酪蛋白與可溶性大豆多糖的酶促糖基化產(chǎn)物制備及其性能分析

劉郁琪，覃小麗，闞建全，鐘金鋒

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

蛋白質(zhì)和多糖是食品系統(tǒng)中重要的大分子，可以形成穩(wěn)定的水包油乳液，其在保護(hù)親脂化合物不受化學(xué)降解、提高分散性、提高生物利用度等方面具有潛在的應(yīng)用前景。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)能夠吸附在其乳液的油-水界面，通過液滴之間的靜電排斥力來保護(hù)液滴免受物理因素的影響[1]，但是在接近等電點(diǎn)的pH值和高離子強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)乳液表現(xiàn)出不穩(wěn)定狀態(tài)[1-3]，這在一定程度上限制了蛋白質(zhì)在食品乳液方面的應(yīng)用。由于多糖分子在水相中可以形成厚的立體層，提供防止液滴聚集的靜電排斥力[4]，因此，利用多糖-蛋白復(fù)合物制備乳液能有效改善蛋白乳液的物理穩(wěn)定性[5-6]。然而，相較于利用靜電結(jié)合蛋白與多糖，共價(jià)鍵結(jié)合的交聯(lián)產(chǎn)物能夠在較高離子強(qiáng)度和較低pH值下保持穩(wěn)定[5]。因此，研究和發(fā)掘新型功能性質(zhì)的多糖與蛋白質(zhì)復(fù)合物，對(duì)拓展相關(guān)原料在食品工業(yè)中應(yīng)用具有較好的現(xiàn)實(shí)意義。

蛋白質(zhì)和多糖交聯(lián)通常利用干、濕法美拉德反應(yīng)和酶促反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)[6]。目前，傳統(tǒng)的干、濕法美拉德反應(yīng)具有以下缺點(diǎn)：條件難控制、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)物易發(fā)生褐變等[7]。酶法可以在溫和的條件下反應(yīng)，且需要較少的反應(yīng)物和較短的反應(yīng)時(shí)間[7]。除此之外，酶法改性后的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更優(yōu)的功能特性[8-9]，F(xiàn)u Miao等[10]在研究中發(fā)現(xiàn)酶法交聯(lián)后的大豆蛋白持水性提高3 倍、乳化穩(wěn)定性提高10%。酪蛋白是牛乳中優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白，其氨基酸組成合理，能為人類提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但由于其較差的溶解性使得其在食品膠體中的應(yīng)用受限；而可溶性大豆多糖是一種具有強(qiáng)極性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高溶解性的酸性多糖，因此，通過酶催化將可溶性大豆多糖接枝酪蛋白，有望賦予酪蛋白新的性質(zhì)，這對(duì)改善和拓展酪蛋白在食品膠體領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義，而目前相關(guān)研究尚處于起步階段，亟待加強(qiáng)。

本研究利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化酪蛋白和可溶性大豆多糖制備糖基化產(chǎn)物，探索蛋白多糖質(zhì)量比和酶添加量對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)性能、表面形貌的影響，并比較交聯(lián)產(chǎn)物以及單一酪蛋白制備乳液的物理穩(wěn)定性，以期為新型產(chǎn)物在水包油食品乳液方面的應(yīng)用提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、可溶性大豆多糖（純度大于80%） 合肥博美生物科技有限公司；大豆油 益海嘉里食品營(yíng)銷有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（比酶活力100 U/g） 北京索萊寶科技有限公司；溴化鉀（光譜級(jí)） 天津光孚精細(xì)化工研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T18 ULTRA-TURRAX型高速均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；M-110EH-30型高壓微射流 加拿大Microfluidics公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Spectrum100型傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)PerkinElmer公司；DYCZ-24DN型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Zetasizer ZS90型激光粒度儀英國(guó)Malvern公司；Pro10102型掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom World公司；F-2500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 交聯(lián)產(chǎn)物的制備

將酪蛋白與可溶性大豆多糖分別溶解于pH 6.0去離子水中，使其終質(zhì)量濃度均為50 g/L，并加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的疊氮化鈉以抑制微生物生長(zhǎng)，室溫下攪拌過夜后，檢查pH值并再次調(diào)節(jié)至pH 6.0，最終得到蛋白母液和多糖母液。

