琯溪蜜柚炭疽病拮抗放線菌的篩選和鑒定

賴寶春 吳振強(qiáng) 戴瑞卿 林明輝 李豐 林德鋒 王家瑞

摘 ?要：為篩選出對琯溪蜜柚炭疽病有防治效果的生防菌，以琯溪蜜柚炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）為靶標(biāo)菌，采用平板對峙法進(jìn)行初篩，用生長速率法和人工接種法對抑菌效果較好的菌株FX28進(jìn)行抑菌譜及防治效果測定;通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征，結(jié)合16S rDNA序列分析等方法研究其分類地位。結(jié)果表明：從25份土樣中共分離到放線菌105株，對琯溪蜜柚炭疽病菌有較好拮抗作用的放線菌有16株，其中菌株FX28抑菌活性最高，其抑菌帶寬度為15.3 mm，抑制率達(dá)86.4%，抑菌譜廣，對琯溪蜜柚炭疽病菌、琯溪蜜柚黑點(diǎn)病菌、琯溪蜜柚黑斑病菌等14種供試植物病原菌均有抑制作用;其作用機(jī)制表現(xiàn)為菌絲分枝增多、變粗、頂端膨大等，對琯溪蜜柚炭疽病的預(yù)防效果和治療效果分別為83.8%和71.1%。根據(jù)形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析，初步確定菌株FX28為深紅紫鏈霉菌（Streptomyces violaceorubidus）。

關(guān)鍵詞：琯溪蜜柚炭疽病;深紅紫鏈霉菌;分類鑒定;生防作用

中圖分類號：S436.66 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： This study was conducted to screen resources for the biological control of Colletotrichum gloeosporioides which cause anthracnose disease for Guanxi honey pomelo cultivar. An antagonistic actinomycete of C. gloeosporioides was isolated from the soil samples by the plate-confrontation method and growth speed rate method， and the inoculated fruit was treated with the fermented broth. The taxonomic identification of the strain FX28 was carried out using morphological， physiological and biochemistry characteristics and 16S rDNA sequence. From the 25 soil samples， 16 of 105 antagonistic actinomycete isolates showed againstantifungal activity against C. gloeosporioides. FX28 showed an inhibition zone with a diameter 15.3 mm and strongest inhibition rate 86.4%. FX28 had broad-spectrum inhibition activity to all the 14 plant pathogenic fungi such as C. gloeosporioides， Diaporthe citri， Phyllosticta citriasian. FX28 could break down hyphae， turn hyphal thickened， fractured and enlarged. The protection and curation effects of the fermented broth against C. gloeosporioides were up to 83.8% and 71.1%， respectively. Based on the morphological， physiological-biochemical characteristics and molecular analysis， FX28 was identified as Streptomyces violaceorubidus.

Keywords： honey pomelo anthracnose disease; Streptomyces violaceorubidus; taxonomic identification; biocontrol effect

