臨床無(wú)感染,長(zhǎng)期的抗生素治療無(wú)效,表現(xiàn)出嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等增多,同時(shí)易出現(xiàn)氣道上皮組織化;基底膜、氣道平滑肌、氣道壁增厚[5]。咳嗽變異性哮喘類似于典型的哮喘發(fā)病機(jī)制,主要與致敏、氣道炎癥和氣道重塑密切相關(guān)。
抗支糖漿聯(lián)合糖皮質(zhì)激素可以調(diào)控NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)以及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平,實(shí)現(xiàn)調(diào)控炎癥反應(yīng),而炎癥反應(yīng)與CVA的關(guān)系密切[6]。NF-κB信號(hào)通路在機(jī)體中參與多種基因的調(diào)控,影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[7]。當(dāng)患者的NF-κB信號(hào)傳遞途徑被激活以后,IκB蛋白會(huì)發(fā)生水解釋放出NF-κB蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中參與對(duì)下游基因MMP9蛋白和VEGF蛋白的表達(dá)[8,9]。本文通過(guò),研究抗支糖漿和糖皮質(zhì)激素地塞米松合用對(duì)咳嗽變異性哮喘模型大鼠的影響,通過(guò)組織染色發(fā)現(xiàn):聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥都能夠顯著降低模型大鼠,氣道壁及平滑肌無(wú)明顯增厚,氣道上皮存在少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);通過(guò)對(duì)組織的氣道壁和平滑肌厚度檢測(cè)發(fā)現(xiàn):聯(lián)合用藥能夠顯著與單獨(dú)用藥組和模型組相比,均能夠顯著抑制肺組織的氣道壁和平滑肌增厚;提取各組大鼠肺組織的總蛋白,通過(guò)westernblot分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比其余4組IκB表達(dá)量顯著降低,模型組基本不表達(dá)IκB蛋白,NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白明顯增高(P<0.05);與模型組相比,單獨(dú)用藥組與聯(lián)合用藥組IκB蛋白表達(dá)增加,NF-κB、MMP-9和VEGF明顯降低(P<0.05);單獨(dú)用藥組間蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化,聯(lián)合用藥組IκB表達(dá)增加量和NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)減少量明顯高于其他用藥組(P<0.05)。
綜上所述:抗支糖漿和糖皮質(zhì)激素地塞米松合用,能夠通過(guò)NF-κB信號(hào)通路,抑制IκB蛋白水解,降低NF-κB的釋放,下調(diào)MMP-9和VEGF蛋白表達(dá),阻止肺部氣道壁和平滑肌的增厚,改善模型大鼠的哮喘癥狀。