酪蛋白溶液與可溶性大豆多糖溶液按照不同質(zhì)量比（2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）混合均勻并加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（加酶量0、2、5、10、15、20、25 U/g），于40 ℃下反應(yīng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后高溫滅活，并冷凍干燥后于干燥箱中保存。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）根據(jù)Laemmli[11]的方法進(jìn)行。3 mg/mL的樣品溶液與5×上樣緩沖液混合，沸水浴2 min，取10 μL樣品加到凝膠泳道中。分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%和5%。在80 V的恒壓下進(jìn)行電泳，分離電泳凝膠，振蕩染色后漂洗，拍照。

1.3.3 接枝度的測(cè)定

參考Jiang Shujuan等[12]的方法，采用鄰苯二甲醛（o-phthalic aldehyde，OPA）法測(cè)定接枝度。200 μL 5 mg/mL的樣品溶液中加入4 mL OPA試劑，混合均勻，35 ℃水浴2 min，在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以O(shè)PA試劑為空白對(duì)照。根據(jù)賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中游離氨基含量，并用式（1）計(jì)算接枝度。

式中：ρ0為反應(yīng)前體系中游離氨基酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρ1為反應(yīng)后體系中游離氨基酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.4 褐變指數(shù)和中間產(chǎn)物含量的測(cè)定

參考Sun Yuanxia等[13]的方法，測(cè)定交聯(lián)產(chǎn)物在420 nm和294 nm波長(zhǎng)處吸光度，以A420nm表征反應(yīng)的褐變指數(shù)，以A294nm表征中間產(chǎn)物的含量。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Sang Luyan等[14]的方法，采用溴化鉀壓片法，試樣與KBr質(zhì)量比為1∶100，掃描范圍4 000～400 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，掃描32 次。

1.3.6 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

參考朱小燕等[15]的方法進(jìn)行內(nèi)源熒光的測(cè)定。在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm條件下得到300～500 nm之間的發(fā)射光譜，狹縫5 nm。

1.3.7 溶解度的測(cè)定

根據(jù)王魯慧等[16]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)溶解度。將10 mg/mL的蛋白溶液以9 690×g離心10 min，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白含量，以酪蛋白作為對(duì)照組。溶解度表示為上清液中蛋白與總蛋白的含量比。

1.3.8 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參考范宏亮等[17]的方法測(cè)定乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）。樣品溶液（1 mg/mL）與體積分?jǐn)?shù)25%的大豆油10 000 r/min高速均質(zhì)1 min后，分別在0 min和10 min時(shí)取樣50 μL，用0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）SDS溶液稀釋100 倍，以0.1% SDS為空白對(duì)照，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。分別按照公式（2）、（3）計(jì)算EAI與ESI。

式中：V為稀釋倍數(shù)；ρ為樣品質(zhì)量濃度/（g/mL）；d 為比色池光徑/c m；φ 為乳狀液中油相體積分?jǐn)?shù)（25%）；A0為0 min時(shí)吸光度；A10為10 min時(shí)吸光度。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

干粉樣品在雙面碳素磁帶上鍍金，用掃描電子顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行表面形貌分析，電壓為10 kV。

1.3.10 乳液穩(wěn)定性分析

1.3.10.1 乳液制備

參考Pearce等[18]的方法，進(jìn)行乳液穩(wěn)定性測(cè)定。在磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L、pH 7.0）中溶解（10 mg/mL）交聯(lián)產(chǎn)物，將體積分?jǐn)?shù)10%的玉米油與體積分?jǐn)?shù)90%的水相20 000 r/min高速均質(zhì)3 min得粗乳液。粗乳液在50 MPa壓力下經(jīng)過高壓微射流循環(huán)7 次得到細(xì)乳液。以酪蛋白乳液作為對(duì)照試樣。

