鹽漬辣椒細(xì)菌多樣性分析

趙玲艷，黃嘉欣，楊 劍，卿煜維，潘金微，周 熠，鄧放明,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.辣妹子食品股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 413100）

鹽漬辣椒即新鮮辣椒經(jīng)清洗、切碎（或不切碎），添加15%～25%食鹽、0.05%～0.1%左右的CaCl2，0.05‰～0.1‰焦亞硫酸鈉拌勻、裝袋、貯存后的產(chǎn)品[1]。鹽漬辣椒具有食鹽含量高、保質(zhì)期長(zhǎng)、運(yùn)輸方便等特點(diǎn)。鹽漬辣椒經(jīng)脫鹽、調(diào)配、罐裝、殺菌等處理后，可加工成低鹽調(diào)味辣椒，因此，鹽漬辣椒已經(jīng)成為全國(guó)辣椒加工企業(yè)的主要加工原料[2]。近年來，針對(duì)鹽漬辣椒的研究大多集中在菌種的分離純化、發(fā)酵工藝的優(yōu)化和營(yíng)養(yǎng)成分變化等[3-7]。鹽漬辣椒因其食鹽含量高，大部分微生物的生長(zhǎng)受到抑制，但仍有部分耐鹽微生物生長(zhǎng)，以維持鹽漬辣椒的緩慢發(fā)酵和較長(zhǎng)的貯藏期。采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法，可以分離出鹽漬辣椒中許多耐鹽微生物，然而傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)大多僅利用可培養(yǎng)的微生物，自然界中可分離培養(yǎng)的微生物不到總微生物的1%，自然發(fā)酵辣椒中還有絕大多數(shù)不可人工培養(yǎng)和暫未人工培養(yǎng)的微生物。并且針對(duì)鹽漬辣椒貯藏過程中微生物的研究?jī)H局限于菌種的分離培養(yǎng)，其微生物多樣性研究鮮有報(bào)道[8-9]。454高通量焦磷酸測(cè)序技術(shù)堪稱宏基因組技術(shù)發(fā)展史上的一個(gè)里程碑，該技術(shù)可以對(duì)數(shù)百萬個(gè)DNA分子同時(shí)測(cè)序，具有速度快、單個(gè)堿基的測(cè)序費(fèi)用低、簡(jiǎn)單、高效、方便等特點(diǎn)[10-15]。Liu Zhanggen等[16]研究了江水酸菜中的主要微生物的組成；周森等[17]將傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法和高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，解析了大曲中微生物的組成情況；韓俊燕等[18]發(fā)現(xiàn)剁辣椒中魏斯氏菌、明串珠菌和乳桿菌是主要的菌屬。

本研究采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)，對(duì)鹽漬線椒和鹽漬米椒的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，探明鹽漬線椒和鹽漬米椒細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度，挖掘鹽漬線椒和鹽漬米椒中有益微生物資源，旨在為進(jìn)一步對(duì)鹽漬蔬菜進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控、改進(jìn)生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

鹽漬線椒和鹽漬米椒來自湖南壇壇香食品科技有限公司。

鹽漬線椒：切碎鹽漬，原料為山西忻州的‘辣豐3號(hào)’線椒，切碎后添加約21%的食鹽和0.2% CaCl2，混勻，入袋貯藏。

鹽漬米椒：原料為云南小米椒，添加約14%的食鹽、0.2% CaCl2、0.6%檸檬酸，混勻，整只鹽漬，入袋貯藏。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒、TransStart FastpfuDNA聚合酶、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、Roche GS FLX Titanium emPCR Kits、Roche GS FLX+ Sequencing Method、Manual_XLR70 kit 北京Omega BioTek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C型凝膠電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；Quanti Fluor?-ST熒光定量系統(tǒng) 美國(guó)Promega公司；Roche GS FLX測(cè)序儀 瑞士Roche公司；UVP CDS-8000凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Metone公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

打開鹽漬線椒和鹽漬米椒的編織袋后，通過觀察袋中辣椒的色澤和聞袋中辣椒的氣味，分別選擇5 袋風(fēng)味較好的鹽漬線椒和鹽漬米椒為取樣對(duì)象，撇去袋中表面厚約20 cm的辣椒，每袋無菌操作取樣500 g，于EP管中密封帶回實(shí)驗(yàn)室，分別將鹽漬線椒和鹽漬米椒的5 個(gè)樣品混勻，取樣，每份100 g，一式三份，鹽漬線椒標(biāo)號(hào)為X_G，鹽漬米椒標(biāo)號(hào)為M_G，于－80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3.2 樣品中微生物DNA的提取及DNA質(zhì)量檢測(cè)

參照E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒抽提方法對(duì)鹽漬辣椒中微生物DNA提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA[19]。

