四君子湯對(duì)慢性腎臟病-蛋白質(zhì)能量消耗模型小鼠的改善作用及機(jī)制研究

許燁 李志明 遠(yuǎn)方

摘 要 目的：研究四君子湯對(duì)慢性腎臟病-蛋白質(zhì)能量消耗（CKD-PEW）模型小鼠骨骼肌萎縮的改善作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法：將80只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=10）和造模組（n=70）。造模組小鼠采用切除5/6腎聯(lián)合低蛋白（4%酪蛋白）飲食法建立CKD-PEW模型。將造模成功的50只小鼠隨機(jī)分為模型組，四君子湯低、中、高劑量組[2.34、4.68、9.36 g/（kg·d），以生藥量計(jì)]和復(fù)方α-酮酸片組[陽性對(duì)照，1 g/（kg·d）]，每組10只。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃14 d。末次給藥后，稱定小鼠體質(zhì)量、左側(cè)脛骨前肌（TA）濕質(zhì)量，并測(cè)定TA橫截面積;檢測(cè)小鼠TA蛋白合成與分解代謝情況;采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)小鼠TA中B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）及胱天蛋白酶3（Caspase-3） mRNA表達(dá)水平;采用Western blotting法檢測(cè)小鼠TA中肌萎縮蛋白Fbox-1（Atrogin-1）、肌環(huán)指蛋白1（MuRF-1）、Rho相關(guān)蛋白激酶1（ROCK1）、磷酸化腫瘤抑制基因（p-PTEN）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）及磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量、TA蛋白合成代謝能力以及PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），TA橫截面積顯著減?。≒<0.05），TA蛋白分解代謝能力、Bax/Bcl-2比值、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平和Atrogin-1、MuRF-1、ROCK1、p-PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠上述指標(biāo)均顯著改善（P<0.05）。結(jié)論：四君子湯能夠增加CKD-PEW模型小鼠體質(zhì)量，抑制其骨骼肌萎縮;其機(jī)制可能與調(diào)控ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路，抑制Atrogin-1和MuRF-1表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 四君子湯;慢性腎臟病;蛋白質(zhì)能量消耗;Rho相關(guān)蛋白激酶1;磷酸化腫瘤抑制基因;磷脂酰肌醇-3-激酶;蛋白激酶B;小鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the improvement effects of Sijunzi decoction on skeletal muscle atrophy in chronic kidney disease-protein energy wasting （CKD-PEW） model mice， and to explore its potential mechanism. METHODS： A total of 80 mice were randomly divided into sham operation group （n=10） and modeling group （n=70）. CKD-PEW model was established by removing 5/6 kidneys and giving a low-protein diet （4% casein） for mice in modeling group. Totally 50 modeled mice were randomly divided into model group， Sijunzi decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups [2.34， 4.68， 9.36 g/（kg·d），by crude drug]， Compound α-ketoacid tablets group [positive control， 1 g/（kg·d）]， with 10 mice in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically; sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 14 d. After last medication， body weight of mice and wet mass of left tibialis anterior muscle （TA） were weighed; TA cross-sectional area was determined; protein synthesis and decomposition metabolism ability of TA were detected; mRNA expressions of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in TA were detected by Real-time PCR; protein expressions of muscular dystrophin Fbox-1 （Atrogin-1）， myofloin-1 （MuRF-1）， Rho-related protein kinase 1 （ROCK1）， phosphorylated PTEN （p-PTEN）， phosphatidylinositol-3-kinase （PI3K） and phosphorylated Akt （p-Akt） in TA were detected by Western blotting. RESULTS： Compared with the sham operation group， the body weight， TA wet weight， protein synthesis metabolism ability of TA as well as protein expressions of PI3K and p-Akt were decreased significantly in model group （P<0.05）; the cross-sectional area of TA decreased significantly （P<0.05）; protein decomposition metabolism ability of TA， Bax/Bcl-2 ratio， Caspase-3 mRNA expression， protein expressions of Atrogin-1， MuRF-1， ROCK1 and p-PTEN were increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， above indexes of mice were all improved significantly in Sijunzi decoction medium-dose， high-dose groups and Compound α-ketoacid tablets group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Sijunzi decoction can increase the body weight of CKD-PEW model mice and alleviate the skeletal atrophy; the mechanism may be related to regulating ROCK1/PTEN/Akt signaling pathway activity， inhibiting the expression of Atrogin-1 and MuRF-1.

