• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大鯢MC1R基因的克隆、序列分析與表達(dá)研究

    2020-10-30 10:01:21鄧捷衛(wèi)小燕張晗馬紅英王啟軍趙虎張紅星姜維
    河北漁業(yè) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:黑化體色大鯢

    鄧捷 衛(wèi)小燕 張晗 馬紅英 王啟軍 趙虎 張紅星 姜維

    摘 要:為研究MC1R在兩棲動物體色形成中的作用,試驗結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和電子克隆技術(shù)得到大鯢(Andrias davidianus)MC1R部分cDNA序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,采用實時熒光定量法檢測了大鯢MC1R基因在皮膚、肝臟等10個組織中的表達(dá)情況及4種不同體色大鯢皮膚組織中MC1R基因的表達(dá)量。結(jié)果表明:得到大鯢MC1R部分cDNA長為295 bp,位于該基因編碼區(qū)。其與人、小鼠等哺乳動物和鳥類MC1R核苷酸同源性在57%~83%。大鯢MC1R基因與粗皮漬螈的親緣關(guān)系最近。該基因在不同組織中均有表達(dá),以皮膚組織表達(dá)量最高。4種不同體色大鯢皮膚組織中,黑色皮膚中MC1R基因表達(dá)量高于其他體色。說明大鯢MC1R基因在體色形成過程中可能具有與其他兩棲動物不同的調(diào)控機制。

    關(guān)鍵詞:大鯢(Andrias davidianus);體色;黑色素;黑皮質(zhì)素受體-1(Melanocortin-1 receptor,MC1R)基因;表達(dá)

    中圖分類號:Q959.9;Q78

    兩棲類動物體表表現(xiàn)出獨特的色彩類型和著色模式,是物種進(jìn)化和表觀遺傳學(xué)研究的熱點問題。兩棲動物體色與其真皮層中的三類色素細(xì)胞相關(guān):載黑素細(xì)胞(melanophores)合成和運輸黑色素,產(chǎn)生了褐色-黑色體色[1],載虹素細(xì)胞(iridophores)對光線的反射和散射作用,產(chǎn)生了藍(lán)-綠色體色[2];載黃素細(xì)胞(xanthophores)含有蝶啶或類胡蘿卜素,產(chǎn)生了黃色的體色。

    目前,有關(guān)哺乳動物、鳥類和魚類體色形成的分子遺傳機制的研究較多,揭示了圍繞黑色素細(xì)胞進(jìn)行的黑色素合成與運輸相關(guān)分子調(diào)控系統(tǒng)。兩棲類動物具有獨特的體色類型,以往的研究從生理學(xué)和行為學(xué)上對其體色形成模式進(jìn)行闡述和分析[3-5],有關(guān)其體色性狀下潛在的分子遺傳特征的報道較少[6]。黑皮質(zhì)素受體-1(Melanocortin-1 receptor,MC1R)是動物黑色素合成通路中的限速酶,在載黑素細(xì)胞合成黑色素轉(zhuǎn)為合成褐色素過程中起著類似于“開關(guān)”的作用[7]。哺乳動物、鳥類、爬行動物MC1R基因突變會引起動物體色(毛色)白化、黃化或者黑化[8-10]。Herczeg等研究成果顯示MC1R基因的核苷酸突變與歐洲普通青蛙(Rana temporaria)體色的黑化程度不存在相關(guān)性[11],但歐洲普通青蛙(Rana temporaria)17個地理種群間MC1R基因的多態(tài)性存在差異[12]。中國大鯢(Andrias davidianus)是現(xiàn)存體型最大的兩棲動物,在其漫長的進(jìn)化過程中形成了豐富的體色。野生型的大鯢體色為不同深淺的棕-黑色,白化和黑化是兩種比較常見的體色變異類型[13]。黑色素合成通路十分保守,因此推測黑皮質(zhì)素受體-1MC1R)基因及其多態(tài)性可能與中國大鯢不同體色的表型相關(guān)。

    本研究采集了自然色大鯢、白化個體、黑化個體(見封三圖1)皮膚組織樣,克隆了大鯢MC1R基因部分序列,采用qRT-PCR方法檢測并分析其在大鯢10個組織和器官中表達(dá)分布和其在上述三種體色個體皮膚組織中表達(dá)情況,總結(jié)了大鯢MC1R基因表達(dá)譜差異,探討了該基因與大鯢體色白化與黑化之間的關(guān)系,初步闡述了大鯢體色形成的分子基礎(chǔ),為兩棲動物體色遺傳機制研究提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    實驗大鯢個體來自漢中古生大鯢有限公司,具有漁業(yè)行政主管部門頒發(fā)的水生野生動物經(jīng)營利用許可證((漢)水野經(jīng)字(2015)23號))。

