基于文獻計量分析的竹組織培養(yǎng)研究進展

李雪梅，呂丹丹，張文根，陳天國，楊光耀

（1.江西省竹子種質(zhì)資源與利用重點實驗室，江西農(nóng)業(yè)大學，江西 南昌330045；2.常州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇 常州213000）

竹（Bamboos），一般泛指竹亞科（Bambusoideae）植物，是一類集經(jīng)濟、生態(tài)和人文等價值于一體的極其重要的森林資源。全世界竹亞科植物大約1 400余種，其中1 200余種為木本竹（Wood bamboos），180余種為草本竹（Herbal bamboos），主要分布在亞洲、非洲和拉丁美洲的熱帶、亞熱帶區(qū)域［1－3］。中國是最主要的產(chǎn)竹國，栽培利用歷史悠久。據(jù)不完全統(tǒng)計，除引種栽培外，中國大約有500余種，絕大多數(shù)自然分布于長江流域及其以南各省區(qū)，少數(shù)種類向北延伸至秦嶺、漢水及黃河流域各處［4］。自秦代蒙恬用竹管制筆以后，漢代竹簡大興，東漢蔡倫造紙，宋代畢昇發(fā)明印刷術(shù)，為竹類資源利用奠定了基礎(chǔ)［5］。

多數(shù)竹具有較為特殊的開花現(xiàn)象。它們開花周期不定，少則數(shù)年，多則幾十年，而開花后往往枯死，結(jié)實率低，種子獲取困難。這些特殊的生物學特性，決定了以種子為主的傳統(tǒng)育苗方法對竹類植物的繁育是困難的。目前，其繁育主要以埋鞭、埋稈、埋節(jié)等方法為主。然而，以上繁育方式具有母竹利用率低、生態(tài)環(huán)境破壞大、種苗運輸不便、勞動強度大、繁殖系數(shù)低等缺點［6－7］。為此，隨著20世紀初植物組織培養(yǎng)技術(shù)的興起，為了尋求新的竹苗繁育途徑，近20 a來人們開始了大量竹的組織培養(yǎng)研究。

迄今為止，國內(nèi)外已對牡竹屬（Dendrocalamus）、簕竹屬（Bambusa）、剛竹屬（Phyllostachys）等20余屬70多種竹子開展了組織培養(yǎng)研究。其中，麻竹（D.latiflorus）和孝順竹（B.multiplex）等已有了較為成熟的快繁體系，并應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)。為了增進竹組織培養(yǎng)發(fā)展歷史的理解，為后續(xù)研究提供參考，基于文獻情報計量分析和統(tǒng)計學方法對近半個多世紀相關(guān)論文的發(fā)表量、時間、地區(qū)、屬種、組培類型以及外植體選擇等方面進行了全面深入分析。

1 數(shù)據(jù)來源和處理方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以中國知網(wǎng)（CNKI）和Web of Science（WOS）為數(shù)據(jù)源，對“竹組織培養(yǎng)／竹微型繁殖／Bamboo tissue culture／Bamboo micropropagation／In vitro propagation of bamboo”主題詞進行檢索，時間跨度為1960－2020年。

1.2 處理方法

利用EndNote、Excel對竹組培文獻進行整理、歸納和總結(jié)，分別從發(fā)文量、國家／地區(qū)、屬種、外植體、消毒劑、培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑以及組培竹類型等方面進行深入分析。同時，運用VOSviewer軟件繪制與竹組培相關(guān)的知識圖譜，并對研究機構(gòu)、作者及竹種進行可視化分析，從而得出該領(lǐng)域作者機構(gòu)合作影響力及現(xiàn)階段研究的熱點。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體發(fā)文量變化概況

2.1.1 文獻數(shù)量與年度分布分析 基于主題詞檢索和甄別篩選，共計獲得竹組培研究文獻282篇（CNKI中148篇，WOS中134篇）。國外，Alexander和Rao（1968）首次報導(dǎo)毛環(huán)竹（Phyllostachys meyeri）成熟種胚離體培養(yǎng)［8］。國內(nèi)，闕國寧和諸葛強（1991）以芽節(jié)為外植體，成功培養(yǎng)出黃竹（Dendrocalamus membranceus）和印度簕竹（Bambusa arundinacea）完整植株［9］。從發(fā)文量來看（圖1a），以1980年和2015年為臨界點，可將竹組織培養(yǎng)研究歷史劃分為起步、快速增長和衰退3個階段。其中，CNKI發(fā)文增長量明顯快于WOS，并于2005年之后實現(xiàn)反超，至2010年后增長趨勢有所回落。導(dǎo)致以上差異的原因很多，不同數(shù)據(jù)庫收錄的期刊不同，科研評價指標的轉(zhuǎn)變，都有可能導(dǎo)致以上現(xiàn)象的發(fā)生。并且，不同國家在不同發(fā)展時期對于不同領(lǐng)域的研究重視程度各不相同，研究方向的轉(zhuǎn)變也可能致使發(fā)文量下降。

