芫參顆粒對正常小鼠抗氧化和抗缺氧作用的研究

謝紅軍 旦增久美 雪嘎 土登益西 卓瑪東智 趙靜 羅布占堆 王聚樂

摘 要 目的：研究芫參顆粒對正常小鼠的抗氧化和抗缺氧作用。方法：將800只小鼠隨機分為空白對照組，芫參顆粒低、中、高劑量組（10、20、 40 g/kg）和紅景天口服液組（陽性對照，2 mL/kg），每組160只。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天給藥1次，連續(xù)給藥30 d;空白對照組小鼠同法灌胃等容生理鹽水。分別在給藥后第1、3、7、14、30天各時間點，各組均隨機選取8只小鼠分別進行常壓、減壓耐缺氧實驗，心肌、腦組織中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量測定，以及H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血情況考察。結(jié)果：與空白對照組比較，芫參顆粒各劑量組小鼠的常壓耐缺氧存活時間和減壓耐缺氧存活時間（自給藥7 d后）均顯著延長（P<0.05）;心肌、腦組織中MDA含量（分別自給藥3或7 d后和自給藥3、7或14 d后）均顯著降低（P<0.05），SOD含量（分別自給藥7、14或30 d后和自給藥7 d后）均顯著升高（P<0.05）;紅細(xì)胞溶血率（自給藥3或7 d后）顯著降低（P<0.05）。芫參顆粒中、高劑量組上述指標(biāo)在部分時間點的改善效果顯著優(yōu)于紅景天口服液組（P<0.05）。結(jié)論：芫參顆?？捎行а娱L正常小鼠的耐缺氧存活時間，對正常小鼠有抗氧化和抗缺氧的作用，且其中、高劑量的效果優(yōu)于紅景天口服液。

關(guān)鍵詞 芫參顆粒;抗氧化;抗缺氧;丙二醛;超氧化物歧化酶;小鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the anti-oxidation and anti-hypoxia effect of Yuanshen granule on normal mice. METHODS： Totally 800 mice were randomly divided into blank control group， Yuanshen granule low-dose， middle-dose and high-dose groups （10， 20， 40 g/kg） and Hongjingtian oral liquid group （positive control， 2 mL/kg）， with 160 mice in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 30 d. Blank control group was given constant volume of normal saline by the same method. At 1st， 3rd， 7th， 14th and 30th day after administration， 8 mice in each group at each time point were randomly selected for anoxia tolerance test under normobaric pressure and decompression; the contents of MDA and SOD in myocardium and cerebral tissue were measured; the hemolysis effect of red blood cell induced by H2O2 was investigated. RESULTS：Compared with blank control group， the survival time of anoxia tolerance under normobaric pressure and under decompression（after 7 days of administration） were prolonged significantly in Yuanshen granule groups （P<0.05）. The contents of MDA in myocardium and cerebral tissue （after 3 or 7 days of administration; after 3， 7 or 14 days of administration） were significantly decreased （P<0.05）， and the contents of SOD （after 7， 14 or 30 days of administration; after 7 days of administration） were increased significantly （P<0.05）; the erythrocyte hemolysis rate （after 3 or 7 days of administration） was significantly decreased （P<0.05）. At some time points， the improvement effect of the above indexes in the Yuanshen granule middle-dose and high-dose groups was significantly better than that of Hongjingtian oral liquid group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Yuanshen granule can effectively prolong the hypoxia tolerance survival time of normal mice， it has anti-oxidant and anti-hypoxia effects on normal mice， and the effect of Yuanshen granule middle-dose and high-dose groups is better than that of Hongjingtian oral liquid group.

KEYWORDS ? Yuanshen granule; Anti-oxidation; Anti-hypoxia; MDA; SOD; Mice

機體的氧化還原系統(tǒng)在多種生物學(xué)功能中均具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。在正常情況下，機體通過自身調(diào)節(jié)可以使體內(nèi)的氧化和抗氧化系統(tǒng)達到平衡，但當(dāng)各種內(nèi)、外環(huán)境的不良刺激超出了機體自身的調(diào)節(jié)和處理能力時，就可能導(dǎo)致相應(yīng)的機體氧化損傷[2]。而氧化損傷和機體多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如高血壓、腫瘤等[2]。高原為缺氧的環(huán)境條件，長期缺氧對于居住在高原的人們產(chǎn)生了較大的健康危害，故抗缺氧藥物的研發(fā)具有重要意義[3]。

