基于生物信息學(xué)定向制備檸條籽蛋白抗氧化肽的工藝優(yōu)化

頡 宇，胡錦靈，趙宏飛，張柏林

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

活性肽的商業(yè)化應(yīng)用與其制備有很大關(guān)系，取決于蛋白原料的選擇和蛋白酶的篩選[1-3]。作為一種生物活性肽，抗氧化肽的研究報道很多?；诳寡趸臉?gòu)效關(guān)系的研究表明，酸性氨基酸與抗氧化肽減緩油脂氧化顯著相關(guān)[4-6]。因此，選擇適宜的富含酸性氨基酸的蛋白原料，并確定適宜的蛋白酶類型，可以有目的地制備減緩油脂氧化的抗氧化肽。

檸條是豆科錦雞兒屬植物栽培種的統(tǒng)稱[7]，主要分布亞洲和歐洲的干旱和半干旱地區(qū)，我國大約有70多種，遍布東北、華北和西北地區(qū)，種植面積超過上億畝[8-9]。檸條根系粗壯發(fā)達，能夠有效控制土地荒漠化，是我國三北地區(qū)重要的生態(tài)保護植物[10]；檸條籽年產(chǎn)量約292.5 kg/hm2，蛋白質(zhì)含量為35.5%[11-12]，其蛋白質(zhì)富含谷氨酸和天冬氨酸[13]，因此，檸條籽可以作為酸性氨基酸蛋白原料的重要來源之一。

生物信息學(xué)是用于管理、規(guī)劃和解釋與生物系統(tǒng)相關(guān)信息的計算方法，它利用各種數(shù)據(jù)庫，在線工具和軟件等獲取目標(biāo)功能[14]。BIOPEP是一個由波蘭Warmia Mazury大學(xué)開發(fā)的軟件工具，它不僅是一個包含蛋白質(zhì)序列、生物活性肽和敏感肽的數(shù)據(jù)庫，而且也內(nèi)置了預(yù)測程序，可以幫助預(yù)測水解蛋白酶的酶切位點[15]。因此，本實驗以檸條籽為酸性氨基酸蛋白來源，通過借助BIOPEP篩選適合的蛋白酶類型，從選定的蛋白原料中篩選抗氧化肽，形成一種新的抗氧化肽制備工藝，以期研究定向制備延緩油脂氧化抗氧化肽的新工藝和新策略，為推動抗氧化肽產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供創(chuàng)新性的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸條籽采自內(nèi)蒙古赤峰市，自然風(fēng)干后粉碎過篩，靜置備用。四硼酸鈉、十二烷基磺酸鈉（sodium laurylsulfonate，SDS）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、絲氨酸、吐溫-20、特丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、硫氰酸氨、過硫酸鉀、鐵氰化鉀（均為分析純） 北京化學(xué)試劑公司；蛋白Marker SM1811 美國Thermo Fisher公司；木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、二硫蘇糖醇、亞油酸均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6紫外-可見分光光度計 新世紀(jì)北京市普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴 金壇市榮華儀器制造有限公司；TGL-16G臺式高速離心機 上海市菲恰爾分析儀器有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機上海市安亭科學(xué)儀器廠；FD-1冷凍干燥機 北京市德天佑科技發(fā)展有限公司；PowerPac Basic電泳儀 美國伯樂公司；PHS-3C pH計 上海市儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海市森信實驗儀器有限責(zé)任公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 檸條籽的營養(yǎng)成分測定

水分測定采用GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》第一法；灰分測定參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；蛋白質(zhì)測定參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法；脂肪測定參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》第一法；碳水化合物測定按GB 28050—2011《預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》；氨基酸測定參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

1.3.2 檸條籽蛋白的提取

將檸條籽脫皮、去脂并烘干至質(zhì)量恒定，粉碎過篩，靜置備用。參照Osborne法[16]用H2O、10% NaCl、70%乙醇溶液、0.2% NaOH溶液分別提取檸條籽中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，將提取得到的各類蛋白冷凍干燥保存?zhèn)溆谩Ａ硗夥Q取脫脂檸條籽粉，采用堿提酸沉法[17]，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至9.0，隨后置于70 ℃恒溫水浴1 h；離心取上清液，用0.1 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)至4.0，隨后靜置0.5 h；再次離心取沉淀，將沉淀物清洗至pH 7.0后，經(jīng)過冷凍干燥后即得產(chǎn)物檸條籽蛋白。

