正交實驗優(yōu)選醋制當(dāng)歸炮制工藝*

楊宋一莎，聶詩明，劉藝瑩，余晗，劉艷菊，宋天寶

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430061；2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430071)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸滑腸功效，為臨床使用頻率最高的中藥之一。醋當(dāng)歸僅見于名老中醫(yī)用藥及古籍記載，醋制的意圖在清代《本草述鉤元》中記載：“如吐衄崩下藥中，須醋炒過，少少用之，多則反能動血[1]。”清《本草必用》：“酒洗去節(jié)，入止血藥中醋炒?！惫湃苏J(rèn)為醋制緩當(dāng)歸辛烈之性而專于止血，為止血崩或治吐血可醋炒用之。醋當(dāng)歸飲片并未列入《中華人民共和國藥典》，筆者未見炮制工藝研究及相關(guān)現(xiàn)代研究，基于古代用藥經(jīng)驗及中醫(yī)處方用藥需求，有必要對其探討開展相關(guān)研究，以更好地傳承祖國醫(yī)學(xué)。筆者在本實驗通過正交實驗法，以鞣質(zhì)、阿魏酸和揮發(fā)油含量為考察指標(biāo)，研究醋當(dāng)歸炮制工藝，以期為醋當(dāng)歸飲片生產(chǎn)企業(yè)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫1260液相色譜儀(美國 Agilent公司，UV檢測器)；HP色譜工作站 (美國Agilent公司)；BP121S分析天平(德國Sartorius公司，感量：0.1 mg)；BP211D分析天平(德國Sartorius公司，感量：0.01 mg)；PM PLUS 型紅外測溫儀 (美國 Raytek 公司) ；C18色譜柱(Thermo，4.6 mm×250 mm，5 μm)；圓底燒瓶；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(SFG-02.500)；PTHW型普通恒溫電熱套；KQ-400KDB 型高功率數(shù)控超聲波清洗器 (江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；CY-640型炒藥機(jī)(周口制藥機(jī)械廠有限公司，設(shè)備參數(shù)：50～180 kg·h-1，28 kW)。

1.2試藥 當(dāng)歸藥材{湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室楊紅兵教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的干燥根}。老陳醋[山西水塔醋業(yè)股份有限公司，濃度：6 g·(100 mL)-1]，阿魏酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：H27J7L16718)，沒食子酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號： YA0505YA14，20 mg，含量≥98%)，乙腈(色譜純，Thermo)，磷酸，超純水(優(yōu)普超純水器制備，UPCII-20T)，其余試劑均為分析純級別。

2 方法與結(jié)果

2.1因素水平的設(shè)計 根據(jù)預(yù)試驗與相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合實際，針對炮制工藝對飲片質(zhì)量的影響，主要因素為輔料用量、炮制時間、炮制溫度，因此選取醋用量、炒制溫度、炒制時間3個因素，進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計實驗考察，以確定其合理炮制工藝條件參數(shù)。其因素水平設(shè)計見表1。

表1 因素水平

2.2實驗方法 取凈當(dāng)歸片9 份，每份400 g，按表1設(shè)定組合條件，均用電熱炒藥機(jī)炒制，炒制溫度通過紅外測溫儀監(jiān)測控制鍋底溫度。具體操作方法如下： 取凈當(dāng)歸400 g，加醋拌勻，悶潤1 h，炒制，取出，放涼，篩去碎屑，封口袋密封，即得1～9號樣品。

2.3檢測項目 根據(jù)中藥炮制存性的基本要求，當(dāng)歸為調(diào)血之要藥，現(xiàn)代研究表明其活血化瘀主要活性成分為阿魏酸、揮發(fā)油等，所含鞣質(zhì)則具有較確切的止血功能，因此，將阿魏酸、揮發(fā)油、鞣質(zhì)作為考察指標(biāo)，分析不同炮制條件的影響。

2.3.1鞣質(zhì)含量測定 將醋當(dāng)歸樣品粉碎，過三號篩(篩孔內(nèi)徑297 μm)，取粉末適量，精密稱定，按《中華人民共和國藥典》2015年版(四部)通則2202測定鞣質(zhì)含量，同時進(jìn)行干酪素吸附空白實驗，計算扣除空白值。結(jié)果見表 2。

2.3.2阿魏酸含量測定 將醋當(dāng)歸樣品粉碎，過三號篩(篩孔內(nèi)徑297 μm)，取粉末適量，精密稱定，按《中華人民共和國藥典》2015年版(一部)當(dāng)歸項下含量測定法測定樣品阿魏酸含量。

2.3.3揮發(fā)油含量測定 將經(jīng)不同炮制方法處理的醋當(dāng)歸樣品粉碎，使能通過二號至三號篩(篩孔內(nèi)徑297 μm)，取粉末適量，稱定質(zhì)量，按《中華人民共和國藥典》2015年版(四部)通則2204揮發(fā)油測定法乙法測定，讀取揮發(fā)油量，并計算醋當(dāng)歸中揮發(fā)油的含量(%)。