KEYWORDS ? Sijunzi decoction; Chronic kidney disease; Protein energy wasting; Rho-related protein kinase 1; PTEN; Phosphatidylinositol-3-kinase; Akt; Mice

慢性腎臟?。–hronic kidney disease，CKD）是一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問題，其發(fā)病率逐年增高，且有年輕化的趨勢(shì)[1]。CKD常伴有多種代謝性紊亂，其中將近50%的患者會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良，導(dǎo)致蛋白質(zhì)能量消耗（Protein energy wasting，PEW），主要表現(xiàn)為肌肉萎縮、體質(zhì)量下降、血清白蛋白水平降低等，這不僅影響了患者的生存質(zhì)量、降低了其治療耐受性，而且還是造成CKD患者死亡的主要誘因之一[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CKD歸屬“水腫”“慢腎風(fēng)”“尿血”“腰痛”等范疇，病機(jī)主要與脾、腎、肺有關(guān)[3]。有研究認(rèn)為，CKD以脾、腎虧虛為主，脾虛導(dǎo)致陽氣不升、谷氣下流，因此CKD的中醫(yī)治療多以健脾為主[4]。

四君子湯是益氣健脾的代表方劑，出自《太平惠民和劑局方》，由人參、茯苓、白術(shù)和甘草4味中藥組成。本課題組前期將四君子湯應(yīng)用于脾腎兩虛型CKD患者的治療，發(fā)現(xiàn)其可明顯改善CKD患者PEW狀態(tài)[5]，但是其作用機(jī)制尚未闡明。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Rho相關(guān)蛋白激酶1（ROCK1）/人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)CKD-PEW模型骨骼肌發(fā)育與蛋白質(zhì)代謝的能力，其主要組成蛋白R(shí)OCK1、PTEN、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）及Akt的活性變化對(duì)CKD-PEW疾病進(jìn)展具有重要影響，是CKD患者PEW狀態(tài)的潛在干預(yù)靶點(diǎn)[6-7]。鑒于此，本課題組擬通過研究四君子湯對(duì)CKD-PEW模型小鼠骨骼肌ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路及其下游蛋白的影響，探討其改善CKD相關(guān)PEW的可能作用機(jī)制，為四君子湯用于CKD-PEW患者的治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Triathler型液體閃爍及發(fā)光測(cè)定儀（京樂自然基因生命科學(xué)有限公司）;Ti-S型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）;7500型實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)ABI公司）;Mini-Sub Cell GT Cell型電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

四君子湯（由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，批號(hào)：201801014，規(guī)格：每1 mL含生藥量為0.5 g）;復(fù)方α-酮酸片（北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：U1430，規(guī)格：0.63 g/片）;酪蛋白（廣東捷倍斯生物科技公司，批號(hào)：201803214）;Masson染色試劑盒（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20190623）;B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）引物購于上海生工生物技術(shù)有限公司;HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mix（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：201712135-01、201801012-03）;兔源肌萎縮蛋白Fbox-1（Atrogin-1）、肌環(huán)指蛋白1（MuRF-1）、ROCK1、PTEN、磷酸化PTEN（p-PTEN）、PI3K、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、β-actin抗體（美國(guó)CST公司，批號(hào)：CST4041T、CST6367T、CST4035T、CST9188S、CST9551S、CST4249S、CST582- 95S、CST9614S、CST4970S）;總蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：121017200621、0106201700628）;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2018001005）;酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：209-113-1，純度：99%）;14+C-苯丙氨酸（中國(guó)原子能科學(xué)研究院）;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002]。小鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室[恒溫（22±4） ℃、恒濕（60±5）%、明暗時(shí)間各12 h]，自由飲食。本研究實(shí)驗(yàn)方案得到了遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 造模