已有研究顯示，雖然多種物質(zhì)[如谷胱甘肽抗氧化酶、超氧化物歧化酶（SOD）等]在機體中均具有抗氧化和抗缺氧的作用[4]，但相關(guān)的上市制劑卻嚴(yán)重缺乏。芫參顆粒是采用藏藥秘方制備而成，是以手掌參、芫根、西洋參3味藥材為主要成分，此3味藥材在西藏地區(qū)作為膳食補充已有較為廣泛的應(yīng)用。其中，芫根具有提升胃陽的作用，藏醫(yī)認(rèn)為胃是“三因”平衡的基礎(chǔ)，其對藏醫(yī)中“三因”紊亂引起的疾病具有預(yù)防作用[5];手掌參具有增力生精、溫腎暖腎的作用，是藏醫(yī)中治療腎虛的首選草藥，藏醫(yī)認(rèn)為人體疲勞的主要原因與腎虛有關(guān)，因此手掌參是方中抗疲勞的主要藥物[6];西洋參具有補氣養(yǎng)陰、清熱生津的作用，藏醫(yī)中肺屬于氣的貯藏，肺虛與疲勞有關(guān)[7]。根據(jù)組方組成及民間應(yīng)用可知，芫參顆粒具有抗疲勞、預(yù)防“三因”紊亂的功效，且制劑工藝簡單、副作用小、組方藥材資源豐富，是具有較高研發(fā)價值的藏藥方劑之一[8]。本研究擬對芫參顆粒的抗氧化和抗缺氧功能進行評價，為擴大其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

FA2004型電子天平（上?；ǔ彪娖饔邢薰荆?JT-C型電子勻漿機（漯河市金田試驗設(shè)備研究所）;Vortex-Genie2型漩渦混合器（美國SI公司）;TG16MW型臺式高速實驗室離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）;V-1200 型可見分光光度計（南京卓恒科學(xué)儀器有限公司）;FYL-YS-150L型恒溫孵育箱（北京福意電器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芫參顆粒（西藏白克藥材開發(fā)有限公司，批號：190505，規(guī)格：10 g/袋）;紅景天口服液（西藏藏藥集團股份有限公司，批號：170530，規(guī)格：10 mL/支）;鈉石灰（天津市福晨化學(xué)儀器廠，批號：20171009）;30%H2O2溶液（廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司，批號：20180716）;丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號：180603）、SOD檢測試劑盒（批號：180215）購自南京建成生物工程研究所;其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 動物

800只清潔級ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量25～30 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2017-0002。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25 ℃、相對濕度為50%～60%，每周更換墊料并對籠具洗滌、消毒1次，每日照明10～14 h，于每日下午加滿料塊及飲水。實驗期間嚴(yán)格遵守動物實驗的倫理要求。

2 方法

2.1 分組與給藥

將800只ICR小鼠隨機分為5組，每組160只，分別為空白對照組，芫參顆粒低、中、高劑量組（10、20、40 ? ? g/kg，給藥劑量根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定）和紅景天口服液組（陽性對照，2 mL/kg）[9]?？瞻讓φ战M小鼠灌胃生理鹽水，其余各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天給藥1次，連續(xù)給藥30 d。

2.2 小鼠常壓耐缺氧實驗

分別于給藥后第1、3、7、14、30天，每組分別隨機取8只小鼠進行常壓耐缺氧實驗。于各時間點給藥1 h后，將小鼠分別置于500 mL用凡士林密封的廣口瓶中（瓶內(nèi)預(yù)先放置10 g鈉石灰以吸收二氧化碳和水），每瓶放1只小鼠，從加蓋后立即開始計時，直至小鼠最后一次呼吸為止（通過觀察小鼠頭部起伏以及大小便失禁情況判斷），觀察并記錄小鼠的常壓耐缺氧存活時間。