    1.2 主要試劑

    Trizol Reagent,購自美國Invitrogen公司;Rnase-free DnaⅠ,購自大連寶生物公司;RevertAid cDNA Synthesize Kit,購自加拿大Fermentas公司;FastStart SYBR Green qPCR Master Mix,購自德國Roche公司。

    1.3 主要儀器

    液氮生物容器,購自四川金鳳;臺式超速低溫離心機,購自德國Eppendorf公司;去離子水超純水系統(tǒng)及恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng),購自美國Thermo公司;紫外分光光度計,購自德國Beckman公司;實時熒光定量PCR儀及凝膠成像系統(tǒng),購自美國Bio-Rad公司。

    2 方法

    2.1 實驗動物分組

    選取3尾大鯢,取其皮膚、肌肉等10個組織,具體采集的組織部位和方法同姜維等[13]所述。

    2.2 RNA提取

    取0.2 g不同組織樣本,于研磨器中低溫研磨至勻漿后,利用Trizol法提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取效果,紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。

    2.3 反轉(zhuǎn)錄

    利用RevertAid cDNA Synthesize Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗,反應(yīng)體系:總體積20 μL,其中RNA模板 2 μg,oligoDT 1 μL,5×buffer 2 μL,RNase抑制劑1 μL,10 mM dNTP mix 1 μL,反轉(zhuǎn)錄酶1 μL,加DEPC水至20 μL。反應(yīng)條件:42 ℃,60 min;70 ℃,2 min。-20 ℃保存產(chǎn)物,備用。

    2.4 MC1R基因擴(kuò)增及熒光定量PCR引物設(shè)計與合成

    以前期實驗獲得的大鯢皮膚組織轉(zhuǎn)錄組文庫中MC1R基因序列為參照,使用PrimerQuest(http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/IndexPrimer)設(shè)計MC1R基因熒光定量PCR引物,引物詳情見表1。

    2.5 MC1R基因序列分析

    通過CAP3(http://biosrv.cab.unina.it/webcap3/)軟件完成大鯢MC1R基因序列拼接;FeatureMap3D (http://www.cbs.dtu.dk/services/FeatureMap3D/)及SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白高級結(jié)構(gòu)域分析;利用ClustalW等將大鯢MC1R基因核苷酸序列與GenBank中的其他物種序列進(jìn)行同源比對。

    2.6 qRT-PCR分析大鯢MC1R和MITF基因的組織特異性表達(dá)

    采集大鯢肌肉、皮膚、心、肝、脾、肺、胃、胰臟、生殖腺(卵巢/精巢)、腸道組織等不同來源組織cDNA為模板,使用前期設(shè)計的熒光定量PCR引物,進(jìn)行大鯢MC1R基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為20 μL,其中cDNA 1 μL,10 nmol/μL? dNTP 1 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.75 μL,F(xiàn)astStart SYBR Green qPCR Master Mix (德國Roche) 14.5 μL。反應(yīng)條件:94 ℃,1 min;40個循環(huán)(94 ℃,18 s;62 ℃,18 s;72 ℃,20 s;),85 ℃ 讀板。GAPDH作為內(nèi)參基因,同時以未加模板的反應(yīng)孔作為空白對照,每個反應(yīng)重復(fù)三次。利用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計,分別以MC1R/MITF基因的Ct值減掉相應(yīng)GAPDH的Ct值,得出MC1R/MITF基因的ΔCt,使用Power(2,-ΔΔCt)公式計算MC1R/MITF基因的相對表達(dá)量。

    2.7 qRT-PCR分析不同體色大鯢MC1R基因的特異性表達(dá)

    以WT、am、aa、ma等4種差異顯著體色大鯢皮膚組織cDNA為模板,利用熒光定量PCR引物,進(jìn)行MC1R基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及條件等同2.6。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 RNA提取效果檢測