采用切除5/6腎聯(lián)合低蛋白飲食法建立CKD-PEW模型。利用3.5%水合氯醛麻醉小鼠后，將其背部左側(cè)毛發(fā)剃除，用碘伏進(jìn)行消毒處理。用干凈紗布將剃毛處四周遮住，露出手術(shù)區(qū)域，并用剪刀剪開一個(gè)小口，逐層剝離，暴露腎臟，擠出左側(cè)腎臟并剝離腎臟兩極組織，分離腎蒂周圍及結(jié)締組織，完全游離左腎;從上至腎門約0.4 cm、下至腎門約0.4 cm預(yù)置縫合線，勒緊縫合線并切除兩極腎臟組織;7 d后暴露右側(cè)腎臟，止血鉗夾緊腎門處并緊靠血管夾下方放置縫合線，在血管夾上方切除腎臟，縫合并消毒手術(shù)切口，以復(fù)制CKD模型。假手術(shù)組小鼠同期進(jìn)行手術(shù)，僅剝離腎包膜，不切除腎組織。術(shù)后，用棉簽壓迫法止血，縫合傷口并涂上碘伏消毒，將小鼠放入鼠籠飼養(yǎng)。手術(shù)1周后對(duì)CKD造模小鼠分別給予4%酪蛋白飲食飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，以建立CKD-PEW模型;假手術(shù)組給予正常飲食。通過比較各組小鼠體質(zhì)量、肌酐、尿素氮、白蛋白及24 h尿蛋白水平判斷模型制備是否成功[8]。

2.2 分組與給藥

將80只小鼠分為假手術(shù)組（n=10）和造模組（n=70），分別按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行假手術(shù)或者CKD-PEW造模。將造模成功的50只小鼠隨機(jī)分為模型組，四君子湯低、中、高劑量組[2.34、4.68、9.36 g/（kg·d），以生藥量計(jì);根據(jù)成人（60 kg）臨床等效劑量的1、2、4倍換算]和復(fù)方α-酮酸片組[陽性對(duì)照，1 g/（kg·d）;根據(jù)成人（60 kg）臨床等效劑量換算]，每組10只。小鼠灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d;假手術(shù)組和模型組小鼠同法灌胃等體積生理鹽水。

2.3 樣本采集及處理

在末次給藥1 h后，稱定小鼠體質(zhì)量;然后利用3.5%水合氯醛麻醉小鼠后，剪開小鼠皮膚，迅速分離出完整的左側(cè)脛骨前?。═ibialis anterior，TA），稱量并記錄TA濕質(zhì)量。將一半TA樣本量（n=5）用4%多聚甲醛固定，用于測(cè)量TA橫截面積。另一半TA樣本量（n=5）取部分新鮮組織立即用于蛋白合成和分解代謝檢測(cè);剩余組織置于-80 ℃冰箱中保存，用于凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)和Atrogin-1、MuRF-1及ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)。

2.4 TA橫截面積測(cè)定

取出4%多聚甲醛固定的TA，流水沖洗數(shù)小時(shí)后，分別經(jīng)70%、80%、90%、100%乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明15 min，再放入石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分別浸蠟60 min，并進(jìn)行連續(xù)切片（5 μm）。切片脫蠟水化，Weigert鐵蘇木素染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化5～15 s，流水洗3 min;Masson藍(lán)化液返藍(lán)3～5 min，流水洗3 min;水洗1 min，麗春紅酸性品紅染色液染色5～10 min;弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min，弱酸工作液洗1 min，放入苯胺藍(lán)染色液中染色1～2 min;弱酸工作液洗1 min，95%乙醇快速脫水，無水乙醇分別脫水10 s×3次，二甲苯透明5 min×3次，中性樹膠封片。將切片置于倒置顯微鏡下觀察，并利用Image pro plus 6.0軟件計(jì)算TA橫截面積。

2.5 TA蛋白合成代謝能力檢測(cè)

將新鮮的TA置于DMEM培養(yǎng)基（5 mL）中，37 ℃下充氧孵育30 min，然后在含放射性同位素14+C-苯丙氨酸的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育1 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5 min×3次，隨后制備50% TA勻漿液，加入10%三氨乙酸（TCA）沉淀蛋白質(zhì);吸棄上清，加入0.5 mol/L NaOH溶液溶解沉淀的蛋白。取1.8 mL該蛋白溶液加入閃爍液進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)，取0.2 mL該蛋白溶液利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，檢測(cè)單位時(shí)間內(nèi)（1 h）摻入的14+C-苯丙氨酸的放射性含量，分析蛋白合成代謝能力[8]。