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.022

琯溪蜜柚炭疽病的病原為膠孢炭疽菌（Coll-etotrichum gloeosporioides），該菌在琯溪蜜柚整個(gè)生育期及果實(shí)采后均可為害[1]。目前，生產(chǎn)上防治該病主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，從蜜柚抽發(fā)春梢開始至冬季清園結(jié)束，果農(nóng)每隔20 d左右施用一次化學(xué)農(nóng)藥，大量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅對生態(tài)環(huán)境和人畜健康造成危害，也導(dǎo)致果實(shí)農(nóng)藥殘留和病原菌的抗藥性逐年增加。因此，研究安全環(huán)保的病害防控方法對琯溪蜜柚的可持續(xù)生產(chǎn)具有重要意義。放線菌能產(chǎn)生抗生素及次生代謝產(chǎn)物，極具植物病害防控潛力，在植物病害防治中已得到有效的應(yīng)用[2]。國內(nèi)外已有柑橘炭疽病生防方面的相關(guān)報(bào)道，Lee等[3]研究發(fā)現(xiàn)，從八角茴香和荊芥中提取的精油能夠抑制炭疽病菌的生長;汪茜等[4]研究了枯草芽孢桿菌1505菌株對柑橘采后炭疽病的防治效果，采用刺傷接種的防效為48.8%，自然發(fā)病的防效為46.3%;劉冰等[5-6]篩選到一株放線菌ML27菌株對柑橘炭疽病菌的抑制率為72.15%;汪文強(qiáng)等[7]利用煙管菌發(fā)酵液對柑橘炭疽病菌的抑菌率達(dá)71.1%;袁紅旭等[8]從柑橘果實(shí)中分離到14株內(nèi)生細(xì)菌可降低柑橘果實(shí)炭疽病的發(fā)病率;紀(jì)兆林等[9]分離到的地衣芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌對柑桔炭疽病菌菌絲有明顯的抑制作用，可延緩柑桔采后炭疽病的發(fā)生;黃艷等[10]利用殼寡糖誘導(dǎo)柑橘果實(shí)中活性氧的變化來降低炭疽病的發(fā)病率。但是在柑橘屬農(nóng)產(chǎn)品上，尚未發(fā)現(xiàn)能抑制炭疽病菌達(dá)12 h以上的生物殺菌劑[11]。目前有關(guān)琯溪蜜柚炭疽病生物防治的研究報(bào)道較少。因此，本研究以琯溪蜜柚炭疽病菌作為靶標(biāo)菌，從福建省漳州市不同地區(qū)的土壤中分離篩選生防效果較好的拮抗放線菌菌株，旨在為該病的生物防治提供更多的微生物資源。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試病原菌：琯溪蜜柚炭疽病菌（Coll-etotrichum gloeosporioides）、琯溪蜜柚黑點(diǎn)病菌（Diaporthe citri）、琯溪蜜柚黑斑病菌（Phyllo-sticta citriasiana）、香蕉枯萎病菌4號小種（Fusa?rium oxysporum f. sp. cubense， race 4）、辣椒枯萎病菌（F. oxysporum Schl. f. sp. vasinfectum）、水稻惡苗病菌（F. moniliforme）、玉米穗腐病菌（F. porliferatum）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、黃瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cu-curmerinum）、番茄枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. lycopersici），由本研究室分離、鑒定、致病性測定及保存;番茄葉霉病菌（Fulvia fulva）、多肉黑斑病菌（Alternaria alternata）、榕樹炭疽病菌（C. gloeosporioides）、蘭花莖腐病菌（F. oxysporum），由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所饋贈。供試土樣采自福建省漳州市龍文區(qū)、薌城區(qū)、南靖縣、平和縣、云霄縣、詔安縣等地，共25份。

供試藥劑：70%丙森鋅可濕性粉劑，由拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司生產(chǎn)，為果農(nóng)防治琯溪蜜柚炭疽病常用藥劑。

1.2 ?方法

1.2.1 ?放線菌的分離、純化 ?采用稀釋涂布分離法[12]分離放線菌。將土樣置于通風(fēng)干燥處自然風(fēng)干，稱取5 g土壤倒入放有滅菌玻璃珠的50 mL無菌水中，置于振蕩培養(yǎng)箱（BS-1振蕩培養(yǎng)箱，金壇市鴻科儀器廠）振蕩30 min后，吸取1 mL混懸液，用無菌水梯度稀釋，分別吸取104、105、106稀釋液0.1 mL均勻涂布在高氏一號瓊脂平板上，后置于28 ℃生化培養(yǎng)箱（上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司）中培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)性狀不同的單菌落轉(zhuǎn)入高氏一號培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，純化3次后，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 ?拮抗放線菌的篩選 ?發(fā)酵液制備[2]：將100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基加入250 mL三角瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻后接入4 mm的菌餅（從1.2.1中純化保存的放線菌）5塊，于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，在無菌條件下將發(fā)酵液吸到滅菌離心管中，8 000 r/min離心30 min，吸取上清液，置于20 ℃冰箱中備用。

拮抗菌的篩選：采用平板對峙法[13]對1.2.1中所分離到的放線菌進(jìn)行抑菌活性篩選，靶標(biāo)菌為琯溪蜜柚炭疽病菌。

抑菌譜測定：采用菌絲生長速率法[12]測定1.2.1節(jié)篩選獲得的強(qiáng)活性菌株對供試病原真菌的抑菌能力。

孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)：將稀釋10倍的菌株FX28（1.2.1篩選獲得的強(qiáng)活性菌株）發(fā)酵濾液和病菌孢子懸浮液滴入凹玻片中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，設(shè)空白發(fā)酵液與無菌水的混合液作為對照。分別于12 h和24 h觀察病菌孢子的萌發(fā)情況[14]。