1.3.10.2 乳液在不同環(huán)境下的物理穩(wěn)定性分析

參考Qin Xiaoli等[19]的方法，乳液調(diào)至不同的pH值（3.0～7.0），室溫靜置24 h，添加以新鮮制備的乳液作為對(duì)照（Control）；乳液（10 mL、pH 7.0）在不同溫度（25、60、80、90 ℃）下水浴30 min，室溫下冷卻；10 mL、pH 7的乳液調(diào)節(jié)至不同的鹽濃度（Na+濃度分別為0、200、600、1 000 mmol/L，Ca2+濃度分別為0、5、10、20 mmol/L），室溫下靜置24 h，記錄乳液粒徑和ζ-電位的變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品各指標(biāo)平行測(cè)定3 次，樣品平行測(cè)定兩次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05時(shí)表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白與可溶性大豆多糖酶促糖基化產(chǎn)物制備分析結(jié)果

2.1.1 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)接枝度的影響

圖1顯示在酶添加量10 U/g下，酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)反應(yīng)接枝度的影響。隨著多糖含量的增加，接枝度呈先增后減的趨勢(shì)。在質(zhì)量比為1∶1時(shí)接枝度達(dá)到最高，接枝度由17.9%增大至20.7%；當(dāng)質(zhì)量比為1∶3時(shí)接枝度僅有17.1%，這可能是過量的多糖和酪蛋白相互作用，抑制蛋白膠束解離[20]，或過量的多糖會(huì)產(chǎn)生空間位阻，使反應(yīng)不易發(fā)生[21]。

圖1 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)接枝度的影響Fig. 1 Effect of mass ratio of casein to soluble soybean polysaccharide on the degree of glycosylation

2.1.2 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)褐變指數(shù)和中間產(chǎn)物含量的影響

圖2 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)反應(yīng)褐變指數(shù)和中間產(chǎn)物含量的影響Fig. 2 Effect of mass ratio of casein to soluble soybean polysaccharide on browning index and intermediate content

在酶添加量10 U/g條件下，酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)褐變指數(shù)和中間產(chǎn)物含量的影響如圖2所示。美拉德反應(yīng)的高級(jí)階段會(huì)產(chǎn)生在420 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收的類黑精。隨著可溶性大豆多糖質(zhì)量的增加，褐變指數(shù)逐漸增加，在質(zhì)量比為1∶1時(shí)，A420nm達(dá)到0.543，較單一的可溶性大豆多糖和酪蛋白褐變指數(shù)分別提升了95.9%、16.4%，但隨著可溶性大豆多糖質(zhì)量繼續(xù)增加，褐變指數(shù)略微下降，這可能是由于多余的糖造成空間位阻，使得反應(yīng)進(jìn)程減慢[22]。294 nm波長(zhǎng)處的吸光度主要反映蛋白質(zhì)在糖基化過程中產(chǎn)生的無色中間產(chǎn)物含量[20,23]。隨著多糖質(zhì)量的增加，中間產(chǎn)物含量逐漸增大的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量比為1∶1時(shí)，A294nm為0.915，較單一可溶性大豆多糖和酪蛋白分別提升了40.7%、18.6%。

2.1.3 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)酪蛋白溶解度的影響

圖3為在酶添加量10 U/g的條件下，酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)酪蛋白溶解性的影響。在質(zhì)量比為1∶1的時(shí)候，接枝度最大，同時(shí)產(chǎn)物的溶解性也最高，為63.9%，較單一酪蛋白增長(zhǎng)了16.7%。這是可能是因?yàn)橐环矫嬖诳臻g結(jié)構(gòu)上多糖保護(hù)酪蛋白，蛋白分子的聚集減少；另一方面多糖的羥基增加了蛋白質(zhì)分子中的親水基團(tuán)，從而促進(jìn)蛋白水合作用，蛋白溶解性增加[24]。

圖3 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)酪蛋白溶解度的影響Fig. 3 Effect of mass ratio of casein to soluble soybean polysaccharide on casein solubility

2.1.4 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)酪蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

圖4 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)酪蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of mass ratio of casein to soluble soybean polysaccharide on the emulsifying activity index (EAI) and emulsifying stability index (ESI) of casein