2.6 TA蛋白分解代謝能力檢測(cè)

將新鮮的TA置于KRB緩沖液中，37 ℃下充氧孵育2 h，取該孵育液用10%TCA沉淀，取上清0.5 mL與1.0 mL 5%TCA混合均勻，依次加入0.75 mL硝酸、0.75 mL一氧化二氮，混合均勻，55 ℃下孵育30 min;隨后加入2 mL雙氯乙烯萃取，吸取上清液200 μL至96孔板中，利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值，根據(jù)前期繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線[以不同濃度（0～1 nmol/L）酪氨酸為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)]，計(jì)算TA蛋白分解代謝能力[8]。

2.7 TA中凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量-PCR法檢測(cè)TA中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。采用Trizol法提取小鼠TA中總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，然后以cDNA為模板采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共 20 μL）：cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2×Top Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法測(cè)定目的基因mRNA的表達(dá)水平（式中Ct表示目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），并計(jì)算Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的比值（Bax/Bcl-2）。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

2.8 TA中Atrogin-1、MuRF-1及ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blotting法進(jìn)行檢測(cè)。利用總蛋白提取試劑盒提取小鼠TA中總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，進(jìn)行蛋白變性，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳（100 V、1.5 h），濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（250 mA 、90 min）;TBST緩沖液洗膜5 min×3次，5%脫脂牛奶封閉1 h;分別加入Atrogin-1、MuRF-1、ROCK1、PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、p-Akt及β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;次日，TBST緩沖液洗膜5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫孵育1 h;經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光顯色后，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Image J 1.8.0軟件對(duì)圖像光密度進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶的光密度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，以p-PTEN/PTEN、p-Akt/Akt的光密度比值表示PTEN、Akt蛋白的磷酸化水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠體質(zhì)量和TA濕質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量均顯著升高（P<0.05），且均顯著高于四君子湯低劑量組（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量測(cè)定結(jié)果見表2。

3.2 小鼠TA橫截面積測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA明顯萎縮，肌纖維變細(xì)，橫截面積顯著減小（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA肌纖維變粗，橫截面積顯著增大（P<0.05），且四君子湯高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA橫截面積顯著大于四君子湯低劑量組（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠TA橫截面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠的TA橫截面顯微圖見圖1，橫截面積測(cè)定結(jié)果見表3。

3.3 小鼠TA蛋白合成與分解代謝能力測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA單位時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝能力顯著減弱、分解代謝能力顯著增強(qiáng)（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA單位時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝能力顯著增強(qiáng)、分解代謝顯著減弱（P<0.05）;與四君子湯低劑量組比較，四君子湯高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠單位時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝能力顯著增強(qiáng)、分解代謝顯著減弱（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠TA單位時(shí)間內(nèi)蛋白合成與分解代謝能力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠單位時(shí)間內(nèi)蛋白合成與分解代謝能力測(cè)定結(jié)果見表4。

3.4 小鼠TA中凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與四君子湯低劑量組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表5。

3.5 小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與四君子湯低劑量組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸組之間小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)電泳圖見圖2，蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表6。

3.6 小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA中ROCK1蛋白表達(dá)水平、p-PTEN/PTEN比值顯著升高（P<0.05），PI3K蛋白表達(dá)水平、p-Akt/Akt比值顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中ROCK1蛋白表達(dá)水平、p-PTEN/PTEN 比值顯著降低（P<0.05），PI3K蛋白表達(dá)水平、p-Akt/Akt比值顯著升高（P<0.05）;與四君子湯低劑量組比較，四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中ROCK1蛋白表達(dá)水平、p-PTEN/PTEN 比值顯著降低（P<0.05），PI3K蛋白表達(dá)水平、p-Akt/Akt比值顯著升高（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠TA中上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖見圖3，蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表7。

4 討論

肌肉萎縮是伴隨著CKD的治療同步發(fā)生的一種并發(fā)癥。有研究表明，超過半數(shù)的血液透析CKD患者存在PEW狀態(tài)[9]。而肌肉萎縮是CKD患者PEW的主要表現(xiàn)形式，也可作為預(yù)測(cè)CKD患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。CKD-PEW患者大多會(huì)缺乏必需氨基酸，復(fù)方α-酮酸片不僅可以直接補(bǔ)充必需氨基酸，并且可與體內(nèi)的氨基結(jié)合生成必需氨基酸，使體內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝增加，改善營(yíng)養(yǎng)狀況[10]，故本研究選用復(fù)方α-酮酸片作為陽性對(duì)照藥。四君子湯具有補(bǔ)氣、益氣健脾之功效，杜紅蓮等[11]的研究結(jié)果證實(shí)了四君子湯能夠改善脾腎兩虛型CKD患者的腎功能。為了探討四君子湯對(duì)CKD患者PEW的作用，本課題組通過5/6腎切除法構(gòu)建CKD小鼠模型，同時(shí)根據(jù)CKD患者PEW的臨床特點(diǎn)，給予4%酪蛋白飲食建立了CKD-PEW小鼠模型[12]。結(jié)果顯示，四君子湯給藥14 d后，CKD-PEW模型小鼠體質(zhì)量和TA濕質(zhì)量減輕、TA橫截面積減小的情況有不同程度改善，且四君子湯還能夠升高模型小鼠TA蛋白合成代謝、降低其蛋白分解代謝，這說明四君子湯對(duì)CKD-PEW模型小鼠的骨骼肌萎縮具有一定的緩解作用。