1.2.3 ?防治效果測定 ?取新鮮琯溪蜜柚幼果，用75%酒精表面消毒，無菌水沖洗3次，采用刺傷接種的方法，取菌株FX28發(fā)酵上清液5 mL均勻涂抹于幼果傷口及其周圍果面，涂抹后放入塑料盒置于28 ℃恒溫箱中。24 h后在傷口處接種20 ?L炭疽病菌孢子液（105個(gè)孢子/mL），接種后放入塑料盒（相對濕度約90%）置于28 ℃恒溫箱，測定菌株FX28的預(yù)防效果;將炭疽病菌孢子液20 ?L接種于幼果傷口及其周圍，24 h后在傷口處及其周圍涂抹5 mL發(fā)酵上清液，測定菌株FX28的治療效果。設(shè)70%丙森鋅300倍液為藥劑對照，設(shè)無菌水為空白對照，每處理15個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。接種后每天觀察1次，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。果實(shí)發(fā)病程度分級標(biāo)準(zhǔn)參照汪茜等[5]的方法。

1.2.4 ?FX28菌株的鑒定 ?形態(tài)特征觀察：采用插片法，待菌絲長上蓋玻片后，取菌絲生長適中的蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下，觀察FX28菌株氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、孢子絲和孢子的形態(tài)特征[15]。

培養(yǎng)特征和生理生化特征分析：參照關(guān)統(tǒng)偉等《放線菌系統(tǒng)分類技術(shù)》[16]和中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組編著的《鏈霉菌鑒定手冊》[15]。觀察菌株培養(yǎng)特征的8種培養(yǎng)基見表4。

分子生物學(xué)鑒定[13， 17]：采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌體總DNA，以Ezup柱式抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]和細(xì)菌通用引物27F： 5-AGAGTTTGATCMTGGCT CAG-3和1492R： 5-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 2 μL（100 ng/μL），10 μmol/L引物各1 μL，加ddH2O至總體積達(dá)25 μL，陰性對照用ddH2O代替模板DNA。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃修復(fù)延伸10 min，于4 ℃下保存。在含有GelRed染料的1%瓊脂糖凝膠中回收擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化和鑒定后，陽性克隆由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測定的基因序列登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行BLAST比對，并從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)分離物的16S rDNA序列，然后用鄰位加入法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用DPS軟件進(jìn)行方差分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?拮抗放線菌初篩

從25份土壤樣品中共分離、純化到105株培養(yǎng)性狀不同的放線菌。拮抗活性試驗(yàn)結(jié)果表明，有16株放線菌對琯溪蜜柚炭疽病菌的抑菌帶寬度大于12.0 mm，其中，7株放線菌的抑菌帶寬度大于13.0 mm，以菌株FX28的抑菌效果最好，抑菌帶寬度達(dá)15.3 mm（表1，圖1），因此將其作為后續(xù)試驗(yàn)菌株。

2.2 ?活性菌株FX28的抑菌譜

抑菌譜測定結(jié)果表明，菌株FX28對14種供試病原真菌均有不同程度的抑制作用，其中對琯溪蜜柚炭疽病菌、辣椒枯萎病菌和番茄葉霉病菌作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)85.8%以上;對榕樹炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的抑制率分別為74.9%、75.0%、75.0%;對水稻惡苗病菌、玉米穗腐病菌、辣椒疫霉病菌的抑制作用相對較弱，抑制率在23.7%～30.8%之間;且菌株FX28對不同病原菌的抑制作用存在顯著差異（表2）。