    組織樣總RNA電泳效果見圖2,結(jié)果顯示28 S條帶亮度是18 S的2倍左右,說明提取的總RNA完整性和濃度較好,可用于后續(xù)實驗。

    3.2 MC1R和MITF基因的電子克隆及序列分析

    大鯢皮膚組織轉(zhuǎn)錄組文庫中的ESTs經(jīng)拼接后得到大鯢MC1R基因cDNA長為295 bp,位于該基因編碼區(qū)(圖3)。

    3.3 MC1R基因核苷酸同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

    使用BioEdit軟件的ClustalW程序?qū)Υ篥FMC1R基因與其他物種的核苷酸序列相似性進(jìn)行多重比對(圖4),結(jié)果顯示,大鯢與粗皮漬螈(T.granulosa)相似性最高,為83.33%,與西部錦龜(C.picta bellii)的序列相似性在80.14%,與其他脊椎動物的序列同源性介于57%~79.18%之間。采用NJ法構(gòu)建蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),結(jié)果顯示:大鯢與粗皮漬螈進(jìn)化關(guān)系最近,能夠聚為一支。

    3.4 大鯢MC1R基因組織表達(dá)譜差異

    實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,大鯢MC1R基因在實驗個體的所有組織中均有表達(dá),其中在皮膚組織中mRNA的表達(dá)量最高,其次為胰腺、胃、肺、肝臟、腸、脾臟、性腺組織等,在心臟和肌肉組織中表達(dá)量最低(圖6)。同時發(fā)現(xiàn)MC1R基因在不同體色個體的皮膚組織中均有表達(dá)(圖7),其中在尾部皮膚為黑色(am型)中mRNA的表達(dá)量最高,其次為黃色皮膚組織(aa型)和黑色皮膚上散布白斑(ma型)的個體,野生型(WT型)個體皮膚組織中MC1R基因的表達(dá)量最低。

    4 討論

    大鯢是我國的特有的二級保護(hù)動物,以往有關(guān)大鯢生物學(xué)特征和資源保護(hù)方面的研究較多,分子遺傳學(xué)方面的研究較少[14]。候選基因法是目前比較常用的功能基因的研究方法,由于大鯢及其近緣物種的基因組數(shù)據(jù)比較缺乏,沒有體色方面的候選基因信息,因此本研究采用了轉(zhuǎn)錄組測序的方法,通過構(gòu)建和分析大鯢皮膚組織轉(zhuǎn)錄組文庫中MC1R基因的contigs,得到大鯢MC1R基因長295 bp的核苷酸序列。該序列位于基因的編碼區(qū),其與人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)等哺乳動物和鳥類的MC1R 同源性在57%~83%,表明MC1R 基因在不同物種間較為保守。

    本實驗中MC1R 基因mRNA在大鯢的皮膚、胰腺、胃、肺、肝臟、腸、脾臟、生殖腺(卵巢/精巢)、心臟、肌肉中均有表達(dá),其中皮膚組織中的表達(dá)量為最高,這與其他物種略有差別。哺乳動物的MC1R 基因主要在毛囊和皮膚黑素細(xì)胞中表達(dá)[15]。綿羊MC1R基因主要表達(dá)部位為毛囊的基質(zhì)、根鞘等區(qū)[16]。新月魚(X.maculatus) 的MC1R基因在腦、眼、鰓、皮膚、睪丸、肌肉和肝臟都有表達(dá),與青鳉(O.latipes) 的MC1R基因的表達(dá)模式相似[17]。橘色雙冠麗魚MC1R 基因在成熟魚體的鱗片、性腺、肌肉、尾鰭、心、腎、眼、腦、皮膚、鰓、鰾等11種組織中均有表達(dá)[18]。研究表明,MC1R在不同物種中其組織表達(dá)模式存在較大差異性。

    大鯢的基本體色為不同深淺的棕-黑,黑化是比較常見的體色變異類型。在本實驗中,大約1/3的大鯢皮膚出現(xiàn)黑化。哺乳動物、鳥類、爬行動物MC1R基因發(fā)生突變時,MC1R表達(dá)量上升,細(xì)胞內(nèi)大量合成黑色素,使得動物毛色黑化[19-20]。而MC1R基因突變與蜥蜴(L.occipitalis ,L.arambarensis)、歐洲蛙(R.temporaria)體表顏色的加深沒有直接的關(guān)系[11,21]。在本研究中,大鯢MC1R基因mRNA在am (背部為黃色,尾部為黑色)和ma (背部和尾部主色為黑色,隨機散布白斑)黑化型個體中的表達(dá)量均高于野生型(深棕色-深灰色),說明大鯢體色黑化可能與MC1R基因的表達(dá)量升高有關(guān)。