2.3 小鼠減壓耐缺氧實驗

分別于給藥后第1、3、7、14、30天時，每組分別隨機取8只小鼠進行減壓耐缺氧實驗。于各時間點給藥1 h后，將小鼠分別置于2 L干燥器中（瓶內(nèi)預(yù)先放置10 g鈉石灰以吸收二氧化碳和水），干燥器通過橡膠管連接于抽氣泵和玻璃平衡瓶，以抽氣泵抽氣至玻璃瓶內(nèi)壓力為200 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）時，將干燥器蓋蓋緊并打開氣閥，使干燥器和玻璃瓶氣壓平衡。然后，從關(guān)閉氣閥后立即開始計時，直至小鼠最后一次呼吸為止，觀察并記錄小鼠的減壓耐缺氧存活時間。

2.4 小鼠心肌、腦組織中MDA、SOD含量測定

分別于給藥后第1、3、7、14、30天，每組分別隨機取8只小鼠進行心肌、腦組織中MDA和SOD含量測定。于各時間點給藥1 h后，取小鼠以脫頸法處死，然后立即用鋒利剪刀斷頭，迅速取心肌、腦組織，用冰冷生理鹽水洗凈，濾紙拭干，稱質(zhì)量，然后以生理鹽水制成10%組織勻漿液。分別采用TBA比色法和黃嘌呤氧化酶法檢測心、腦組織中MDA、SOD含量，具體操作均按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

2.5 小鼠紅細(xì)胞溶血情況測定

分別于給藥后第1、3、7、14、30天，每組分別隨機取8只小鼠進行紅細(xì)胞溶血實驗。于各時間點給藥1 h后，將小鼠斷頭取血，采用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，并其制成5%的紅細(xì)胞懸液。分別取紅細(xì)胞懸液1 mL，加入30%H2O2溶液使H2O2的終濃度為2 mmol/L，在37 ℃下孵育1 h后，以5 000 r/min常溫離心15 min。取上清液，用生理鹽水稀釋20倍后，采用可見分光光度計測定415 nm波長處的吸光度值，以吸光度值的大小反映紅細(xì)胞的溶血率，其值越大，代表溶血率越高。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠常壓耐缺氧存活時間測定結(jié)果

與空白對照組比較，給藥14、30 d后紅景天口服液組小鼠以及給藥7、14、30 d后芫參顆粒低、中、高劑量組小鼠的常壓耐缺氧存活時間均顯著延長（P<0.05）;并且芫參顆粒高劑量組小鼠給藥30 d后的常壓耐缺氧存活時間顯著長于紅景天口服液組（P<0.05）。各組小鼠給藥不同時間后的常壓耐缺氧存活時間測定結(jié)果見表1。

3.2 小鼠減壓耐缺氧存活時間測定結(jié)果

與空白對照組比較，紅景天口服液組和芫參顆粒中劑量組小鼠自給藥3 d后，芫參顆粒低劑量組小鼠自給藥7 d后，芫參顆粒高劑量組小鼠自給藥1 d后，其減壓耐缺氧存活時間均顯著延長（P<0.05）;并且芫參顆粒高劑量組小鼠自給藥3 d后以及中劑量組小鼠自給藥14 d后，其減壓耐缺氧存活時間均顯著長于紅景天口服液組（P<0.05）。各組小鼠給藥不同時間后的減壓耐缺氧存活時間測定結(jié)果見表2。

3.3 小鼠心肌、腦組織中MDA含量測定結(jié)果

3.3.1 心肌組織中MDA含量測定結(jié)果 與空白對照組比較，紅景天口服液組和芫參顆粒低劑量組小鼠自給藥7 d后，芫參顆粒中、高劑量組小鼠自給藥3 d后，其心肌組織中MDA含量均顯著降低（P<0.05）;并且芫參顆粒中劑量組小鼠在給藥14 d時和高劑量組小鼠自給藥7 d后，其心肌組織中MDA含量顯著低于紅景天口服液組（P<0.05）。各組小鼠給藥不同時間后心肌組織中MDA含量測定結(jié)果見表3。

3.3.2 腦組織中MDA含量測定結(jié)果 與空白對照組比較，紅景天口服液組和芫參顆粒低劑量組小鼠自給藥14 d后，芫參顆粒中劑量組小鼠自給藥7 d后，芫參顆粒高劑量組小鼠自給藥3 d后，其腦組織中MDA含量均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠給藥不同時間后腦組織中MDA含量測定結(jié)果見表4。