圖4反映了酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比對(duì)酪蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響。隨著可溶性大豆多糖質(zhì)量的增加，乳化活性和乳化穩(wěn)定性都呈先增后減的趨勢(shì)。單一的酪蛋白的EAI為116 m2/g，ESI為16.9 min。酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比為1∶2時(shí)EAI最大，為138 m2/g；質(zhì)量比為1∶1時(shí)ESI最大，為33.8 min。在油-水界面，多糖增加蛋白空間位阻，利于形成親-疏水平衡，交聯(lián)物吸附在油水界面形成緊密的保護(hù)層，從而阻止了油滴的聚集，Xu Jing等[25]得到類似結(jié)果。但當(dāng)可溶性大豆多糖含量繼續(xù)增加時(shí)，交聯(lián)產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性逐漸下降，其中當(dāng)酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比為1∶3時(shí)，EAI降低至124 m2/g，ESI為19.9 min。這可能是因?yàn)榻Y(jié)合在蛋白分子上多糖數(shù)量過多時(shí)，交聯(lián)產(chǎn)物會(huì)空間阻礙或者是過于親水，從而在界面吸附能力下降，導(dǎo)致其作為乳化劑的功能減弱[24]。

2.1.5 酶添加量對(duì)接枝度的影響

根據(jù)酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比的乳化穩(wěn)定性結(jié)果，選定乳化穩(wěn)定性最優(yōu)的蛋白與多糖質(zhì)量比1∶1，基于此探究酶添加量對(duì)接枝度的影響。如圖5所示，接枝度隨著酶添加量的增加而增大，當(dāng)酶添加量為25 U/g時(shí)，接枝度達(dá)到最大，為27.2%，較酶添加量為2 U/g時(shí)接枝度增大了10.8%。

圖5 酶添加量對(duì)接枝度的影響Fig. 5 Effect of transglutaminase concentration on the degree of glycosylation

2.1.6 酶添加量對(duì)褐變指數(shù)和中間產(chǎn)物含量的影響

圖6 酶添加量對(duì)反應(yīng)褐變指數(shù)和中間產(chǎn)物含量的影響Fig. 6 Effect of transglutaminase concentration on browning index and intermediate content

在酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比為1∶1的條件下，酶添加量對(duì)反應(yīng)褐變指數(shù)和中間產(chǎn)物含量的影響如圖6所示。當(dāng)酶添加量為20 U/g時(shí)，產(chǎn)物的褐變指數(shù)和中間產(chǎn)物含量最大，其中A420nm為0.560，A294nm為0.928，而單一的酪蛋白和可溶性大豆多糖的A420nm分別僅為0.454、0.022，同時(shí)A294nm分別為0.745、0.543，交聯(lián)產(chǎn)物的褐變程度較單一的酪蛋白和可溶性大豆多糖有不同程度的提高；而當(dāng)酶添加量高于20 U/g時(shí)，褐變指數(shù)降低，這可能是因?yàn)檫^量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶會(huì)促進(jìn)酪蛋白進(jìn)一步自身交聯(lián)，使得酪蛋白的自由氨基減少[26]。

2.1.7 酶添加量對(duì)酪蛋白溶解度的影響

在酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比為1∶1的條件下，酶添加量對(duì)酪蛋白溶解度的影響如圖7所示。隨著反應(yīng)中酶添加量的增加，蛋白的溶解度呈先增后減的趨勢(shì)。在酶添加量為5 U/g時(shí)，產(chǎn)物的溶解度最高，為67.0%，酶添加量繼續(xù)升高時(shí)，溶解度逐漸降低。在酶添加量為25 U/g時(shí)，溶解度下降至53.8%，這可能是由于酪蛋白被過量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)一步酶解后，酪蛋白發(fā)生自身交聯(lián)，疏水基團(tuán)暴露過多，從而導(dǎo)致蛋白自身相互作用增加，發(fā)生聚集和沉淀，溶解度下降[18-19]。

圖7 酶添加量對(duì)酪蛋白溶解度的影響Fig. 7 Effect of transglutaminase concentration on casein solubility

2.1.8 酶添加量對(duì)酪蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

圖8 酶添加量對(duì)酪蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 8 Effect of transglutaminase concentration on the EAI and ESI of casein

圖8反映了酶添加量處理下酪蛋白-可溶性大豆多糖交聯(lián)產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性的變化。酶添加量由2 U/g升至25 U/g時(shí)，乳化活性呈逐漸增加的趨勢(shì)，乳化穩(wěn)定性呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)酶添加量為5 U/g時(shí)，ESI最大，為37.6 min。當(dāng)酶添加量為25 U/g時(shí)，交聯(lián)產(chǎn)物的EAI為134 m2/g，ESI較最優(yōu)值下降9.82 min，這可能是由于蛋白自身交聯(lián)降低了靜電斥力，不能形成緊密的油-水界面保護(hù)膜，油滴聚集或?qū)酉喾蛛x[15]。