CKD-PEW引起的代謝性酸中毒、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、血管緊張素Ⅱ分泌增多等因素均可激活 Caspase-3 及泛素蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin proteasome system，UPS），導(dǎo)致肌肉萎縮[13]。有研究表明，在CKD-PEW模型大鼠中骨骼肌嚴(yán)重萎縮，同時(shí)肌纖維中促凋亡基因Bax、Caspase-3表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，說明線粒體凋亡途徑在骨骼肌蛋白能量消耗過程中具有重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，給予四君子湯治療14 d后，CKD-PEW模型小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低，說明四君子湯可抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡，從而緩解肌肉萎縮。在CKD中，P13K/Akt信號(hào)通路受損是引起骨骼肌蛋白質(zhì)丟失的主要原因。該信號(hào)通路受損后繼發(fā)UPS激活，繼而引起Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)升高，這是骨骼肌萎縮的經(jīng)典機(jī)制[15-16]。因此，骨骼肌組織中的Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)量可作為衡量肌肉蛋白質(zhì)分解代謝情況的生物學(xué)標(biāo)志[17]。本研究結(jié)果顯示，四君子湯治療14 d后，CKD-PEW模型小鼠TA中Atrogin-1和MuRF-1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，說明四君子湯可通過抑制UPS的激活來減輕CKD-PEW小鼠的骨骼肌萎縮。

Caspase-3也是參與蛋白降解的蛋白酶，可切割肌球蛋白和肌原纖維蛋白，并切割特定的19S蛋白酶體亞基，加速26S蛋白酶體的降解，而且Caspase-3能夠切除ROCK1 的C端半胱氨酸結(jié)構(gòu)域而使其活化[18]。活化的ROCK1能夠增強(qiáng)PTEN磷酸化，而活化的PTEN又可抑制PI3K/Akt的活性，從而促進(jìn)蛋白降解，引起肌肉萎縮[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，敲低ROCK1水平可抑制PTEN活性，從而負(fù)調(diào)控PI3K與p-Akt蛋白的表達(dá)，并通過下調(diào)Atrogin-1和MuRF-1表達(dá)來調(diào)控肌肉蛋白質(zhì)代謝[20]。另有研究運(yùn)用 ROCK1的抑制劑法舒地爾干預(yù)CKD模型小鼠后發(fā)現(xiàn)，法舒地爾可使CKD模型小鼠的肌肉質(zhì)量顯著提升、體質(zhì)量顯著增長(zhǎng)，故推測(cè)其是通過抑制ROCK1來降低PTEN活性、激活A(yù)kt來降低Atrogin-1 和 MuRF-1 表達(dá)，從而抑制蛋白質(zhì)分解代謝、延緩肌肉萎縮[21]。可見，ROCK1/PTEN/Akt途徑在骨骼肌萎縮的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯治療14 d后，CKD-PEW模型小鼠TA中ROCK1、p-PTEN蛋白表達(dá)水平顯著降低，而PI3K與p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著升高，說明四君子湯也可通過調(diào)控ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路，抑制Atrogin-1和 MuRF-1表達(dá)，來改善CKD-PEW模型小鼠的骨骼肌萎縮。

綜上所述，四君子湯可增加CKD-PEW模型小鼠體質(zhì)量，抑制骨骼肌萎縮，這可能是通過調(diào)控ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路、抑制Atrogin-1和 MuRF-1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但本研究只是初步探討了四君子湯改善CKD-PEW模型小鼠骨骼肌萎縮的作用機(jī)制，具體分子學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-05-30 修回日期：2020-08-09）

（編輯：林 靜）