1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

將檸條籽清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白及堿提酸沉所得檸條籽蛋白樣品分別用蒸餾水溶解為1 mg/mL的溶液。分別取各蛋白溶液以5∶1（V/V）加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，離心取上清液，進行15% SDSPAGE。電泳條件：恒流14 mA，電泳時間90 min；考馬斯亮藍染色。蛋白Marker為SM1811。

1.3.4 蛋白酶的確定

采用BIOPEP（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep#opennewwindow）對已知蛋白進行計算機虛擬水解，以篩選檸條籽蛋白的水解蛋白酶。實驗以谷蛋白作為檸條籽蛋白的生物信息模板，在BIOPEP數(shù)據(jù)庫內(nèi)搜索已知谷蛋白序列5 條，并利用數(shù)據(jù)庫中內(nèi)置軟件對其進行在線虛擬水解，即選擇木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）、胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）、胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）、V-8蛋白酶（EC 3.4.21.19）、木瓜蛋白酶＋V-8蛋白酶分別對5 條谷蛋白序列虛擬水解，內(nèi)置軟件經(jīng)計算自動得出各蛋白酶相應(yīng)的水解度，選取結(jié)果中水解度較高的蛋白酶進行后續(xù)實驗。

1.3.5 多肽質(zhì)量濃度測定

檸條籽蛋白水解物中多肽質(zhì)量濃度的測定采用雙縮脲法[18]。稱取樣品10 mg，定容至10 mL，取2.5 mL樣品溶液，加入2.5 mL 0.1 mg/mL的三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置20 min，3 500 r/min離心10 min。取1.0 mL上清液于試管，加入雙縮脲試劑3.0 mL，混合均勻后在60 ℃水浴中顯色5 min，2 000 r/min離心10 min。取上清液于310 nm波長處測定OD值，可得樣品溶液中的多肽質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.6 水解度測定

水解度測定采用OPA法[19]。將0.4 mL的檸條籽蛋白水解物溶液加入到3 mL OPA試劑中，混勻并靜置2 min，用紫外-可見分光光度計在340 nm波長處測定OD值，記為OD樣品。以超純水和0.1 mg/mL的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品溶液分別作為空白組和標(biāo)準(zhǔn)組，其340 nm波長處的OD值分別記為OD空白和OD標(biāo)準(zhǔn)。絲氨酸的氨基當(dāng)量（Ser（NH2））和水解度值計算如下：

式中：0.951 6為絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/（mmol/L）；C樣品為樣品溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；α、β、htot為常數(shù)，谷蛋白中的常數(shù)值分別為α=1.0、β=0.4、htot=8.0[19]。

1.3.7 蛋白水解物抑制亞油酸能力測定

以抑制亞油酸氧化能力作為評價檸條籽蛋白水解物的抗氧化指標(biāo)。抑制亞油酸氧化的測定采用硫氰酸鐵法[20]。首先取亞油酸和等量的吐溫-20，用磷酸緩沖溶液定容至50 mL制得亞油酸乳化液；然后將未加入檸條籽蛋白水解物和加入檸條籽蛋白水解物的亞油酸乳化液分別置于37 ℃進行氧化。取上述氧化液各0.1 mL，分別加入4.7 mL 75%乙醇溶液，0.1 mL 3.9 mol/L硫氰酸銨和0.1 mL 0.02 mol/L硫酸亞鐵（溶于0.1 mol/L HCl溶液），室溫下放置3 min，在500 nm波長下測定OD值。亞油酸氧化抑制率按式（3）計算：

1.3.8 水解條件單因素試驗

1.3.8.1 溫度的選擇

將5 份等量檸條籽蛋白樣品分別用蒸餾水溶解，90 ℃預(yù)處理5 min，加入2%的蛋白酶并將其pH值調(diào)至7.0，分別在35、45、55、65、75 ℃酶解1 h，在80 ℃滅酶15 min，然后離心取上清液，冷凍干燥后備用。

1.3.8.2 pH值的選擇

將5 份等量檸條籽蛋白樣品分別用蒸餾水溶解，90 ℃預(yù)處理5 min，加入2%的蛋白酶并將pH值分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，然后在55 ℃酶解1 h，在80 ℃滅酶15 min，離心取上清液，冷凍干燥后備用。