2.2 交聯(lián)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)性能分析結(jié)果

2.2.1 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比以及酶添加量對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物傅里葉紅外光譜的影響

傅里葉變換紅外光譜可以檢測(cè)反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)也可進(jìn)一步說明交聯(lián)產(chǎn)物的生成。如圖9所示，酪蛋白分別在1 648、1 531、1 237 cm-1處有C＝O鍵伸縮振動(dòng)（酰胺I帶）、C—N鍵伸縮（酰胺II帶）、N—H鍵振動(dòng)（酰胺III帶），氨基酸殘基變化可引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。1 070 cm-1處是糖分子中C—O—C伸縮振動(dòng)的典型特征峰[15,27]，研究發(fā)現(xiàn)交聯(lián)產(chǎn)物在1 070 cm-1左右處有強(qiáng)烈的吸收峰，但是酪蛋白在此處無吸收峰，這可能說明接枝反應(yīng)導(dǎo)致酪蛋白側(cè)鏈振動(dòng)。波數(shù)3 600～3 000 cm-1處的吸收峰是糖分子內(nèi)或分子間—OH的伸縮振動(dòng)所引起，相較于酪蛋白、可溶性大豆多糖和混合物來說，所有交聯(lián)產(chǎn)物在3 600～3 000 cm-1處吸收峰變寬，這可能說明酪蛋白和可溶性大豆多糖發(fā)生交聯(lián)，引入較多—OH[28]。酪蛋白樣品中881 cm-1處的吸收峰在交聯(lián)產(chǎn)物中消失，以及在交聯(lián)產(chǎn)物中922（圖9A）、918（圖9B）cm-1處吸收峰強(qiáng)度增大，這說明可溶性大豆多糖接枝到酪蛋白上[18]。

圖9 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比（A）和酶添加量（B）對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物傅里葉變換紅外光譜的影響Fig. 9 Effect of mass ratio of casein to soluble soybean polysaccharide (A)and transglutaminase concentration (B) on FTIR spectrum of cross-linked product

2.2.2 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比以及酶添加量對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物內(nèi)源熒光光譜的影響

圖10 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比（A）和酶添加量（B）對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物內(nèi)源熒光光譜的影響Fig. 10 Effect of mass ratio of casein to soluble soybean polysaccharide (A)and transglutaminase concentration (B) on endogenous fluorescence spectrum of cross-linked product

酪蛋白和可溶性大豆多糖交聯(lián)產(chǎn)物內(nèi)源熒光光譜如圖10所示。糖基化反應(yīng)過程中產(chǎn)生具有熒光特性的化合物，一般用熒光強(qiáng)度來反映糖基化的程度[29]。在圖10A中，初期隨著美拉德反應(yīng)中糖質(zhì)量的增加，熒光強(qiáng)度不斷降低，這與Zha Fengchao等[22]的研究結(jié)果相似。其中，當(dāng)質(zhì)量比為1∶1時(shí)，熒光強(qiáng)度最低，變化趨勢(shì)和接枝度、褐變指數(shù)和中間產(chǎn)物含量相同，此結(jié)果可能是糖鏈對(duì)蛋白造成了屏蔽作用，從而使得熒光強(qiáng)度變低[26]。如圖10B所示，相較于單一酪蛋白，當(dāng)酶添加量小于10 U/g時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸降低；酶添加量高于10 U/g后，熒光強(qiáng)度有略微的升高，這可能是由于過量的酶可以進(jìn)一步催化酪蛋白進(jìn)行自身交聯(lián)，導(dǎo)致色氨酸暴露，使得熒光強(qiáng)度變高。

2.2.3 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比以及酶添加量對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳的影響

SDS-PAGE通常用來反映美拉德反應(yīng)中多糖-蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物的形成，同時(shí)可以說明產(chǎn)物分子質(zhì)量的變化。酪蛋白含有αs、β、κ、γ 4 種類型，其中αs-酪蛋白、β-酪蛋白分別占50%、35%，分子質(zhì)量分別為27、24 kDa[28]。當(dāng)交聯(lián)產(chǎn)物形成時(shí)，濃縮、分離膠交界處顯示染色帶或者在分離膠中顯示拖尾條帶[18]。

