PLA/PGA復(fù)合納米纖維膜的制備及其生物相容性與降解性研究

王詩卉，李 光，金俊弘，楊勝林

(東華大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院 纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201620)

疝氣是普外科的一種常見病和多發(fā)病[1]，其傳統(tǒng)的治療方法是對薄弱組織進(jìn)行縫合、加固軟組織，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，目前較好的方式是使用醫(yī)療補片修補軟組織薄弱部位，降低了復(fù)發(fā)率和手術(shù)疼痛感，傷口小，恢復(fù)快[2]。此外，據(jù)統(tǒng)計7%的女性會出現(xiàn)盆底功能障礙—盆底脫垂，并需要治療以緩解癥狀，其中在5年內(nèi)需要重復(fù)治療的患者占13%[3]。目前，治療女性盆底功能障礙性疾病的先進(jìn)手段是在體內(nèi)植入補片以起到支撐修復(fù)重建盆底功能的效果，相比傳統(tǒng)切除的方式，植入補片治療可以提高手術(shù)安全性，改善術(shù)后患者的生活質(zhì)量[4]。無張力疝氣修補術(shù)和盆底重建的關(guān)鍵均在于選擇合適的補片材料，要求補片材料既具有足夠的力學(xué)性能以達(dá)到修補效果，又具有可降解、生物友好特性以減少受體排異反應(yīng)。

目前應(yīng)用最廣泛的醫(yī)用補片材料是聚丙烯[5]。聚丙烯補片的特點是具有較好的強度以及彈性，但是作為一種不可吸收的材料，植入體內(nèi)后，會引起較強的炎癥反應(yīng)[6]。因此，可吸收補片及其材料成為人們研究的熱點。聚乳酸(PLA)及聚羥基乙酸(PGA)均是生物友好可降解材料，其在體內(nèi)最終降解產(chǎn)物是水和二氧化碳，在醫(yī)學(xué)上已得到廣泛應(yīng)用，是目前發(fā)展前景較好的生物醫(yī)用材料。其中，PLA力學(xué)性能良好，但其降解速度較慢，降解產(chǎn)物二氧化碳會使組織周圍酸性增加引起組織非炎癥反應(yīng)，且易析出小PLA結(jié)晶影響細(xì)胞生長的活性和增殖[7]。PGA與PLA相比降解速度快、生物相容性好，在體內(nèi)應(yīng)用時有利于細(xì)胞增殖以及細(xì)胞粘附[8]，但其力學(xué)性能衰減較快。20世紀(jì)90年代初，研究人員開發(fā)了由丙交酯(LA)和乙交酯(GA)開環(huán)聚合得到的高相對分子質(zhì)量PLA和PGA，但由于其對水和熱的敏感性而未能引起廣泛重視。A.M.REED等[9]將GA和LA共聚，發(fā)現(xiàn)通過改變GA和LA的比例，可以有效調(diào)節(jié)共聚物的降解速率。對于生物可降解材料，材料的降解速度是否與應(yīng)用所需時間匹配是一個重要因素。PGA、PLA及其共聚物(PLGA)(乙交酯-丙交酯按不同比例共聚所得的聚合物)目前較常用于組織工程和支架材料。PGA和PLA具有各自的優(yōu)缺點，將其復(fù)合(共聚或共混)使用，可以根據(jù)不同的復(fù)合比例來調(diào)節(jié)材料的降解速率和力學(xué)性能，獲得降解速度與組織修復(fù)速度相一致的材料，并且不會由于降解而失去所需強度，作為補片用于治療時可以修復(fù)組織，且逐漸降解，最終完成生物意義上的修復(fù)。