2.1.2 主要國家、機構(gòu)和作者發(fā)文量分析 從發(fā)文國家來看（圖1b），發(fā)展中國家占絕大多數(shù)，發(fā)文量共計272篇，占97%。而發(fā)達國家，如美國、法國和日本，其發(fā)文量總計約10篇，不及3%。其中，中國排名第一，發(fā)文量占總量的52%（148／282），其次為印度，占40%（114／282），然后是泰國1%（4／282），斯里蘭卡1%（4／282），日本1%（3／282），美國1%（2／282）和比利時1%（2／282）等。而從發(fā)文機構(gòu)來看，無論是CNKI還是WOS，竹組培研究力量主要分布于高校，少量分布于研究所。CNKI中，主要研究機構(gòu)有中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所、南京林業(yè)大學、云南師范大學、西南林業(yè)大學等，主要研究團體核心人物有林新春、譚宏超、岳晉軍、丁雨龍、普曉蘭、王裕霞、張春霞等（圖1c和1d）。WOS中，主要研究機構(gòu)有Academia Sinica（中央研究院）、TERI（印度能源研究所）、NIFS（斯里蘭卡國家基礎(chǔ)研究所）、UCR（哥斯達黎加大學）、Toyama Prefectural Univ（日本富山縣立大學）、ZAFU（浙江農(nóng)林大學）、FAFU（福建農(nóng)林大學）、NJFU（南京林業(yè)大學）等，主要研究團體核心人物有Saxen S.、Collins G.B.、Huang L.、Shinjiro O.、Chang W.C.、Sood A.、Chung I.M.、Lin X.C.、Zhang L.等（圖1e和1f）。研究作者群體和機構(gòu)整體上呈現(xiàn)“小聚集、大分散”特征。以上情形可能與竹類植物分布、人口結(jié)構(gòu)和經(jīng)濟、科技發(fā)展水平等相關(guān)。

2.2 竹子組培族屬種研究情況

CNKI庫中，竹組培研究涉及168種，合軸型（sympodium）113種，單軸型（monopodium）34種，復(fù)軸型（amphipodium）21種（圖2a）。WOS中，涉及竹子223種，合軸型190種，單軸型21種，復(fù)軸型12種（圖2b）。從統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，合軸型竹種數(shù)量遠多于單軸型和復(fù)軸型的竹種數(shù)量，側(cè)面反映目前合軸型竹種的組培技術(shù)相比于單軸型和復(fù)軸型更為成熟，體系更為完善。

從竹種屬級水平來看，不管是CNKI還是WOS，研究主要集中于牡竹屬、簕竹屬和剛竹屬（圖2c）。其中，牡竹屬約占所有研究屬的38%（151／394），如：麻竹（D.latiflorus）、馬來甜龍竹（D.asper）、巨龍竹（D.sinicus）、云南甜龍竹（D.brandisii）、版納甜龍竹（D.hamiltonii）等（圖2d和2e）。簕竹屬約占30%（118／394），如：孝順竹（B.multiplex）、綠竹（B.oldhamii）、巴苦竹（B.balcooa）、俯竹（B.tulda）等（圖2d和2e）。其中牡竹屬和簕竹屬組培竹種中，絕大部分竹種均誘導(dǎo)出完整植株且成活率達90%以上。剛竹屬約占10%（40／394），如：毛竹（Ph.edulis）、水竹（Ph.heteroclada）等（圖2d和2e），僅少數(shù)竹種成功誘導(dǎo)出植株，大部分處于誘導(dǎo)出愈傷組織和生根階段。以上數(shù)據(jù)表明，牡竹屬和簕竹屬的組培研究已經(jīng)形成了良好的態(tài)勢，在竹亞科中處于較高發(fā)展水平和地位。

圖2 不同類型的竹子組織培養(yǎng)Fig.2 Tissue culture of different types of bamboo

2.3 外植體的選擇分析

具有再生活力的無菌外植體是組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一。竹組織培養(yǎng)所選外植體主要為3類（圖3a）：以芽繁芽50%（81／164）、胚培養(yǎng)40%（66／164）和愈傷組織再生植株10%（17／164）。