圖11 酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比（A）和酶添加量（B）對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳的影響Fig. 11 Effect of mass ratio of casein to soluble soybean polysaccharide (A)and transglutaminase concentration (B) on SDS-PAGE pattern of cross-linked product

由圖11可以看出，酪蛋白經(jīng)過酶促糖基化交聯(lián)修飾后，酪蛋白-可溶性大豆多糖有大分子交聯(lián)物形成，其進(jìn)入分離膠速度較慢從而停留在濃縮、分離膠交界處（圖11A中泳道3～6、圖11B中泳道2～7），Bi Binwei等[30]也有類似的發(fā)現(xiàn)，酪蛋白和可溶性大豆多糖混合物的染色結(jié)果顯示，在交界處未出現(xiàn)大分子產(chǎn)物，只有酪蛋白的特征亞基條帶（圖11A中泳道7～10、圖11B中泳道9）。

2.2.4 酪蛋白-可溶性大豆多糖交聯(lián)產(chǎn)物的表觀結(jié)構(gòu)

如圖12所示，利用掃描電子顯微鏡觀察了交聯(lián)產(chǎn)物的表觀形貌。光滑球狀結(jié)構(gòu)（圖12A）和不規(guī)則、多角片層形（圖12B）主要分別表現(xiàn)在酪蛋白和可溶性大豆多糖中，其中如圖12A局部圖所示，酪蛋白凹陷的表面結(jié)構(gòu)使得其傾向于在水性模型系統(tǒng)中聚集，導(dǎo)致溶解度降低，Zhong Lei等[31]曾報(bào)道過類似的微觀形貌。酪蛋白和可溶性大豆多糖的混合物結(jié)構(gòu)多呈現(xiàn)蜂窩狀的片層結(jié)構(gòu)（圖12C）。由圖12D及其局部放大圖可知，交聯(lián)產(chǎn)物表面結(jié)構(gòu)變得比單一的酪蛋白更松散、多孔，這是一種非均勻的混合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，該結(jié)果與先前Zha Fengchao等[22]的發(fā)現(xiàn)類似，這可能說明酪蛋白與可溶性大豆多糖分子牢固結(jié)合，形成不均勻結(jié)構(gòu)，這種表面形態(tài)還可以促進(jìn)交聯(lián)物與水的相互作用，從而增加酪蛋白的溶解度。

2.3 環(huán)境因素對(duì)酪蛋白-可溶性大豆多糖交聯(lián)產(chǎn)物的納米乳液粒徑和ζ-電位的影響

2.3.1 pH值

圖13 pH值對(duì)乳液粒徑（A）和ζ-電位（B）的影響Fig. 13 Effect of pH on the particle size (A) and ζ-potential (B) of emulsions stabilized with casein or its conjugate with soluble soybean polysaccharide

酪蛋白-可溶性大豆多糖交聯(lián)產(chǎn)物穩(wěn)定乳液在不同pH值下的粒徑、ζ-電位變化如圖13所示。在pH值為4時(shí)，酪蛋白乳液中出現(xiàn)了層相分離，其粒徑比交聯(lián)產(chǎn)物乳液大，但在pH 3～7下，交聯(lián)產(chǎn)物乳液中都未出現(xiàn)層相分離。交聯(lián)產(chǎn)物乳液在較低pH值（3～4）下穩(wěn)定性提高，這可能是液滴間存在更大的空間位阻，抵消了范德華力的吸引作用，從而防止混凝[31]。在酪蛋白穩(wěn)定乳液中，當(dāng)pH值低于6時(shí)，交聯(lián)產(chǎn)物乳液的液滴ζ-電位絕對(duì)值增加，這可能是由于可溶性大豆多糖上的去質(zhì)子化羧酸基團(tuán)補(bǔ)償pH值下降時(shí)H+的增加[19,32]。