3.4 小鼠心肌、腦組織中SOD含量測定結(jié)果

3.4.1 心肌組織中SOD含量測定結(jié)果 與空白對照組比較，紅景天口服液組和芫參顆粒低劑量組小鼠在給藥30 d時，芫參顆粒中劑量組小鼠自給藥14 d后，芫參顆粒高劑量組小鼠自給藥7 d后，其心肌組織中SOD含量均顯著升高（P<0.05）;并且芫參顆粒中劑量組小鼠在給藥30 d時和高劑量組小鼠自給藥7 d后，其心肌組織中SOD含量顯著高于紅景天口服液組（P<0.05）。各組小鼠給藥不同時間后心肌組織中SOD含量測定結(jié)果見表5。

3.4.2 腦組織中SOD含量測定結(jié)果 與空白對照組比較，紅景天口服液組小鼠自給藥14 d后，芫參顆粒低、中、高劑量組小鼠自給藥7 d后，其腦組織中SOD含量均顯著升高（P<0.05）;并且芫參顆粒中劑量組小鼠在給藥14 d后和高劑量組小鼠在給藥7、30 d時，其腦組織中SOD含量顯著高于紅景天口服液組（P<0.05）。各組小鼠給藥不同時間后腦組織中SOD含量測定結(jié)果見表6。

3.5 小鼠紅細(xì)胞溶血情況考察結(jié)果

與空白對照組比較，紅景天口服液組和芫參顆粒低劑量組小鼠自給藥7 d后，芫參顆粒中、高劑量組小鼠自給藥3 d后，其紅細(xì)胞溶血率均顯著降低（P<0.05）;并且芫參顆粒中劑量組小鼠在給藥14 d時和高劑量組小鼠在給藥3、14、30 d時，其紅細(xì)胞溶血率均顯著低于紅景天口服液組（P<0.05）。各組小鼠給藥不同時間后的紅細(xì)胞溶血率測定結(jié)果見表7。

4 討論

機體缺氧或者各種原因引起的機體對氧氣的利用率降低，均可能會造成不同程度的氧化損傷[10]。現(xiàn)有研究顯示，缺氧應(yīng)激反應(yīng)和多種疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[11]。例如在重癥感染的患者中，由于組織局部缺血，使所需氧氣很難有效供給，導(dǎo)致自由基的大量產(chǎn)生，且機體線粒體電子傳遞鏈對氧的不良利用會增加缺血期間的氧化應(yīng)激，并加重膿毒癥患者的病情嚴(yán)重程度和影響患者預(yù)后[12-13]。因此，針對缺氧以及氧化應(yīng)激機制開發(fā)具有抗缺氧和抗氧化功能的制劑具有重要意義。

我國青藏高原的高缺氧、強輻射、高寒等特性嚴(yán)重影響著當(dāng)?shù)鼐用竦纳】?，使得?dāng)?shù)叵忍煨园l(fā)育不良、后天性心血管以及免疫系統(tǒng)等疾病的發(fā)病率明顯高于低海拔地區(qū)。但是，其獨特的地理位置和環(huán)境卻又造就了品種豐富且功能獨特的藏藥資源[14]。近年來，針對藏藥的研究得到了廣泛的關(guān)注，但是主要集中在細(xì)胞或者動物層面的基礎(chǔ)研究，而相關(guān)制劑的開發(fā)和應(yīng)用研究有待進一步增強[15]。開展藏藥資源的開發(fā)利用研究，對于藏藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的價值[16]。手掌參和芫根均是藏族人民經(jīng)常食用以緩解高原反應(yīng)的藥食同源植物，高原獨特的氣候使得這些藥用植物累積了非常豐富的具有抗氧化作用的次生代謝產(chǎn)物，此外，兩者還具有免疫調(diào)節(jié)等多種功效[17-18]。近年來，有關(guān)西洋參藥理學(xué)效應(yīng)的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其除了具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用外，對于心血管疾病、代謝性疾病、腫瘤的治療都具有一定的效用[19]。紅景天是目前研究較多的被證明有抗氧化和抗缺氧能力的藥物，并且相關(guān)產(chǎn)品如紅景天口服液已開發(fā)上市且應(yīng)用廣泛[20-21]，故以其為陽性對照進行實驗。