1.3.8.3 時間的選擇

將5 份等量檸條籽蛋白樣品分別用蒸餾水溶解，90 ℃預(yù)處理5 min，加入2%的蛋白酶并將pH值調(diào)至7.0，在55 ℃分別酶解1、2、3、4、5 h，然后80 ℃滅酶15 min，離心取上清液，冷凍干燥后備用。

1.3.8.4 蛋白酶添加量（酶與底物比）的選擇

將5 份等量檸條籽蛋白樣品分別用蒸餾水溶解，90 ℃預(yù)處理5 min，分別加入1%、2%、3%、4%、5%的蛋白酶并將其pH值調(diào)至7.0，在55 ℃酶解1 h，然后80 ℃滅酶15 min，離心取上清液，冷凍干燥后備用。

1.3.9 水解條件正交試驗

為研究不同水解溫度、pH值、水解時間、酶添加量對檸條籽蛋白水解效果的影響，以選擇最佳水解工藝條件，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行4因素3水平正交試驗，為得到的酶解產(chǎn)物是具有較強抗油脂氧化能力的小分子質(zhì)量短肽，而不只是單純地追求高水解度指標(biāo)，以亞油酸氧化抑制率為正交指標(biāo)，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in orthogonal array design

1.3.10 質(zhì)譜鑒定多肽序列

以篩選所得蛋白酶，配合確定的水解條件，水解檸條籽蛋白，水解物超濾至3 kDa，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，進行多肽序列的測定，將采集到的原始數(shù)據(jù)用De Novo軟件進行分析、鑒定序列。序列采集采用高效液相色譜儀，色譜柱采用C18（75 μm×15 cm）。采用流動相A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-80%乙腈溶液，進行梯度洗脫（表2）。質(zhì)譜條件為噴霧電壓2.1 kV；毛細管溫度320 ℃；母離子掃描范圍m/z350～1 550；子離子掃描m/z110。

表2 多肽序列測定色譜梯度Table 2 Gradient elution program for HPLC determination of peptide sequence

1.3.11 檸條籽抗氧化肽油脂抗氧化評價

為驗證計算機輔助定向制備檸條籽抗氧化肽新工藝的可行性，從質(zhì)譜鑒定的檸條籽多肽序列中選取含有活性片段的檸條籽抗氧化肽進行驗證，以抑制亞油酸氧化能力作為評價檸條籽抗氧化肽抗油脂氧化指標(biāo)，以商業(yè)抗氧化劑TBHQ為對照。將加入1 mg/mL檸條籽抗氧化肽和加入1 mg/mL TBHQ的亞油酸乳化液分別置于37 ℃進行氧化。各取氧化液0.1 mL，分別與4.7 mL 75%乙醇溶液、0.1 mL 3.9 mol/L硫氰酸銨溶液和0.1 mL 0.02 mol/L硫酸亞鐵溶液（溶于0.1 mol/L HCl溶液）混合，室溫下放置3 min，在500 nm波長下測定OD值，按式（3）計算抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3 次平行測定結(jié)果的平均值。Microsoft Office Excel 2010軟件用于數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸條籽主要營養(yǎng)成分

表3 檸條籽的主要營養(yǎng)成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Main nutrient components and their contents in Caragana seeds%

如表3所示，檸條籽的蛋白質(zhì)和碳水化合物含量較為豐富，灰分含量較少。與大豆主要營養(yǎng)成分的含量相比，檸條籽的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物含量均與大豆相似，大豆的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為40%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為18%～22%，碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%～35%[21]。由此看來，檸條籽可效仿大豆進行開發(fā)，提供豐富的蛋白資源。

檸條籽蛋白的分子質(zhì)量集中分布于10～70 kDa之間（圖1），由檸條籽中分離所得的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白，4 種類型蛋白與檸條籽蛋白分布相同，其中谷蛋白的分子質(zhì)量分布與檸條籽蛋白最為貼合，因此可以得出谷蛋白是檸條籽蛋白的主要蛋白類型。谷蛋白中以谷氨酸含量最為豐富[22]，通過測定檸條籽蛋白中的氨基酸組成及含量（表4），證實了谷氨酸和天冬氨酸是其含量最高的2 種氨基酸，分別為4.4%和2.5%，說明檸條籽蛋白是制備富含酸性氨基酸抗氧化肽的理想蛋白原料。