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物定量及測(cè)序

正反向引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；533R：5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），帶有5’端454測(cè)序A、B接頭的特異引物和3’端的融合引物，其中A為測(cè)序端，需要加上barcode，B端引物可以共用。PCR采用20 μL反應(yīng)體系[20]，具體見表1。

表1 PCR擴(kuò)增體系Table 1 Composition of PCR reaction system used in this study

PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min。切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3.4 PCR產(chǎn)物定量、測(cè)序

PCR產(chǎn)物熒光定量，確保總量大于100 ng，PCR產(chǎn)物質(zhì)量濃度大于5 ng/μL，OD260nm/OD280nm介于1.8～2.0之間，無降解，將PCR產(chǎn)物混合，按照454 Roche GS-FLX測(cè)序[21]。

1.3.5 生物信息分析

為了提取高質(zhì)量核苷酸序列，使用Qiime [1]（vsesion 1.17）軟件去雜后，進(jìn)行高質(zhì)量序列的生物信息學(xué)處理，包括去除嵌合體、可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類、分類學(xué)分析、比對(duì)分析等[22-24]，應(yīng)用到的數(shù)據(jù)庫和軟件見表2，利用R語言工具繪制群落結(jié)構(gòu)組分圖、Heatmap圖、Rank-Abundance曲線、Shannon-Wiener曲線、主成分分析等[25-27]。

表2 生信分析數(shù)據(jù)庫或軟件Table 2 Bioinformatics software or databases used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

從圖1可以看出，從樣品X_G和M_G中提取的微生物基因組DNA質(zhì)量濃度大于5 ng/μL，無明顯降解，適合進(jìn)行后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total bacterial genomic DNA from salted peppers

2.2 基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)微生物總DNA合格后，擴(kuò)增微生物總DNA的16S rRNA V1-V3區(qū)，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、洗脫、2%瓊脂糖電泳檢測(cè)[28]，結(jié)果見圖2。

圖2 鹽漬辣椒細(xì)菌PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of the V1-V3 region of the bacterial 16S rRNA gene sequence from salted peppers

從圖2可以看出，樣品X_G和M_G中微生物總DNA的16S rRNA V1-V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶均整齊、明亮、非特異帶少，長(zhǎng)度均約525 bp，條帶大小正確，濃度合適，PCR擴(kuò)增效果良好，適宜后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 有效序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果

M_G和X_G細(xì)菌總序列數(shù)為31 373 條，細(xì)菌的總堿基數(shù)為12 670 729 bp，細(xì)菌序列的平均長(zhǎng)度為430 bp。有效序列經(jīng)去除冗余、去重復(fù)處理后，優(yōu)化數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，M_G和X_G細(xì)菌總堿基數(shù)為10 313 535 bp，序列總數(shù)為24 175 條，平均長(zhǎng)度為426 bp。

2.4 X_G和M_G細(xì)菌多樣性評(píng)估結(jié)果

優(yōu)化序列在相似度為97%的水平下進(jìn)行OTU聚類，X_G和M_G細(xì)菌的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)結(jié)果見表3。

表3 鹽漬辣椒在97%相似性水平下細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 3 Diversity indexes of bacterial community at 97% similarity level in salted peppers based on 454 pyrosequencing data

從表3可以看出，X_G和M_G細(xì)菌的OTU值均小于ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)，說明在X_G和M_G中可能很多未知的微生物資源；X_G細(xì)菌的OTU值、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)大于M_G，Shannon指數(shù)小于M_G，說明X_G的細(xì)菌多樣性大于M_G的細(xì)菌多樣性。產(chǎn)生此現(xiàn)象的主要原因可能有以下2 個(gè)方面：其一是因線椒原料的含水量較米椒高，辣椒素含量較米椒低，線椒原料可能更適合微生物生長(zhǎng)；其二是因2 種辣椒鹽漬時(shí)食品添加劑的使用不一樣，線椒鹽漬時(shí)未添加檸檬酸，僅借助于高鹽（質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%）抑制微生物的生長(zhǎng)，達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間保胚的目的。而米椒鹽漬時(shí)因添加了0.6%檸檬酸，適當(dāng)降低了食鹽用量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%），低初始pH值和較高食鹽濃度的共同作用抑制了微生物的生長(zhǎng)，降低了其微生物多樣性，達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間保胚的目的。由此可以看出，辣椒或者其他蔬菜高鹽保胚時(shí)，借助于添加酸味劑等輔助措施，可降低食鹽添加量，達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間保存蔬菜原料目的的同時(shí)，減少蔬菜加工脫鹽時(shí)資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。對(duì)比低鹽發(fā)酵辣椒細(xì)菌多樣性指數(shù)（待發(fā)表），X_G和M_G細(xì)菌的OTU值、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)均遠(yuǎn)小于低鹽發(fā)酵辣椒，說明鹽漬辣椒的微生物多樣性指數(shù)低于低鹽發(fā)酵辣椒的微生物多樣性指數(shù)，高鹽抑制了大部分微生物生長(zhǎng)，這也是鹽漬辣椒利用高鹽抑制大部分微生物生長(zhǎng)，維持緩慢發(fā)酵，達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間保胚的原因。