2.3.2 熱加工

圖14為熱處理對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物乳液粒徑和ζ-電位的影響。不同溫度（25～90 ℃）處理下，酪蛋白納米乳液的粒徑無顯著變化，也無分層現(xiàn)象，這說明酪蛋白乳液具有良好的熱穩(wěn)定性。交聯(lián)產(chǎn)物乳液高溫處理后，粒徑雖然略微增大，但仍然是穩(wěn)定均勻的，這可能是在加熱過程中部分蛋白質(zhì)變性，從而從乳液中解吸出[32]。交聯(lián)產(chǎn)物的穩(wěn)定乳液ζ-電位絕對(duì)值遠(yuǎn)高于單一酪蛋白乳液，這可能是因?yàn)榻宦?lián)產(chǎn)物可以在中性條件下阻斷電離的胺基團(tuán)。蛋白質(zhì)分子周圍的凈電荷以及交聯(lián)物吸附層厚度增加將促進(jìn)液滴之間的靜電和空間排斥，使熱處理時(shí)乳液穩(wěn)定性提高[19,32]。

圖14 溫度對(duì)乳液粒徑（A）和ζ-電位（B）的影響Fig. 14 Effect of temperature on the particle size (A) and ζ-potential (B)of emulsions stabilized with casein or its conjugate with soluble soybean polysaccharide

2.3.3 離子強(qiáng)度

圖15 Na和Ca2對(duì)乳液粒徑（A、C）和ζ-電位（B、D）的影響Fig. 15 Effect of Na+ and Ca2+ on the particle size (A and C) and ζ-potential (B and D) of emulsions stabilized with casein or its conjugate with soluble soybean polysaccharide

不同鹽濃度對(duì)酪蛋白-大豆蛋白交聯(lián)產(chǎn)物在pH7.0下穩(wěn)定的乳劑粒徑和ζ-電位的影響如圖15所示。交聯(lián)產(chǎn)物乳液的液滴粒徑增加，這可能是蛋白質(zhì)在水-油界面處結(jié)合更多可溶性大豆多糖分子，平均回轉(zhuǎn)半徑增加[31]。在Na+存在情況下，酪蛋白乳液和交聯(lián)產(chǎn)物乳液都未出現(xiàn)層相分離，粒徑較小，乳液相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)Na+濃度高于600 mmol/L時(shí)，ζ-電位絕對(duì)值降低，交聯(lián)產(chǎn)物的ζ-電位趨勢(shì)較酪蛋白的平緩。在Ca2+存在的情況下，酪蛋白乳液在Ca2+濃度為10～20 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)層相分離。相反的是，交聯(lián)產(chǎn)物的乳液相對(duì)穩(wěn)定，未出現(xiàn)層相分離現(xiàn)象，粒徑?jīng)]有顯著性差異，ζ-電位變化較酪蛋白乳液的平緩。這可能是由于蛋白多糖交聯(lián)使靜電斥力和空間位阻的增強(qiáng)，有效地提高了乳液的耐鹽性，同時(shí)鹽離子增加了液滴之間的范德華力吸引的相互作用[20,32]。

3 結(jié) 論

本研究探討了蛋白與多糖質(zhì)量比和酶添加量對(duì)酶促糖基化反應(yīng)的影響。交聯(lián)產(chǎn)物的SDS-PAGE、傅里葉變換紅外光譜和內(nèi)源熒光光譜均能反映酪蛋白與可溶性大豆多糖通過酶促糖基化反應(yīng)接枝，交聯(lián)產(chǎn)物的溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性明顯優(yōu)于單一酪蛋白。在酪蛋白與可溶性大豆多糖質(zhì)量比為1∶1、酶添加量為5 U/g的條件下，接枝度達(dá)到19.9%，乳化穩(wěn)定性最優(yōu)，為37.6 min，溶解度提高了19.8%。酪蛋白-可溶性大豆多糖乳液較單一酪蛋白乳液具有更高的靜電斥力和空間位阻，因而交聯(lián)產(chǎn)物乳液可在低pH值、高溫、強(qiáng)鹽離子濃度的情況下保持穩(wěn)定狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)研究了酪蛋白-可溶性大豆多糖交聯(lián)產(chǎn)物的制備與性能，并將交聯(lián)產(chǎn)物制備水包油乳液，對(duì)改善酪蛋白乳化性能，提高酪蛋白-可溶性大豆多糖水包油乳液的物理穩(wěn)定性具有一定參考意義。