2.3.1 以芽繁芽 以芽繁芽在竹子品種篩選以及母株特性保持方面優(yōu)勢較為明顯，能實現(xiàn)無性系植株的繁殖和利用，常選用幼嫩的腋芽、側(cè)芽和叢芽等。先后以紫竹（Ph.nigra）［10］、馬甲竹（B.tulda）［11］、馬來簕竹（B.glaucophylla）［12］、麻竹（D.latiflorus）［13］、馬來甜龍竹（D.asper）［14］、版納甜龍竹（D.hamiltonii）［15］、龍竹（D.giganteus）［16］、牡竹（D.strictus）［17］、料慈竹（Neosinocalamus distegia）、五彩香竹（Chimonocalamus songmingensis）、毛環(huán)刺竹（B.balcooa）、孝順竹（B.mutiplex）、佛肚竹（B.ventricosa）［18］、爬竹（Drepanostachyum scandens）［19］等側(cè)芽或幼枝（腋芽）等為外植體，成功實現(xiàn)有效增殖擴繁。

2.3.2 胚培養(yǎng) 胚培養(yǎng)選用種子作為外植體。對墨西哥竹（Otatea aztecorum）［20］、毛竹（Ph.edulis）［21］、馬來甜龍竹（D.asper）［22］、福貢龍竹（D.fugongensis）［23］、麻竹（D.latiflorus）、巨龍竹（D.sinicus）［24］、版納甜龍竹（D.hamiltonii）［25］、馬來甜龍竹（D.asper）、小葉龍竹（D.barbatus）、沙羅單竹（Schizostachyum funghomii）、泰竹（Thyrsostachys siamensis）［18］等種胚培養(yǎng)獲得愈傷組織，一部分成功誘導(dǎo)生根長成植株。

2.3.3 愈傷組織再生植株 外植體誘導(dǎo)愈傷組織，主要為誘導(dǎo)再生植株和懸浮培養(yǎng)獲得單個細胞在培育成植株2個方面。如以金絲慈竹（B.emeiensis‘viridiflavus’）［26］、孝順竹（B.multiplex）［27］、泰山竹（B.vulgaris‘Striata’）［28］等再生植株為外植體再次成功誘導(dǎo)出新植株。其中通過懸浮培養(yǎng)方式培育新植株的報道較少，如黃竹（D.membranaceus）［29］、孝順竹（B.multiplex）［30，31］、空竹（Cephalostachyum latifolium）［32］等通過懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織。

2.4 消毒劑和培養(yǎng)基選擇分析

竹組織培養(yǎng)成功與否受消毒劑、培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)等因素影響。外植體消毒是提高接種成活率的關(guān)鍵，不同植物及不同部位的組織特點不同，所需消毒劑及其濃度也不相同。培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)，含植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。植物生長調(diào)節(jié)劑是影響植物離體形態(tài)發(fā)生的最關(guān)鍵因素［33－34］。

2.4.1 消毒劑的選擇分析 正確選擇消毒劑的濃度和處理時間可以降低污染率，盡量減少組織死亡，提高外植體的存活率。從現(xiàn)有數(shù)據(jù)來看，消毒劑使用頻率排前3的有氯化汞溶液29%（154／521），常用濃度0.05%～6%、乙醇溶液25%（129／521），常用濃度70% ～95%、次氯酸鈉溶液23%（120／521），常用濃度0.2%～30%（圖3b，表1）?？傮w上看，此3種消毒劑對大部分外植體具有廣適性。此外，還有吐溫14%（71／521）、高錳酸鉀溶液5%（25／521）以及其他類型的消毒劑4%（22／521），如：Extran堿性溶液［35］、teepol［36］、代森錳鋅殺菌劑［37］等。

圖3 竹子組織培養(yǎng)外植體、消毒劑、培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑選擇情況Fig.3 Selection of bamboo tissue culture explants，disinfectants，culture media and growth regulators

2.4.2 培養(yǎng)基的選擇分析 培養(yǎng)基為植物組織培養(yǎng)提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)和水分等，并且起著保持滲透壓、酸堿度平衡的重要作用［38］。竹子組培中，培養(yǎng)基使用頻率前3的有MS基本培養(yǎng)基38%（137／364）、3／4MS培養(yǎng)基24%（88／364）、1／2MS培養(yǎng)基19%（70／364）（圖3c）。其中，MS培養(yǎng)基無論是誘導(dǎo)、增殖還是生根過程都具有廣適性［39－41］，如紅哺雞竹（Ph.iridescens）和白哺雞竹（Ph.dulcis）在嫩枝條和地下莖培養(yǎng)過程中芽誘導(dǎo)、愈傷誘導(dǎo)和分化誘導(dǎo)過程均使用MS培養(yǎng)基，雷竹（Ph.violascens‘Prevernalis’）側(cè)芽和頂芽誘導(dǎo)、增殖和生根均采用MS培養(yǎng)基［42－43］。并且，MS＋BA（0.2～5.0 mg·L－1）培養(yǎng)基配方在大多誘導(dǎo)過程中具有一定的可適性，如鋪地竹（Sasa aegenteastriatus）、曙莉竹（S.versicolo）、人面竹（Ph.aurea）等外植體誘導(dǎo)（表1）。除此之外，還有的使用1／3MS、N6、White、B5、KM-8P、LS等培養(yǎng)基［44－45］。