OUYANG H W等[10]使用PLGA制作肌腱支架，以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)為接種細(xì)胞植入兔子體內(nèi)，12周后檢測，PLGA支架拉伸剛度可達(dá)正常功能的87%，說明PLGA作為生物材料使用，可滿足材料所需力學(xué)性能且生物相容性良好?？苁寇姷萚11]將PLA、PGA熔融紡絲，得到一種新型芯鞘復(fù)合纖維，并對其降解性能進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，復(fù)合纖維的水解率隨著PGA含量的增加而增加，證明了可通過調(diào)整PLA與PGA的復(fù)合比例來控制復(fù)合纖維的降解速率的可行性。戰(zhàn)鶴楠等[12]將聚己內(nèi)酯(PCL)與γ-聚谷氨酸(γ-PGA)混合，利用靜電紡絲制得復(fù)合纖維膜，成膜性良好，且纖維的形貌均一，作為補片材料使用時形貌良好。

綜上所述，合理匹配利用PLA良好的力學(xué)性能和PGA良好的生物相容性能，制備的PLA/PGA復(fù)合材料可單獨使用或作為輔材，有望在醫(yī)用補片開發(fā)方面獲得利用。作者利用靜電紡絲技術(shù)，通過調(diào)整PLA與PGA的復(fù)合比例，制得5種PLA/PGA復(fù)合納米纖維膜，考察了PLA與PGA的不同質(zhì)量比對復(fù)合納米纖維膜的降解行為及生物相容性的影響。

1 實驗

1.1 主要試劑和儀器

PLA、PGA：纖維級粒料，東華大學(xué)纖維改性國家重點實驗室提供；六氟異丙醇：光譜純，上海德默醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)；磷酸鹽緩沖液：上海易勢化工有限公司產(chǎn)；磷酸二氫鉀(KH2PO4)、一水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·H2O)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)：均為分析純，國藥集團提供。

靜電紡絲設(shè)備：實驗室自制； FD-1A-50型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康儀器有限公司制； DSC 822型差示掃描量熱儀：瑞士梅特利-托利多公司制； S-4800型掃描電子顯微鏡：日本HITACHI公司制； Instron 5969型電子萬能試驗機：美國Instron公司制。

1.2 PLA/PGA復(fù)合納米纖維膜的制備

將PLA、PGA以不同質(zhì)量比混合并投入六氟異丙醇中，在50 ℃下磁力攪拌直至粒料全部溶解，得到PLA與PGA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的微黃色透明的靜電紡絲溶液。在25 ℃和相對濕度30%的環(huán)境下，將得到的靜電紡絲溶液轉(zhuǎn)入塑料注射器制成的噴絲管中，設(shè)置電源電壓18 kV、注射泵推進(jìn)速度15 μL/min，采用直徑為1.2 mm的噴絲頭進(jìn)行靜電紡絲，以接地平面屏接收，接收距離為15 cm。收集到的試樣用去離子水洗凈并用濾紙吸去表面水分，再用冷凍干燥機于-50 ℃下干燥24 h以上直至恒重，得到PLA/PGA納米纖維膜。其中，PLA與PGA質(zhì)量比為100:0，90:10，80:20，70:30，60:40的PLA/PGA納米纖維膜試樣分別標(biāo)記為0#，1#，2#，3#，4#。另外，純PGA無法紡絲，將PGA粉末標(biāo)記為5#試樣。

1.3 PLA/PGA納米纖維膜的體外降解實驗

降解液的配制：使用磷酸鹽緩沖液模擬人體內(nèi)降解環(huán)境，依次稱取8.0 g NaCl、0.2 g KH2PO4、1.56 g Na2HPO4·H2O、0.2 g KCl，溶解于磷酸鹽緩沖液中，充分?jǐn)嚢韬?，定容? 000 mL的降解液，以備使用。

體外降解實驗：將不同復(fù)合比的PLA/PGA納米纖維膜裁剪成50 mm×50 mm(用于降解質(zhì)量損失測試)及50 mm×10 mm(用于力學(xué)性能測試)規(guī)格的樣條，置于圓形玻璃培養(yǎng)皿中，加入配置好的降解液浸沒樣條，然后一并放入培養(yǎng)箱中于37 ℃下靜置，每隔1 d更換降解液并保持樣條浸沒狀態(tài)。每隔5 d進(jìn)行取樣，取樣后用去離子水清洗并用濾紙吸去表面水分，再在冷凍干燥機內(nèi)于-50 ℃下干燥24 h以上直至恒重，分別得到浸沒5，10，20，30 d的降解試樣。