圖1 檸條籽蛋白及各組分蛋白的分子質(zhì)量分布Fig.1 Molecular mass distribution of Caragana seed protein components

表4 檸條籽蛋白的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of Caragana seed protein

2.2 水解酶的選擇

谷蛋白富含酸性氨酸，且是檸條籽蛋白主要蛋白類型，因此，本研究以谷蛋白作為檸條籽蛋白的生物信息模板，在BIOPEP數(shù)據(jù)庫內(nèi)搜索已知谷蛋白序列5 條，并選擇木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、V-8蛋白酶、木瓜蛋白酶＋V-8蛋白酶分別對5 條谷蛋白序列虛擬水解，選取水解度較高的蛋白酶水解檸條籽蛋白。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶均為水解植物蛋白時常用的蛋白酶。通過表5可以看出，木瓜蛋白酶對幾種谷蛋白的水解度均超過40%，而胃蛋白酶、胰蛋白酶的水解度平均為10%。這是由于木瓜蛋白酶具有更廣泛的水解位點，根據(jù)BIOPEP的數(shù)據(jù)，木瓜蛋白酶的酶切位點主要是蛋白N端的谷氨酰胺和丙氨酸，蛋白C端的精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸及蘇氨酸；胃蛋白酶主要作用于蛋白C端的苯丙氨酸和亮氨酸；胰蛋白酶切割位點為蛋白C端的賴氨酸和精氨酸。所以，木瓜蛋白酶的水解度較其他兩個蛋白酶更高一些，本實驗將選用木瓜蛋白酶作為主要蛋白酶來水解檸條籽蛋白。

為制備富含酸性氨基酸的抗氧化肽，實驗還選取了酶切位點為蛋白C端谷氨酸和天冬氨酸的V-8蛋白酶，與木瓜蛋白酶共同水解檸條籽蛋白。經(jīng)在線軟件虛擬水解，木瓜蛋白酶與V-8蛋白酶復(fù)合對水解度的提高影響不大（表5）。

表5 不同蛋白酶對谷蛋白水解度Table 5 Hydrolysis degrees of gluten by different proteases%

為驗證數(shù)據(jù)庫軟件模擬結(jié)果并確定V-8蛋白酶的添加量，將V-8蛋白酶以0%的添加量為起始，與木瓜蛋白酶進行復(fù)配，以10%為增加幅度，不斷增加添加量至與木瓜蛋白酶等量即50%，對檸條籽蛋白進行水解，所得的水解度、蛋白水解物的亞油酸氧化抑制率如圖2所示。

圖2 水解度及亞油酸氧化抑制率隨V-8蛋白酶占比的變化趨勢Fig.2 Effect of papain and V-8 protease mixtures on degree of hydrolysis and inhibito rate ags llc cd xd

從水解度方面看，只添加木瓜蛋白酶時，水解度為34.8%，接近40%，與數(shù)據(jù)庫軟件模擬得到的結(jié)果類似。而V-8蛋白酶的加入對水解度沒有提高，這與模擬結(jié)果相同，說明數(shù)據(jù)庫軟件模擬結(jié)果是可信的。加入10% V-8蛋白酶后水解度為34.9%，隨著V-8蛋白酶的逐漸增加，水解度未升高反而有所下降（圖2），說明木瓜蛋白酶的減少對水解度有一定影響，因此用木瓜蛋白酶作為主要水解蛋白酶是正確的。

從亞油酸氧化抑制率方面看（圖2），未加入V-8蛋白酶時，木瓜蛋白水解物的亞油酸氧化抑制率為38.9%，而加入10% V-8蛋白酶后，亞油酸氧化抑制率提升至57.4%，但隨著V-8蛋白酶的添加量增加，其亞油酸氧化抑制率卻沒有再提高。

綜合上述兩方面的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)庫軟件模擬水解可以應(yīng)用于篩選目標(biāo)蛋白酶，且V-8蛋白酶的加入確實有助于提高蛋白水解物的抗油脂氧化活性。據(jù)此，本實驗將選用木瓜蛋白酶為主要蛋白酶，并復(fù)配10%的V-8蛋白酶作為輔助，定向水解檸條籽蛋白，以獲得高活性抗氧化肽。