    白化癥是動物毛色(體色)變化中比較常見的變異類型。研究發(fā)現(xiàn),多種蜥蜴(A.inornata,S.undulates,L.lepida)MC1R基因的堿基替代,導(dǎo)致其編碼的MC1R蛋白喪失部分功能,使得蜥蜴背部出現(xiàn)白斑[22-24]。本實驗表明,大鯢MC1R基因mRNA在黃色個體皮膚組織中的表達(dá)量較野生型相對較高,但差異不顯著,說明MC1R基因的表達(dá)量與大鯢個體體色的白化不存在顯著相關(guān)性。Woodcock等[25]研究發(fā)現(xiàn)edn3基因突變和tyr基因142 bp的核苷酸缺失與美西鈍口螈A.mexicanum個體的白化病存在相關(guān)性。鑒于MC1R基因是調(diào)控黑色素合成的眾多基因之一,大鯢個體體色的白化是否與其下游基因,例如tyr等基因相關(guān),還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

    參考文獻(xiàn):

    [1] DUELLMAN W E,TRUEB L.Biology of amphibians[M].New York:McGraw-Hill Book Co.1986.

    [2] SAENKO S V J,TEYSSIER D,VAN DER M,et al.Precise colocalization of interacting structural and pigmentary elements generates extensive color pattern variation in Phelsuma lizards[J].BMC Biol,2013(11):105.

    [3] BAGNARA J T,HADLEY M E.The control of bright colored pigment cells of fishes and amphibians[J].Am Zool,1969,9 (2):465-478.

    [4] BEUKEMA W,NICIEZA A G,LOURENO A,et al.Colour polymorphism in Salamandra salamandra (Amphibia:Urodela),revealed by a lack of genetic and environmental differentiation between distinct phenotypes[J].Journal of Zoological Systematics & Evolutionary Research,2016,54 (2):127-136.

    [5] KINDERMANN C,HERO J M.Pigment cell distribution in a rapid colour changing amphibian (Litoria wilcoxii)[J].Zoomorphology,2016,135 (2):1-7. Kindermann C , Hero J M . Pigment cell distribution in a rapid colour changing amphibian (Litoria wilcoxii)[J]. Zoomorphology, 2016, 135(2):197-203.

    [6] STUCKERT A M M,MOORE E,COYLE K P,et al.Variation in pigmentation gene expression is associated with distinct aposematic color morphs in the poison frog Dendrobates auratus[J].BMC Evolutionary Biology,2019,19(1):85.

    [7] WOLF H E M,BOULANGER M C,DORAZIO J A.Melanocortin 1 receptor:structure,function,and regulation[J].Frontiers in Genetics,2016(7):95.

    [8] EIZRIK E,YUHKI N,JOHNSON W E,et al.Molecular genetics and evolution of melanism in the cat family[J].Current Biology,2003,13(5):448-453.

    [9] NADEAU N J,MINVIELLE F,MUNDY N I.Association of a Glu92Lys substitution in MC1R with extended brown in Japanese quail (Coturnix japonica)[J].Animal Genetics,2006, 37(3):287-289.

    [10] NUNES V L,MARILDO A,BEAUMONT M A,et al.Association of MC1R variants with ecologically relevant phenotypes in the European ocellated lizard,Lacerta lepida[J].Journal of Evolutionary Biology,2011,24(8):2289-2298.

    [11] HERCZEG G,MATSUBA C,MERIL J.Sequence variation in the melanocortin-1 receptor gene MC1R) does not explain variation in the degree of melanism in a widespread amphibian[J].Annales Zoologici Fennici,2010,47(1):37-45.

    [12] MATSUBA C.Geographic variations of melanocortine 1 receptor gene MC1R) in the common frog (Rana temporaria) in Northern Europe[J].Amphibia-Reptilia,2012,33(1):105-111.

    [13] 姜維,鄧捷,王啟軍,等.大鯢Agouti基因的克隆、表達(dá)及多態(tài)性分析[J].四川動物,2019,38(2):121-129.

    [14] 何青,劉靜,劉麗麗,等.中國大鯢Sox2基因全長cDNA 序列的克隆及組織表達(dá)分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2018,37(3):1137-1144.

    [15] MOUNTJOY K G,ROBBINS L S,MORTRUD M T,et al.The cloning of a family of genes that encode the melanocortin receptors[J].Science,1992,257(5074),1248-1251.

    [16] 王海東,李亞楠,陳天直,等.不同毛色綿羊皮膚中 MC1R 的差異表達(dá)及定位[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2016,35 (10):2614-2620.

    [17] SELZ Y, BRAASCH I, HOFFMANN C,et al.Evolution of melanocortin receptors in teleost fish:The melanocortin type 1 receptor[J].Gene,2007,401(1-2):114-122.