植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度是成功建立組織培養(yǎng)體系的關(guān)鍵［46］。在沒有添加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，很少甚至不發(fā)生芽增殖，而不同品種和不同基因型對植物生長調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)不同。竹子組培中，生長調(diào)節(jié)劑使用前4的分別為BA（占26%，171／672），常用濃度范圍0.2～5 mg·L－1；IBA（18%，120／672），常用濃度范圍0.01～5 mg·L－1；NAA（17%，114／672），常用濃度范圍0.1～5 mg·L－1；KT（17%，112／672），常用濃度范圍0.1～2 mg·L－1（圖3d，表1）。廣泛使用的生長素類有IBA和NAA，細胞分裂素類為BA和KT。其中，BA是最能誘導(dǎo)出叢芽的激素，如毛竹（Ph.edulis）、菲白竹（Pleioblastus fortunei）、花粉麻竹（D.pulverulentusvar.amoenus）等［47－49］。

表1 竹類植株組織培養(yǎng)部分竹種消毒劑和培養(yǎng)基配方Tab.1 The medium formula of some bamboo seeds for tissue culture of bamboo plants

3 討論與展望

關(guān)于竹組培方面的研究綜述，前人已有報道，并針對組培中污染、褐化、玻璃化、生長衰退等問題進行了比較深入的討論［50－53］。研究首次采用文獻計量學和統(tǒng)計學手段，基于CNKI和WOS數(shù)據(jù)庫文獻，借助VOSviewer、Endnote、Excel等工具，對竹組培相關(guān)論文的發(fā)表量、時間、地區(qū)、屬種、組培類型以及外植體選擇等方面進行了深入研究。主要發(fā)現(xiàn)：①竹組培研究歷史與植物組培史大致相符，均經(jīng)歷了從起步到繁盛再產(chǎn)業(yè)的發(fā)展階段；②受竹種分布特點、人口結(jié)構(gòu)和經(jīng)濟、科技發(fā)展水平等因素影響，竹組培研究主力軍主要在發(fā)展中國家，特別是印度和中國，研究作者群體和機構(gòu)呈現(xiàn)“小聚集、大分散”特征；③當前竹組培研究主要集中于牡竹屬、簕竹屬和剛竹屬中，以Dendrocalamus最為突出，合軸型竹種組培相較于單軸型和復(fù)軸型更為容易，這與竹種特性、用途和技術(shù)水平息息相關(guān)；④竹組培外植體主要為3類，即以芽繁芽、胚培養(yǎng)及愈傷組織再生植株，其中以芽繁芽是最主要的繁殖方式；⑤消毒劑主要為氯化汞、乙醇和次氯酸鈉等溶液，培養(yǎng)基主要為MS培養(yǎng)基，而生長調(diào)節(jié)劑一般為BA、IBA、NAA和KT，BA是最能誘導(dǎo)出叢芽的激素，MS＋BA（0.2～5.0 mg·L－1）培養(yǎng)基配方在大多誘導(dǎo)過程中具有一定的可適性。

世界竹資源分布不均，亞太竹區(qū)是最主要的竹類植物分布區(qū)之一。印度和中國是亞洲最主要的竹資源分布國家，受到高度重視和廣泛關(guān)注。組培是竹子快繁的一種有效途徑，尤其是對于那些開花周期長且實生苗后代分離嚴重、生長發(fā)育優(yōu)勢弱以及經(jīng)常開花但很難得到可育種子的重要經(jīng)濟竹種。竹種選擇相對單一，主要集中于牡竹屬、簕竹屬和剛竹屬。組培成功的竹種，近90%的屬于叢生竹，如麻竹（D.latiflorus）、馬來甜龍竹（D.asper）、巨龍竹（D.sinicus）等［54］。內(nèi)在原因或機制尚不清楚。防治污染是竹子組培研究的一大難點。竹類植物擁有特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，表皮細胞外部被密實的乳突和角質(zhì)層所保衛(wèi)，乳突外部存在蠟質(zhì)狀物質(zhì)，乳突中分布著大量的塵埃和菌類孢子，導(dǎo)致難以實現(xiàn)理想的滅菌效果［55］。內(nèi)生菌比較普遍，如何防治成為組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。在對外植體進行消毒處理時，必須全面考量取材部位、時間、消毒劑選擇、消毒時間等因素。