2.3 最佳水解工藝的確定

本研究確定選用木瓜蛋白酶和V-8蛋白酶共同作為水解酶，以水解度為指標(biāo)，討論溫度、pH值、水解時間以及酶添加量4 個因素對水解效果的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行4因素3水平的正交試驗，并以亞油酸氧化抑制率為評價指標(biāo)，確定最佳的水解工藝。

圖3 水解度隨溫度（a）、pH值（b）、時間（c）和酶添加量（d）變化曲線Fig.3 Effect of temperature (a), pH (b), time (c) and enzyme dosage (d) on degree of hydrolysis

如圖3a所示，溫度對水解效果影響較大，隨著溫度不斷升高，水解度不斷增加，55 ℃達到最大值，繼續(xù)升高則水解度下降，表明最適水解溫度為55 ℃。如圖3b所示，pH值對水解效果影響較顯著，各類蛋白酶等電點不一樣，均有最適pH值范圍，只有在最適范圍內(nèi)，酶的活性才能達到最大值。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶與V-8蛋白酶的組合水解的最適pH值為6.0。如圖3c所示，隨著水解時間的延長，水解度呈緩慢增長趨勢，3 h時達到最高值。如圖3d所示，隨著酶與底物濃度之比的增加，水解度先增加后減小，酶添加量為2%時，水解度最高，隨后呈下降趨勢。

表6 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Orthogonal array design and analysis of experimental results

極差R 1.2 1.7 1.9 1.9最優(yōu)水平 A1 B1 C2 D1影響順序 D＞C＞B＞A

通過正交試驗的結(jié)果分析（表6），最優(yōu)水平為A1B1C2D1，即溫度45 ℃、pH 5.0、時間2 h、酶添加量1%，與圖3單因素試驗中以水解度作為水解效果指標(biāo)得到的結(jié)果，正交試驗的工藝條件均降低了一個水平，這說明僅用水解度為評價指標(biāo)優(yōu)化檸條籽蛋白水解工藝條件是片面的，高水解度會導(dǎo)致蛋白水解物中含有較多的游離氨基酸，不利于制備具有特定功能的小分子肽[23]，應(yīng)配合抗氧化能力大小對水解效果進行綜合評定。呂桂善等[23]在水解酪蛋白過程中發(fā)現(xiàn)水解度與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽活性之間無相關(guān)性；張強等[24]也發(fā)現(xiàn)水解度與玉米肽清除自由基能力之間無線性關(guān)系。所以本研究以亞油酸氧化抑制率作為優(yōu)化水解檸條籽蛋白的指標(biāo)是正確的。

根據(jù)極差結(jié)果，影響亞油酸氧化抑制率的因素順序為：酶添加量＞時間＞pH值＞溫度。由方差分析也可看出（表7），酶添加量對檸條籽蛋白的水解效果具有顯著性差異，水解時間與pH值次之，具有較顯著差異，溫度的影響較小，方差分析顯示結(jié)果差異不顯著。

表7 方差分析Table 7 Analysis of variance

2.4 檸條籽抗氧化肽油脂抗氧化評價

利用優(yōu)化水解工藝得到檸條籽蛋白水解物，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及軟件分析，鑒定到多肽序列7 199 條，其中包含數(shù)據(jù)庫軟件模擬活性片段的序列占90%，這些多肽序列中含有30%以上酸性氨基酸的序列約占40%。表8列出了部分檸條籽多肽序列，可以看出，這些序列都包含了虛擬水解得到的活性片段Q、QE、QYE、E、D、AE、QG等。

表8 檸條籽蛋白酶解物序列信息Table 8 Sequences of antioxidant peptides derived from Caragana seeds protein hydrolysate