    [18] 周康奇,宋紅梅,潘賢輝,等.橘色雙冠麗魚體色相關(guān)基因 mc1r 的組織表達(dá)分析[J].動物學(xué)雜志,2019,54(1):45-56.

    [19] REES J L. The melanocortin 1 receptor MC1R):more than just red hair[J].Pigment Cell Research 2010, 13(3),135-140.

    [20] MCROBIE H R,KING L M,F(xiàn)ANUTTI C,et al.Melanocortin 1 receptor MC1R) gene sequence variation and melanism in the gray (Sciurus carolinensis),fox (Sciurus niger),and red (Sciurus vulgaris) squirrel[J].Journal of Heredity,2014,105(3):423-428.

    [21] CORSO J,GONALVES G L,F(xiàn)REITAS T RO DE.Sequence variation in the melanocortin-1 receptor MC1R) pigmentation gene and its role in the cryptic coloration of two South American sand lizards[J].Genetics and Molecular Biology,2012,35(1):81-87.

    [22] ROSENBLUM E B,HOEKSTRA H E,NACHMAN M W.Adaptive reptile color variation and the evolution of the Mc1r gene[J].Evolution,2004,58:1794-1808.

    [23] ROSENBLUM E B,ROMPLER H,SCHONEBERG T,et al.Molecular and functional basis of phenotypic convergence in white lizards at White Sands[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(5):2113-2117.

    [24] GARCIA-BORRON J C,SANCHEZ-LAORDEN B L,JIMENEZ-CERVANTES C.Melanocortin-1 receptor structure and functional regulation[J].Pigment Cell Res,2005,18(6):393-410.

    [25] WOODCOCK M R,VAUGHN-WOLFE J,ELIAS A,et al.Identification of mutant genes and introgressed tiger salamander DNA in the laboratory axolotl,Ambystoma mexicanum[J].Scientific Reports,2017,7(1):1-10.

    Cloning and Expression Analysis of MC1R in Different Skin Color Phenotypes in Giant Salamanders (Andrias davidianus)

    DENG Jie1,WEI Xiaoyan2,ZHANG Han1,MA Hongying1,WANG Qijun1,ZHAO Hu1,ZHANG Hongxing1,JIANG Wei1*

    (1.Shaanxi Key Laboratory for Animal Conservation,Shaanxi Institute of Zoology,Xian 710032,China;2.Lishan Animal Husbandry & Veterinary Station, Xian 710600,China)

    Abstract:To investigate the relationship between MC1R gene and skin color formation of amphibians,the giant salamander(Andrias davidianus) MC1R gene were cloned and sequence characteristics were analyzed using bioinformatics tools.Meanwhile,by quantitative real-time PCR (qRT-PCR),expression patterns of MC1R gene in ten different tissues and in four types of skin colorphenotypes were detected.The obtained MC1R cDNA were 295 bp long.Multiple sequence alignment indicated the giant salamander MC1R had a high nucleotides similarity with amphibians and reptiles,and it had low similarity with mammalian and bird.These results were further confirmed by phylogenetic tree analysis.Quantitative analysis showed that MC1R mRNA expressed in all tissues in giant salamander,among which the maximum level expression were founded in skin.Besides,MC1R mRNA displayed a higher expression in the melanic skin than other colour phenotypes.The distinctive sequence characteristics and expression pattern suggested that there might be different regulatory mechanism of MC1R gene in skin color formation in giant salamander compare with other species.

    Key words:giant salamander(Andrias davidianus); body color; melanin; MC1R gene; tissue expression

    (收稿日期:2020-09-02)

    基金項目:陜西省科學(xué)院科技計劃項目“大鯢體色性狀相關(guān)基因克隆表達(dá)、序列特征及SNP分析”(2014K-19);陜西省科學(xué)院重點項目“秦巴山區(qū)大鯢種質(zhì)資源調(diào)查與遺傳多樣性分析”(2015K-03)。

    作者簡介:鄧捷(1986-),女,助理研究員,碩士,研究方向:水生生物保護(hù)與養(yǎng)殖。E-mail:dengjie0311@ms.xab.ac.cn。