1.4 分析與測試

熱性能：稱取PLA/PGA納米纖維膜試樣5～10 mg置于鋁坩堝中進(jìn)行差示掃描量熱(DSC)測試。將試樣先升溫至250 ℃并保溫3 min去除熱歷史，冷卻到室溫后再以10 ℃/min的升溫速率升至250 ℃，記錄二次升溫的熱流。

表面形態(tài)：將PLA/PGA納米纖維膜試樣經(jīng)濺射鍍金處理后，采用掃描電鏡(SEM)觀察其表面形態(tài)。

細(xì)胞毒性：將PLA/PGA納米纖維膜裁剪成100 mm×100 mm的大小嚴(yán)格滅菌后置于干凈的玻璃培養(yǎng)皿中，加入20 mL高糖培養(yǎng)基，置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(溫度37 ℃，通入CO2體積分?jǐn)?shù)0.5%)中放置72 h得到材料浸漬液。用所制得的材料浸漬液培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞(L929細(xì)胞)，培養(yǎng)時間分別為24，48，72 h，并以cck-8試劑法分別評價其細(xì)胞毒性。

細(xì)胞黏附形態(tài)：將PLA/PGA納米纖維膜裁剪成合適的大小放置于12孔培養(yǎng)皿中，使用滅菌鋼環(huán)壓住，種入L929細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后對細(xì)胞進(jìn)行固定脫水，鍍金處理后使用SEM觀察納米纖維膜上細(xì)胞黏附形態(tài)。

體外降解性能：根據(jù)體外降解前后PLA/PGA納米纖維膜試樣的質(zhì)量，計算質(zhì)量損失率，來表征納米纖維膜的降解性能。

力學(xué)性能：使用電子萬能試驗機對降解試樣進(jìn)行拉伸實驗，測試?yán)w維膜的拉伸強度。試樣夾持長度為5 cm，拉伸速率為10 mm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLA/PGA納米纖維膜熱性能及表面形貌

PLA/PGA納米纖維膜去除熱歷史后的DSC曲線見圖1，相關(guān)結(jié)晶特征數(shù)據(jù)如熔點(Tm)和熔融熱焓(?Hm)列于表1。從圖1和表1可以看出：納米纖維膜中PLA和PGA相互影響導(dǎo)致各自的熱性能發(fā)生明顯變化；PGA開始結(jié)晶時，熔點較低的PLA仍呈熔體狀態(tài)并對PGA的結(jié)晶造成阻礙，使PLA/PGA納米纖維膜的?Hm降低且Tm出現(xiàn)雙峰，其中高溫峰值與純PGA的Tm相比變化不大，這是共混物中PGA富集區(qū)形成的完善程度高的結(jié)晶的貢獻(xiàn)，而PGA富集程度低的區(qū)域中其分子運動受到PLA的影響、結(jié)晶完善程度降低，從而出現(xiàn)溫度相對較低的熔融峰，且峰值隨PLA含量增加而降低；而PLA開始結(jié)晶時，PGA已完成結(jié)晶且晶粒會成為成核劑促進(jìn)PLA的結(jié)晶，因此與純PLA相比共混膜中PLA的?Hm增大、Tm增高，但PGA含量增加、晶核數(shù)量增多時誘導(dǎo)生成的PLA晶粒也多，晶粒如同物理交聯(lián)點又會使PGA的活動能力受限，故PLA的?Hm增大的程度會隨PGA含量增加而減弱，這也是4#試樣的Tm又降下來的原因。二者的結(jié)晶特性能互相影響的原因，是類似于同系物的PLA和PGA相容性良好、二者大分子之間相互分散程度高所致。