2.5 X_G和M_G細(xì)菌群落多樣性分析

X_G和M_G微生物經(jīng)454焦磷酸測(cè)序分析后得知，X_G已知分類的細(xì)菌可歸屬到8 個(gè)門、15 個(gè)綱、26 個(gè)目、31 個(gè)科、94 個(gè)屬、101 個(gè)種，并檢測(cè)到了13 個(gè)不能培養(yǎng)的細(xì)菌種。M_G已知分類的細(xì)菌可歸屬到6 個(gè)門、15 個(gè)綱、29 個(gè)目、44 個(gè)科、58 個(gè)屬、42 個(gè)種，并檢測(cè)到了10 種不能培養(yǎng)的細(xì)菌。

2.5.1 X_G和M_G在門水平細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度

圖3 在門水平鹽漬辣椒相對(duì)豐度大于0.01%細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundances and phylum-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

如圖3所示，在門水平，X_G中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌有藍(lán)藻細(xì)菌（Cyanobacteria，77.01%）、變形菌門（Proteobacteria，14.78%）和厚壁菌門（Firmicutes，6.36%）；M_G中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌有Proteobacteria（51.5%）和Firmicutes（46.92%）。X_G中檢測(cè)出了大量Cyanobacteria，但在綱、目、科、屬水平?jīng)]有任何分類，推測(cè)Cyanobacteria實(shí)際上是宿主（辣椒）本身DNA的污染，M_G中未大批量檢出Cyanobacteria的原因可能是米椒是整只鹽漬，減少了辣椒切碎過程中辣椒汁的流出，從而降低了宿主DNA的污染[29]。因此，蔬菜中微生物DNA提取時(shí)，如何有效地去除宿主DNA的干擾是今后需要研究的課題。

2.5.2 X_G和M_G在綱水平細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度

圖4 在綱水平鹽漬辣椒相對(duì)豐度大于0.01%細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundances and class-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

如圖4所示，在綱水平，X_G中相對(duì)豐度大于1%的已知分類細(xì)菌綱有葉綠體（chloroplast，77.01%）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，8.03%）、桿菌綱（Bacilli，6.3%）、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria，6.15%）；M_G中相對(duì)豐度大于1%已知分類細(xì)菌綱有Gammaproteobacteria（49.36%）、梭菌綱（Clostridia，38.94%）、Bacilli（7.84%）、變形菌綱（Epsilonproteobacteria，1.9%）。由此可以看出，X_G和M_G在綱水平細(xì)菌群落組成相差不大，在綱水平，因葉綠體與細(xì)菌DNA的同源性而檢測(cè)到了大量葉綠體，再次證明了X_G因切碎鹽漬細(xì)菌DNA受宿主（辣椒）DNA的污染嚴(yán)重。

2.5.3 X_G和M_G在目水平細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度

如圖5所示，在目水平，X_G中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌有無分類地位目（77.01%）、乳桿菌目（Lactobacillales，6.15%）、腸桿菌目（Enterobacteriales，6%）、根瘤菌目（Rhizobiales，3.92%）、立克次體目（Rickettsiales，1.84%）和黃色單胞菌目（Xanthomonadales，1.41%）；M_G中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌有海洋螺菌目（Oceanospirillales，48.82%）、鹽厭氧菌目（Halanaerobiales，38.88%）、Lactobacillales（7.4%）和彎曲桿菌目（Campylobacterales，1.9%）。X_G和M_G在目水平細(xì)菌群落組成的差異較大，X_G中無分類地位目是宿主的DNA污染。

圖5 在目水平鹽漬辣椒相對(duì)豐度大于0.01%細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundances and order-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

2.5.4 X_G和M_G在科水平細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度

如圖6所示，在科水平，X_G中相對(duì)豐度大于1%的已知分類地位的細(xì)菌有腸桿菌科（Enterobacteriaceae，6%）、鏈球菌科（Streptococcaceae，5.22%）、根瘤菌科（Rhizobiaceae，2.78%）、線粒體（mitochondria，1.84%）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae，1.41%）；M_G中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌有：鹽厭氧菌科（Halanaerobiaceae，38.88%）、海洋螺菌科（Oceanospirillaceae，24.8%）、鹽單胞菌科（Halomonadaceae，23.08%）、鏈球菌科（Streptococcaceae，5.31%）、腸球菌科（Enterococcaceae，1.93%）、彎曲桿菌科（Campylobacteraceae，1.9%）。