    通信作者:姜維(1981-),女,副研究員,博士,研究方向:水生生物保護(hù)與養(yǎng)殖。E-mail:jiangwei197981@163.com。

    猜你喜歡
    黑化體色大鯢
    高黏高彈改性瀝青在城市橋面黑化中的應(yīng)用
    不同體色虎龍雜交斑的生理特性比較
    Discovery of a wild, genetically pure Chinese giant salamander creates new conservation opportunities
    “黑化”的白云
    哈哈畫報(2022年4期)2022-04-19 11:11:50
    我們不是被網(wǎng)絡(luò)黑化的小怪獸
    北京動物園大鯢展示環(huán)境豐容設(shè)計
    黑化處理對2A14鋁合金激光-TIG復(fù)合焊焊縫成形的影響
    蚜蟲的生存適應(yīng)性研究進(jìn)展
    萌物
    飛碟探索(2016年5期)2016-05-10 23:44:30
    幾種不同品系暹羅斗魚體色遺傳規(guī)律的初步研究
    天堂8中文在线网| 精品少妇黑人巨大在线播放| 一区二区三区四区激情视频| 下体分泌物呈黄色| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲第一av免费看| 看免费成人av毛片| 久久99一区二区三区| 电影成人av| 午夜av观看不卡| 中国三级夫妇交换| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一级毛片我不卡| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲国产成人一精品久久久| 最近手机中文字幕大全| 国产亚洲最大av| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲人成77777在线视频| 热re99久久精品国产66热6| 男人爽女人下面视频在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 三上悠亚av全集在线观看| 久久久久久人人人人人| 婷婷色av中文字幕| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 91aial.com中文字幕在线观看| 成人国产av品久久久| 男女下面插进去视频免费观看| 国产 一区精品| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产综合精华液| 亚洲精品国产av成人精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av在线app专区| 久久av网站| 久久人妻熟女aⅴ| 满18在线观看网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 我的亚洲天堂| 男人爽女人下面视频在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品一品国产午夜福利视频| 国产男女超爽视频在线观看| 成人手机av| 成人国语在线视频| 99久久综合免费| 黄色视频在线播放观看不卡| 天天影视国产精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 日韩精品有码人妻一区| 观看美女的网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久热久热在线精品观看| 欧美最新免费一区二区三区| 日韩精品有码人妻一区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 高清黄色对白视频在线免费看| 一本色道久久久久久精品综合| 美国免费a级毛片| 亚洲少妇的诱惑av| 电影成人av| 中文字幕最新亚洲高清| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人一区二区在线| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久97久久精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| videosex国产| 中文字幕色久视频| 少妇 在线观看| 赤兔流量卡办理| 亚洲人成电影观看| 99热网站在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲精品在线美女| 久久精品国产亚洲av涩爱| 在线天堂最新版资源| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲中文av在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美亚洲日本最大视频资源| 18禁观看日本| 欧美成人午夜免费资源| 精品亚洲成a人片在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| h视频一区二区三区| 久热这里只有精品99| 亚洲视频免费观看视频| 伊人亚洲综合成人网| 99久久中文字幕三级久久日本| 91精品国产国语对白视频| 日韩一区二区三区影片| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品av久久久久免费| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产精品一区三区| 一级黄片播放器| 天天影视国产精品| 成人毛片60女人毛片免费| 少妇人妻久久综合中文| 好男人视频免费观看在线| 成人二区视频| 不卡视频在线观看欧美| 欧美日韩视频精品一区| 国产高清国产精品国产三级| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲少妇的诱惑av| 看十八女毛片水多多多| 亚洲欧洲国产日韩| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产一区二区 视频在线| 啦啦啦在线免费观看视频4| 在线免费观看不下载黄p国产| 一级爰片在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本色播在线视频| 国精品久久久久久国模美| 美女视频免费永久观看网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| av在线观看视频网站免费| 大码成人一级视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 成年av动漫网址| 蜜桃在线观看..| 伊人亚洲综合成人网| 精品久久蜜臀av无| 老司机影院成人| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲成人av在线免费| 欧美bdsm另类| 午夜日韩欧美国产| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日韩一区二区视频免费看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品一区二区免费观看| av电影中文网址| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 不卡视频在线观看欧美| 日本wwww免费看| 久久 成人 亚洲| 999精品在线视频| 国产精品不卡视频一区二区| 国产一区二区三区av在线| 9色porny在线观看| 黄色 视频免费看| 久久av网站| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久久久精品精品| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲av电影在线进入| 亚洲欧洲国产日韩| 99久久精品国产国产毛片| 国产野战对白在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美日韩精品网址| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久精品国产自在天天线| 人人澡人人妻人| 三级国产精品片| 另类亚洲欧美激情| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄色毛片三级朝国网站| 丝袜在线中文字幕| 成年人免费黄色播放视频| 男人操女人黄网站| 亚洲国产欧美网| 999久久久国产精品视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品国产乱码久久久久久小说| 啦啦啦在线免费观看视频4| 中文字幕亚洲精品专区| 女性生殖器流出的白浆| 极品人妻少妇av视频| 日韩欧美精品免费久久| 