2.3 ?菌株FX28對琯溪蜜柚炭疽病菌的抑菌效果

2.3.1 ?菌株FX28對琯溪蜜柚炭疽病菌菌絲的作用機(jī)制 ?在光學(xué)顯微鏡下檢查被抑制菌絲的變化情況，結(jié)果顯示受抑制的琯溪蜜柚炭疽病菌菌絲變粗、分枝增多、頂端膨大、扭曲、易斷裂，且菌絲內(nèi)原生質(zhì)凝聚，細(xì)胞內(nèi)含物紊亂（圖2B）。對照的菌絲細(xì)長，光滑而均勻（圖2A）。

2.3.2 ?菌株FX28對琯溪蜜柚炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制作用 ?孢子萌發(fā)抑制結(jié)果表明，培養(yǎng)12 h后，對照的炭疽病菌孢子萌發(fā)率為91.7%，菌株FX28發(fā)酵液處理的孢子萌發(fā)率為0，抑制率為100%;24 h后，對照炭疽病菌孢子全部萌發(fā)，菌株FX28發(fā)酵液處理的孢子少量萌發(fā)，萌發(fā)率為3.0%，抑制率為97.0%（圖3）。

2.4 ?菌株FX28對琯溪蜜柚炭疽病的防治效果

預(yù)防作用測定結(jié)果表明，對照大部分果實(shí)腐爛，爛果率為91.1%，病情指數(shù)為50.1;菌株FX28發(fā)酵液處理的果實(shí)爛果率為20.0%，病情指數(shù)為8.2，其預(yù)防效果為83.8%;70%丙森鋅處理的預(yù)防效果為85.7%，略高于菌株FX28發(fā)酵液處理。治療作用測定結(jié)果表明，菌株FX28發(fā)酵液處理的果實(shí)爛果率為28.9%，病情指數(shù)為14.1，其治療效果為71.1%，略低于70%丙森鋅處理，處理間無顯著差異（表3）。但隨著時(shí)間延長，對照果實(shí)的腐爛面積逐漸擴(kuò)大，而感病果實(shí)經(jīng)菌株FX28發(fā)酵液和70%丙森鋅處理后，果實(shí)腐爛面積沒有繼續(xù)擴(kuò)大。

2.5 ?菌株FX28的分類鑒定

2.5.1 ?菌株FX28的形態(tài)及培養(yǎng)特征 ?FX28菌株在高氏一號培養(yǎng)基上生長旺盛，菌落多褶皺，不易挑起，直徑為1.5～1.8 cm。鏡檢發(fā)現(xiàn)氣生菌絲和孢子絲均高度分枝;孢子鏈較長，孢子絲松敞或緊密螺旋形，時(shí)常不規(guī)則，叢生或輪生（圖4A），孢子絲成熟后形成串珠狀的孢子鏈，孢子絲斷裂后形成橢球形孢子，表面稍有褶皺，孢子大小0.60～0.75 ?m×0.80～1.05 ?m（圖4-B）。菌株FX28在8種培養(yǎng)基上均生長良好，28 ℃培養(yǎng)36～48 h后開始出現(xiàn)菌落，72～96 h后開始產(chǎn)生孢子，孢子堆顏色淺灰色至深灰色。其培養(yǎng)特征見表4。

2.5.2 ?生理生化特性 ?研究結(jié)果表明，菌株FX28可以利用甘油、蔗糖、麥芽糖、肌醇、葡萄糖、D-阿拉伯糖、鼠李糖、D-甘露醇、α-半乳糖、D-木糖作為碳源生長，不能利用棉子糖、D-果糖。可利用L-賴氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、天冬酰胺、L-酪氨酸、L-色氨酸作為氮源生長，不能利用L-谷氨酸。能使淀粉水解、明膠液化、牛奶凝固而不胨化，不能使硝酸鹽還原、纖維素和色氨酸分解，也不能產(chǎn)生H2S和黑色素。

2.5.3 ?16S rDNA序列分析 ?FX28菌株P(guān)CR擴(kuò)增得到1條約1295 bp的條帶。FX28菌株的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)FX28菌株與深紅紫鏈霉菌（Streptomyces violaceorubidus）的同源性最高，相似度在99%以上。選擇與菌株FX28同源性較高的10株菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），結(jié)果表明，菌株FX28的16S rDNA序列與深紅紫鏈霉菌（S. violaceorubidus）NR 042309.1聚在一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合菌株FX28的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步確定菌株FX28為深紅紫鏈霉菌（S. violaceorubidus）。