圖6 在科水平鹽漬辣椒相對(duì)豐度大于0.01%細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundances and family-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

2.5.5 X_G和M_G在屬水平細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度

如圖7所示，X_G和M_G相對(duì)豐度大于0.01%的細(xì)菌分別有22 個(gè)屬和19 個(gè)屬，X_G中沒有任何分類的細(xì)菌norank占78.89%，這就是線椒本身的葉綠體和線粒體基因，經(jīng)去宿主DNA處理后，X_G和M_G相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌見圖8，X_G和M_G相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌共有19 個(gè)屬，分別是：鹽厭氧菌（Halanaerobium）、海螺菌（Marinospirillum）、乳酸乳球菌（Lactococcus）、色鹽桿菌（Chromohalobacter）、鹽單胞菌（Halomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、泛菌（Pantoea）、四聯(lián)球菌（Tetragenococcus）、弓形菌（Arcobacter）、黃單胞菌（Xanthomonas）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas）、蒼白桿菌（Ochrobactrum）、果膠桿菌（Pectobacterium）、漫游球菌（Vagococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、金黃色單胞菌（Aureimonas）、甲基桿菌（Methylobacterium）。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)：2 個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬的組成及相對(duì)豐度上存在較大差異，X_G的優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actococcus（24.51%）、根瘤菌（Rhizobium，13.17%）和未分類菌種（22.78%），共占60%以上；M_G的優(yōu)勢(shì)菌屬為Halanaerobium（38.88%）、Marinospirillum（24.79%）、Chromohalobacter（12.32%）和Lactococcus（5.12%），共占80%以上。造成2 種鹽漬辣椒優(yōu)勢(shì)菌屬差異的原因可能跟原料的品種、含水量、辣椒素含量、發(fā)酵體系初始pH值等因素有關(guān)。2 種鹽漬辣椒中豐度較高的乳酸菌僅為乳酸乳球菌，說明鹽漬辣椒乳酸發(fā)酵比較微弱，發(fā)酵速度比較緩慢，能達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間保胚的目的，且乳酸乳球菌是乳酸菌中耐鹽性比較強(qiáng)的菌屬[30]。

圖7 在屬水平鹽漬辣椒細(xì)菌相對(duì)豐度大于0.01%群落組成和相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundances and genus-level composition of bacterial communities with relative abundance greater than 0.01% in salted peppers

圖8 鹽漬辣椒優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度大于1%屬群落組成和相對(duì)豐度Fig.8 Relative abundances and composition of dominant bacterial genera with relative abundance greater than 1% in salted peppers

圖9 相對(duì)豐度前100的微生物OTU在樣品間的分布Fig.9 OTU Distribution of top 100 most abundant microbial genera

從圖9可以看出，經(jīng)聚類分析后發(fā)現(xiàn)前100 個(gè)細(xì)菌OTU中，X_G中含有75 個(gè)，M_G中含有48 個(gè)，X_G和M_G中共同含有的細(xì)菌OTU有23 個(gè)，再次印證了X_G的細(xì)菌多樣性大于M_G的細(xì)菌多樣性的結(jié)論。

3 結(jié) 論

采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)湖南壇壇香食品科技有限公司鹽漬辣椒中兩個(gè)主要品種X_G和M_G測(cè)序，X_G已知分類的細(xì)菌可歸屬到8 個(gè)門、15 個(gè)綱、26 個(gè)目、31 個(gè)科、94 個(gè)屬、101 個(gè)種。M_G已知分類的細(xì)菌可歸屬到6 個(gè)門、15 個(gè)綱、29 個(gè)目、44 個(gè)科、58 個(gè)屬、42 個(gè)種。X_G主要的細(xì)菌門有Cyanobacteria（77.01%）、Proteobacteria（14.78%）和Firmicutes（6.36%），M_G優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Proteobacteria（51.5%）和Firmicute（46.92%）。X_G和M_G相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌屬共有19 個(gè)，X_G中優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actococcus（24.51%）和Rhizobium（13.17%)。M_G中優(yōu)勢(shì)菌屬為Halanaerobium（38.99%）、Marinospirillum（24.86%）、Chromohalobacter（12.36%）和Halomonas（9.67%）。測(cè)序結(jié)果表明，鹽漬辣椒中存在著豐富的微生物資源，為發(fā)酵辣椒增香添味。同時(shí)本研究明晰了鹽漬辣椒中的細(xì)菌群落組成及相對(duì)豐度，為鹽漬辣椒優(yōu)勢(shì)優(yōu)良菌種的篩選及發(fā)酵辣椒菌種資源庫的建立提供了理論依據(jù)。