国产亚洲精品第一综合不卡| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 美女主播在线视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产老妇伦熟女老妇高清| 午夜激情久久久久久久| 免费av中文字幕在线| 热re99久久国产66热| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 天天影视国产精品| 成年人免费黄色播放视频| 免费黄频网站在线观看国产| 男人添女人高潮全过程视频| 91成人精品电影| 男人添女人高潮全过程视频| 捣出白浆h1v1| 大话2 男鬼变身卡| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 日本-黄色视频高清免费观看| 中文欧美无线码| 国产 一区精品| 国产亚洲欧美精品永久| 美女福利国产在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一个人免费看片子| 国产精品久久久av美女十八| 丰满乱子伦码专区| 国产成人免费无遮挡视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 在现免费观看毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 超色免费av| 欧美国产精品一级二级三级| 性色avwww在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 黄色一级大片看看| 亚洲精品视频女| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 成人午夜精彩视频在线观看| 一级毛片 在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产男女超爽视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲男人天堂网一区| 一本色道久久久久久精品综合| 人妻系列 视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产精品一区二区在线不卡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲美女黄色视频免费看| 我要看黄色一级片免费的| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久影院123| 午夜福利视频在线观看免费| 99香蕉大伊视频| 欧美日韩精品网址| 精品国产露脸久久av麻豆| 我的亚洲天堂| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 男女边吃奶边做爰视频| 丁香六月天网| 看非洲黑人一级黄片| 97精品久久久久久久久久精品| 在线天堂最新版资源| 亚洲情色 制服丝袜| videos熟女内射| 中文欧美无线码| a级毛片黄视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久久精品94久久精品| 日韩视频在线欧美| 男人操女人黄网站| 久久精品久久久久久久性| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 99久久精品国产国产毛片| 国产欧美亚洲国产| 国产视频首页在线观看| 久热这里只有精品99| 色吧在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 看免费成人av毛片| 国产亚洲最大av| av在线app专区| 欧美最新免费一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免| 国产乱人偷精品视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 电影成人av| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美成人精品欧美一级黄| 色94色欧美一区二区| 99久久中文字幕三级久久日本| 99久久精品国产国产毛片| 精品一区二区三卡| 午夜日本视频在线| 免费av中文字幕在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 赤兔流量卡办理| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站| 91成人精品电影| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 满18在线观看网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 97在线人人人人妻| 成年人免费黄色播放视频| 成人国产av品久久久| 日韩一本色道免费dvd| 国产亚洲最大av| 国产爽快片一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜制服| 一级毛片电影观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产免费福利视频在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 超碰97精品在线观看| 国产欧美亚洲国产| 一级片'在线观看视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产免费福利视频在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 国产乱人偷精品视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久久国产精品人妻一区二区| 天天操日日干夜夜撸| 久久精品国产综合久久久| 大香蕉久久网| 亚洲色图综合在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 观看美女的网站| 亚洲三级黄色毛片| 大码成人一级视频| 欧美在线黄色| av网站在线播放免费| 国产一区有黄有色的免费视频| 美女主播在线视频| 国产一级毛片在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一区在线观看完整版| xxxhd国产人妻xxx| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产探花极品一区二区| 女人精品久久久久毛片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 一区二区三区激情视频| 在线天堂中文资源库| 国产男女内射视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产精品熟女久久久久浪| 成人亚洲精品一区在线观看| 少妇的丰满在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品二区激情视频| 亚洲国产av新网站| 免费黄色在线免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| www.熟女人妻精品国产| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人精品福利久久| 国产精品欧美亚洲77777| 美女视频免费永久观看网站| 久久久亚洲精品成人影院| 黄片播放在线免费| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久人妻熟女aⅴ| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 人妻 亚洲 视频| 亚洲av.av天堂| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 天堂中文最新版在线下载| 国产成人av激情在线播放| 久久久久久久国产电影| 1024视频免费在线观看| 99久久综合免费| 免费看不卡的av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 晚上一个人看的免费电影| 黄色一级大片看看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 天堂俺去俺来也www色官网| 考比视频在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 嫩草影院入口| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| a级毛片黄视频| 免费大片黄手机在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 三级国产精品片| 国产精品一区二区在线观看99| 