2.4評分標(biāo)準(zhǔn) 筆者在本實驗采用多指標(biāo)加權(quán)評分法處理試驗數(shù)據(jù)：對應(yīng)每個成分以含量最高的樣品定為100分，其余各次的試驗依次換算成相應(yīng)的指標(biāo)分?jǐn)?shù)(計算公式為a/b×100%，其中a為實際值，b為9個值中最大值)。權(quán)重的分配，鞣質(zhì)易與蛋白質(zhì)結(jié)合，使創(chuàng)傷組織表面形成痂膜，減少分泌與血漿滲出，其藥理作用表現(xiàn)為能在血管破損處形成硬塊而止血。鞣質(zhì)在內(nèi)服或外用時，均具有止血和收斂的功效[2]。研究報道止血功效與炮制后鞣質(zhì)含量增加呈正相關(guān)[3]。因此，將醋當(dāng)歸中鞣質(zhì)含量的權(quán)重設(shè)為60%；阿魏酸和揮發(fā)油作為當(dāng)歸的主要有效成分，且2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定其為評價當(dāng)歸質(zhì)量的指標(biāo)性成分，其作用與當(dāng)歸主要功效一致：阿魏酸具有抗炎、止痛、抗血栓形成等藥理作用[4-5]；當(dāng)歸揮發(fā)油的主要成分藁本內(nèi)酯，具有抗血栓、抑制血小板聚集、抗貧血、緩解平滑肌痙攣等作用[6-8]。因此各給予20%權(quán)重。

綜合質(zhì)量評分=(各樣品中揮發(fā)油含量/9個樣品中揮發(fā)油最高含量)×20%+ (各樣品中阿魏酸含量/9個樣品中阿魏酸最高含量)×20%+(各樣品中鞣質(zhì)含量/9個樣品中鞣質(zhì)最高含量)×60%。

2.5結(jié)果 揮發(fā)油、阿魏酸、鞣質(zhì)含量正交實驗成分測定和評分結(jié)果見表2，正交綜合評分方差分析表見表3。

方差分析表明，3個影響因素順序為B>A>C，在給定的水平條件下，即炒制溫度>醋用量>炒制時間，其中炒制溫度對炮制工藝的影響有顯著差異。結(jié)合直觀分析，優(yōu)選工藝可定為A3B1C2，即15%醋，在進(jìn)藥鍋溫為120 ℃下炒制6.5 min。

2.6驗證實驗 按優(yōu)選的炮制工藝條件制備3批醋當(dāng)歸樣品，對其進(jìn)行揮發(fā)油、阿魏酸和鞣質(zhì)含量測定。綜合評分均值為95.33，且各指標(biāo)的RSD<0.5%(n=3)，說明制備出的醋當(dāng)歸質(zhì)量穩(wěn)定，優(yōu)選出的工藝穩(wěn)定、可行、合理。實驗結(jié)果見表4。

2.7中試驗證 取3批生當(dāng)歸各1.7 kg，按優(yōu)選的炮制工藝進(jìn)行中試試驗，由于參數(shù)放大，藥材炒制效率降低，根據(jù)實際中試炒制情況，因已達(dá)到工廠所用儀器生產(chǎn)的批量要求，故將炒制時間延長至13.5 min。結(jié)果見表5，綜合評分均值為96.21，且各指標(biāo)的RSD<1%(n=3)，說明優(yōu)選的工藝能適合于工業(yè)化生產(chǎn)。見表5。

3 討論

鞣質(zhì)、阿魏酸和揮發(fā)油為當(dāng)歸理血功效的活性成分，且含量受炮制條件的影響。因此，筆者在正交實驗中選擇鞣質(zhì)、阿魏酸和揮發(fā)油含量(均以干燥品計算)作為正交實驗的主要評價指標(biāo)。評分采用各指標(biāo)當(dāng)次實驗實際值占9次實驗最高值的比值按百分制進(jìn)行打分，再通過不同權(quán)重進(jìn)行統(tǒng)合計分，經(jīng)統(tǒng)計得到優(yōu)選工藝，即醋當(dāng)歸的炮制工藝，確定為用15%醋，在120 ℃下炒制6.5 min。驗證實驗和中試實驗數(shù)據(jù)表明，優(yōu)選的炮制工藝條件制備的醋當(dāng)歸質(zhì)量穩(wěn)定，說明優(yōu)選出的工藝穩(wěn)定、合理、可行。

表2 揮發(fā)油、阿魏酸、鞣質(zhì)含量正交實驗成分測定和評分結(jié)果

表3 正交綜合評分方差分析

表4 揮發(fā)油、阿魏酸、鞣質(zhì)含量和綜合評分結(jié)果

表5 揮發(fā)油、阿魏酸、鞣質(zhì)中試含量和綜合評分結(jié)果

研究顯示，影響當(dāng)歸醋制效果的因素順序為炒制溫度>醋用量>炒制時間，其中醋當(dāng)歸的炒制溫度對炮制品質(zhì)量有顯著性影響，應(yīng)給予重視。炒制溫度導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分散失、阿魏酸含量減少、鞣質(zhì)類成分增加，與文獻(xiàn)報道一致[9-10]。

本實驗以鞣質(zhì)、阿魏酸和揮發(fā)油3項指標(biāo)加權(quán)評分醋當(dāng)歸的質(zhì)量，能較好地體現(xiàn)醋當(dāng)歸的質(zhì)量內(nèi)涵，評級方法合理，實驗結(jié)果可靠。優(yōu)選的工藝為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

醋當(dāng)歸的處方應(yīng)用已有較長的歷史，但當(dāng)今僅見于少數(shù)名中醫(yī)的用藥經(jīng)驗，現(xiàn)行中藥飲片缺乏該品種，更無醋當(dāng)歸的炮制方法和飲片標(biāo)準(zhǔn)。我國傳統(tǒng)炮制中藥特點就是通過炮制，從而達(dá)到改變藥性、擴(kuò)大用藥范圍的目的。鑒于目前對于醋制當(dāng)歸的炮制方法、炮制原理、臨床應(yīng)用等方面的研究不足，總結(jié)歷史用藥經(jīng)驗，結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，開展相關(guān)研究和探討，對傳承祖國醫(yī)學(xué)、傳承我國古代炮制經(jīng)驗、炮制理論及豐富中醫(yī)臨床用藥具有重要意義。