AE- KFLEREADEPVSD

實驗選取了一條包含活性片段的檸條籽抗氧化肽LDEPDPL進行油脂抗氧化的評價。油脂的自動氧化是指室溫下，油脂中不飽和脂肪酸與空氣中氧未經(jīng)直接光照，未加催化劑的條件下完全自發(fā)進行的反應(yīng)[25]。亞油酸分子含有2 個雙鍵，是一種極易被氧化的不飽和脂肪酸，因此亞油酸體系的自動氧化反應(yīng)常作為油脂抗氧化的評價[26]。如圖4所示，檸條籽抗氧化肽的亞油酸氧化抑制率可達到50.3%，與同等濃度化學(xué)抗氧化劑TBHQ有類似效果，說明根據(jù)數(shù)據(jù)庫軟件虛擬水解結(jié)果篩選抗氧化肽是一種可行的方法。

圖4 檸條籽抗氧化肽對亞油酸氧化的抑制率Fig.4 Linoleic acid oxidation inhibitory rate of the selected antioxidant peptide derived from Caragana seed protein

3 討 論

制備食源性活性肽的經(jīng)典途徑是利用多種酶水解不同來源的蛋白質(zhì)，優(yōu)化水解過程，然后根據(jù)活性進行多步分離和純化，最后鑒定結(jié)構(gòu)[27]。該方法耗時且勞動強度大，對蛋白質(zhì)來源、蛋白酶的選擇缺乏目的性[27]。生物信息學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的藥物功效評價與種類篩選中，如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的篩選。Lafarga等[28]利用計算機輔助鑒定新的二肽基肽酶-IV和血管緊張素-I-轉(zhuǎn)換酶抑制肽。首先從數(shù)據(jù)庫中確定所選肉蛋白的序列，然后比較這些序列的共性。之后進行計算機模擬消化，通過與已知蛋白質(zhì)序列對比，篩選出未知序列，然后預(yù)測這些序列的潛在生物活性和毒性，最后合成所選序列并鑒定其活性。

由于抗氧化能力測定標(biāo)準(zhǔn)缺乏統(tǒng)一性[29-31]，因此通過生物信息學(xué)方法篩選抗氧化肽的研究報道很少。鑒于抗氧化肽序列中含有酸性氨基酸可以提升其延緩油脂氧化的能力[4-5]，本實驗借助生物信息學(xué)建立了一個篩選延緩油脂氧化的抗氧化肽的方法。通過檢測檸條籽蛋白的類型及氨基酸組成，首先確定了檸條籽蛋白作為篩選酸性氨基酸抗氧化肽的蛋白來源。之后利用數(shù)據(jù)庫軟件虛擬水解，選定了水解檸條籽蛋白的目標(biāo)蛋白酶，即木瓜蛋白酶復(fù)配V-8蛋白酶，并用實驗證實了模擬結(jié)果，確定了V-8蛋白酶的使用量。木瓜蛋白酶作為主要水解酶，具有廣泛的水解位點，主要負(fù)責(zé)提升水解度；V-8蛋白酶的加入，釋放了大量酸性氨基酸，提升了檸條籽水解物的亞油酸氧化抑制率，酸性氨基酸能夠螯合金屬離子[4]、清除自由基、阻止油脂進一步氧化。為進一步確定該方法可以篩選目標(biāo)抗氧化肽的可行性，借助實驗鑒定了水解后的檸條籽抗氧化肽，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫軟件模擬的一致，證實檸條籽抗氧化肽序列包含了模擬得到的活性片段，確實具有延緩油脂氧化的效果，說明該方法可以作為篩選和制備抗氧化肽的一種應(yīng)用技術(shù)。

綜上，本研究結(jié)論如下：1）選擇富含酸性氨基酸的檸條籽蛋白，結(jié)合計算機輔助水解法可以篩選延緩油脂抗氧化肽的蛋白酶組合，即木瓜蛋白酶＋10% V-8蛋白酶；該組合酶的水解度為34.9%，適宜水解條件為溫度45 ℃、pH 5.0、時間2 h和酶添加量1%。經(jīng)過此水解工藝獲得的抗氧化肽LDEPDPL的亞油酸氧化抑制率為50.3%，與相同濃度化學(xué)抗氧化劑TBHQ有類似的抗氧化效果。2）通過選擇富含酸性氨基酸的蛋白來源，結(jié)合生物信息手段篩選目標(biāo)蛋白酶，可以建立定向制備延緩油脂氧化的抗氧化肽工藝，獲得目標(biāo)抗氧化肽，這種工藝不僅簡化了抗氧化肽的制備方式，而且為利用檸條籽蛋白開發(fā)抗氧化活性肽提供了依據(jù)。