国产男女内射视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲av福利一区| 久久久精品区二区三区| h视频一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品av麻豆狂野| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产男女内射视频| 久久亚洲国产成人精品v| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产毛片在线视频| 国产成人免费无遮挡视频| 波野结衣二区三区在线| 午夜福利影视在线免费观看| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲三区欧美一区| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美97在线视频| 七月丁香在线播放| 秋霞伦理黄片| 久久午夜综合久久蜜桃| 岛国毛片在线播放| 丰满少妇做爰视频| 国产福利在线免费观看视频| 久久精品夜色国产| 国产精品成人在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 五月伊人婷婷丁香| 99久久人妻综合| 桃花免费在线播放| 成年动漫av网址| 搡老乐熟女国产| 18禁国产床啪视频网站| 国精品久久久久久国模美| 国产高清不卡午夜福利| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 黄片小视频在线播放| 激情五月婷婷亚洲| 国产毛片在线视频| 欧美中文综合在线视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 视频区图区小说| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 久久精品国产亚洲av涩爱| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲经典国产精华液单| 99久久精品国产国产毛片| 一级片免费观看大全| 天堂俺去俺来也www色官网| 只有这里有精品99| 三上悠亚av全集在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久这里只有精品19| 中文字幕制服av| 精品久久久久久电影网| 国产成人精品一,二区| 夫妻午夜视频| 深夜精品福利| videossex国产| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲国产欧美网| 国产成人精品久久久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲av免费高清在线观看| 99国产综合亚洲精品| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 午夜福利视频在线观看免费| 精品一区二区三区四区五区乱码 | av有码第一页| 亚洲成人手机| 老司机影院毛片| 9191精品国产免费久久| 99国产精品免费福利视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品不卡视频一区二区| 一边亲一边摸免费视频| 日韩视频在线欧美| 久久这里只有精品19| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av日韩在线播放| 黄片播放在线免费| 久久毛片免费看一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 999久久久国产精品视频| 成人黄色视频免费在线看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲人成电影观看| 亚洲精品第二区| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产成人精品一,二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品国产av蜜桃| av福利片在线| 三上悠亚av全集在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 另类精品久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 晚上一个人看的免费电影| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久久久久大尺度免费视频| 观看av在线不卡| 成人二区视频| 男女免费视频国产| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 高清不卡的av网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美+日韩+精品| 国产高清国产精品国产三级| 久久久精品免费免费高清| 黑人猛操日本美女一级片| av视频免费观看在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 午夜福利乱码中文字幕| www.精华液| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲精品国产色婷婷电影| kizo精华| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 两个人看的免费小视频| 91精品三级在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 热99国产精品久久久久久7| 大话2 男鬼变身卡| 97人妻天天添夜夜摸| 1024视频免费在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲人成电影观看| 婷婷成人精品国产| 欧美日韩视频精品一区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日本色播在线视频| 久久久久久人人人人人| 亚洲国产av新网站| 国产av一区二区精品久久| 高清不卡的av网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 三上悠亚av全集在线观看| 色哟哟·www| 老汉色av国产亚洲站长工具| 老司机亚洲免费影院| 国产精品偷伦视频观看了| 新久久久久国产一级毛片| 激情五月婷婷亚洲| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产乱来视频区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美+日韩+精品| 国产精品嫩草影院av在线观看| 99香蕉大伊视频| 日韩一区二区视频免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 美女中出高潮动态图| 看免费av毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 成年人午夜在线观看视频| 免费观看a级毛片全部| 日韩视频在线欧美| 久久 成人 亚洲| 日韩一本色道免费dvd| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人精品福利久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av视频免费观看在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲精品视频女| 晚上一个人看的免费电影| 色哟哟·www| 久久国产精品大桥未久av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 99国产精品免费福利视频| 久久久久网色| 国产国语露脸激情在线看| 18+在线观看网站| 国产精品久久久久久av不卡| 丝袜人妻中文字幕| 一个人免费看片子| 亚洲色图综合在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品一区二区在线不卡| 天堂中文最新版在线下载| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产伦理片在线播放av一区| 免费日韩欧美在线观看| 69精品国产乱码久久久| 秋霞伦理黄片| 亚洲综合精品二区| 久久精品国产自在天天线| 考比视频在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 日韩精品有码人妻一区| 免费在线观看完整版高清| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲伊人久久精品综合| 捣出白浆h1v1| 少妇熟女欧美另类| 国产亚洲欧美精品永久|