3 ?討論

琯溪蜜柚炭疽病不僅在田間引起果實(shí)腐爛，而且在貯藏過程中，對琯溪蜜柚的危害也很嚴(yán)重。目前，琯溪蜜柚炭疽病的防治主要采用化學(xué)殺菌劑，而化學(xué)殺菌劑對人畜的毒副作用和殘留問題至今難以有效解決。生物防治對環(huán)境友好，且病害不易產(chǎn)生抗藥性，是植物病害防治的發(fā)展趨勢。目前，生產(chǎn)上用于防治病害的農(nóng)用抗生素中大部分是由鏈霉菌屬（Streptomyces）產(chǎn)生[18]。研究結(jié)果表明，菌株FX28對琯溪蜜柚炭疽病菌菌絲具有較強(qiáng)的抑制作用，該菌株屬鏈霉菌屬，通過培養(yǎng)特征、形態(tài)特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析等，初步確定該菌株為深紅紫鏈霉菌（S. violaceorubidus）。該菌株對供試的大部分病原真菌均有較強(qiáng)的抑制活性，能否作為農(nóng)用抗生素的新來源，還需進(jìn)一步研究。另外，從應(yīng)用生防菌的角度而言，需優(yōu)化該菌株的培養(yǎng)條件，特別是產(chǎn)生抗菌代謝物的培養(yǎng)條件。

目前，國內(nèi)外已有深紅紫鏈霉菌的相關(guān)報(bào)道，周璇[19]研究發(fā)現(xiàn)深紅紫鏈霉菌具有較強(qiáng)的有機(jī)物分解功能，可影響紅壤微生物的數(shù)量，提高紅壤呼吸速率的峰值。甘龍站等[20]分離到一株具有極強(qiáng)的抗癌、抗糖尿病活性及中等抗菌活性的深紅紫鏈霉菌。Asmaa等[21]從污水處理系統(tǒng)中分離到3株深紅紫鏈霉菌，可抑制污水中的病原體。Adeline等[22]從油棕的空果殼堆肥中分離到一株能加快堆肥速度且抑制靈芝屬（Ganoderma）致病菌的深紅紫鏈霉菌。Wadetwar等[23-24]從印度那格浦爾（Nagpur）地區(qū)土壤中分離到一株深紅紫鏈霉菌，對其發(fā)酵工藝優(yōu)化后可大規(guī)模生產(chǎn)胞外抗生素。而深紅紫鏈霉菌應(yīng)用于防治果樹病害尤其是琯溪蜜柚炭疽病的研究未見相關(guān)報(bào)道。本研究分離得到的深紅紫鏈霉菌菌株生長繁殖速度快，抑菌譜廣，對琯溪蜜柚炭疽病菌菌絲的抑制率達(dá)86.4%，24 h后對孢子的萌發(fā)抑制率為97.0%。吳思夢等[14]用黃色鏈霉菌發(fā)酵液對柚子炭疽病孢子萌發(fā)抑制率為61.54%。研究發(fā)現(xiàn)深紅紫鏈霉菌的抑菌作用機(jī)制表現(xiàn)為菌絲分枝增多、變粗、頂端膨大、扭曲、易斷裂，且菌絲內(nèi)原生質(zhì)凝聚，細(xì)胞內(nèi)含物紊亂，與前人研究結(jié)果一致[13]。深紅紫鏈霉菌發(fā)酵上清液對琯溪蜜柚炭疽病的預(yù)防效果和治療效果分別為83.8%和71.1%，而汪茜等[4]用生防細(xì)菌防治柑橘采后炭疽病的防效為48.8%。后續(xù)將對深紅紫鏈霉菌在田間的定殖能力、適應(yīng)性、穩(wěn)定性以及防治效果等相關(guān)方面進(jìn)行研究。目前國內(nèi)外未見深紅紫鏈霉菌用于琯溪蜜柚炭疽病防治方面的相關(guān)報(bào)道。因此，以深紅紫鏈霉菌為菌源開發(fā)用于防治琯溪蜜柚炭疽病的新型生防制劑及生物有機(jī)肥具有良好的發(fā)展前景。

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