MDA的含量是反映機體抗氧化潛在能力的重要指標(biāo)，而SOD是機體清除過氧化基的特異性酶。此外，抗氧化劑可通過抑制過氧化自由基誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血，從而發(fā)揮其抗氧化作用。本研究結(jié)果顯示，芫參顆粒可有效延長小鼠在常壓和減壓條件下的耐缺氧存活時間，顯著降低其心肌、腦組織中MDA含量，提高其心肌、腦組織中SOD含量，并能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血，表明其對正常小鼠具有抗氧化和抗缺氧的作用，并且芫參顆粒中、高劑量組上述指標(biāo)在部分時間點的改善效果顯著優(yōu)于陽性藥紅景天口服液組。

綜上所述，芫參顆?？捎行а娱L正常小鼠的耐缺氧存活時間，對正常小鼠有抗氧化和抗缺氧的作用，且其中、高劑量的效果優(yōu)于紅景天口服液。

參考文獻

[ 1 ] 孫全貴，龍子，張曉迪，等.抗氧化系統(tǒng)研究新進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2016，16（11）：2197-2200.

[ 2 ] 沈云輝，陳長勛.抗氧化應(yīng)激研究進展[J].中成藥，2019，41（11）：2715-2719.

[ 3 ] 陳海娟，張國燕，曾陽.抗缺氧藏藥的研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（2）：180-181.

[ 4 ] 沈云輝，陳長勛.抗氧化應(yīng)激研究進展[J].中成藥，2019，41（11）：2715-2719.

[ 5 ] 胡賢達，趙華龍，王彪，等.藏藥芫根提取物對小鼠抗缺氧能力的研究[J].中國生化藥物雜志，2016，36（1）：37-39.

[ 6 ] 鄧永琦，耿耘，馬超英.手掌參化學(xué)成分及藥理活性研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，41（9）：81-83.

[ 7 ] 劉笑男，歷凱，盛波，等.西洋參藥理學(xué)研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，21（11）：112-115.

[ 8 ] 駱芷寒，彭博，王禹蒙，等.芫根提取液抗疲勞作用的實驗研究[J].西部醫(yī)學(xué)，2020，32（5）：652-656.

[ 9 ] 覃輝艷，李鳳文，馬宇燕，等.紅景天口服液對小鼠缺氧耐受力的影響[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（11）：1917-1918.

[10] GERBER PA，RUTTER GA.The role of oxidative stress and hypoxia in pancreatic beta-cell dysfunction in diabetes mellitus[J]. Antioxid Redox Sign，2017，26（10）：501- 518.

[11] NETZER N，GATTERER H，F(xiàn)AULHABER M，et al. Hypoxia，oxidative stress and fat[J]. Biomolecules，2015，5（2）：1143-1150.

[12] BAR-OR D，CARRICK MM，MAINS CW，et al. Sepsis，oxidative stress，and hypoxia：are there clues to better treatment？[J]. Redox Rep，2015，20（5）：193-197.

[13] 姜啟棟，張雪梅，伍長學(xué).連續(xù)腎替代治療加用不同劑量血必凈對膿毒癥合并急性腎損傷患者的影響[J].中國藥房，2018 ，29（5）：1087-1091.

[14] 陳維武，孫利華.從知識價值鏈視角看藏藥新藥研發(fā)策略[J].中國新藥雜志，2019，28（17）：2049-2055.

[15] 劉愛萍，吳瓊慧，陳葛，等.我國藏藥研究的網(wǎng)絡(luò)分析[J].中國藥物評價，2016，33（6）：468-472.

[16] 李軒豪，趙彩云，劉悅，等.青藏高原藏藥資源與品質(zhì)評價研究進展[J].中國中藥雜志，2016，41（4）：562-566.

[17] 江洪濤，馬斌，畢娜，等.林芝手掌參營養(yǎng)成分分析與評價[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（22）：135-140.

[18] 李云虹.西藏蕪菁防治缺氧性肺水腫和腦水腫的作用及機制研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2019.

[19] 金鐵，楊詠潔，李鉉軍，等.高山紅景天對小鼠抗疲勞及抗氧化作用的研究[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（19）：33-35.

[20] 呂婧，李晨，楊龍飛，等. 基于斑馬魚模型的西洋參提取物心臟保護作用研究[J].中國藥房，2020，31（3）：308- 313.

[21] 羅蘭.紅景天提取物對運動小鼠抗氧化能力的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2018，38（23）：189-191.

（收稿日期：2020-04-08 修回日期：2020-07-23）

（編輯：林 靜）