由此可見，PLA與PGA相容性良好，這將有利于獲得力學(xué)性能良好的納米纖維膜并發(fā)揮二者的協(xié)同作用。

圖1 PLA/PGA納米纖維膜的DSC曲線Fig.1 DSC patterns of PLA/PGA nanofiber membrane

表1 PLA/PGA納米纖維膜的DSC數(shù)據(jù)Tab.1 DSC data of PLA/PGA nanofiber membrane

除了純PGA因結(jié)晶度高難以溶解完全而未能進(jìn)行靜電紡絲外，其他組成的靜電紡絲溶液盡管黏度隨PGA含量增加而有所增大，但均能順利地經(jīng)靜電紡絲制得形貌良好的納米纖維膜。從圖2可知，5種不同復(fù)合比例的PLA/PGA納米纖維膜的纖維粗細(xì)均勻，表面光滑，無明顯差異，PGA含量最高的4#試樣的纖維形貌也是表面平整、光滑，無串珠的形成，無明顯纖維間粘連現(xiàn)象。這說明在本實驗選擇的復(fù)合比例和濃度范圍內(nèi)，PLA/PGA溶液具有良好的靜電紡絲性能。

圖2 PLA/PGA納米纖維膜表面的SEM照片F(xiàn)ig.2 Surface SEM images of PLA/PGA nanofiber membrane

2.2 PLA/PGA納米纖維膜的生物相容性

cck-8試劑所含有的WST-8在電子載體的作用下可被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，生成數(shù)與活細(xì)胞數(shù)量成正比，因此，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定其吸光度(O.D.值)，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。采用cck-8法對不同PLA/PGA復(fù)合比例的5種納米纖維膜對L929細(xì)胞的增殖率進(jìn)行評價，同時設(shè)置空白樣對照，測試結(jié)果見表2。

表2 不同培養(yǎng)時間下PLA/PGA納米纖維膜的O.D.值Tab.2 O.D.value of PLA/PGA nanofiber membrane at different culture time

從表2可以看出：隨著培養(yǎng)時間的增加，空白樣與測試樣的O.D.值均增大，表明5種納米纖維膜均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性且有利于細(xì)胞增殖；隨著PGA含量的增加，測試樣的O.D.值也不斷增大，培養(yǎng)72 h后，4#試樣的O.D.值明顯大于0#試樣(純PLA纖維膜)，這與PGA的生物相容性優(yōu)于PLA相符合。

細(xì)胞可以較好地在材料表面生長并且伸展，則表明材料具有更好的生物相容性。圖3為L929細(xì)胞接種于5種納米纖維膜表面72 h后的SEM照片，觀察所拍攝的細(xì)胞照片可以發(fā)現(xiàn)L929細(xì)胞在纖維表面能夠良好的生長、粘附在纖維上，細(xì)胞在纖維表面伸展，生長形態(tài)良好；相比0#試樣，4#試樣表面細(xì)胞表現(xiàn)出更為伸展的形貌，并且細(xì)胞與纖維的粘合程度更深(生長在納米纖維膜內(nèi))。這表明隨著PGA含量的增加，細(xì)胞在納米纖維膜表面生長粘附形貌更好，細(xì)胞增殖數(shù)也增高，PLA/PGA納米纖維膜相比純PLA纖維膜表現(xiàn)出更好的生物相容性。

圖3 PLA/PGA納米纖維膜表面的細(xì)胞黏附形態(tài)Fig.3 Morphology of cell adhesion on the surface of PLA/PGA nanofiber membrane

2.3 PLA/PGA納米纖維膜的體外降解性能

從圖4可以看出，相比未降解的PLA/PGA納米纖維膜(圖2)，不同復(fù)合比例的納米纖維膜在體外降解30 d后，纖維膜表面光潔度下降，表面附著降解后的小顆粒，損傷增加，出現(xiàn)了細(xì)紋，纖維粗細(xì)均勻度也下降，并且隨著PGA含量的提高，納米纖維膜表面細(xì)紋增多，纖維表面粗糙度增加。纖維表面形態(tài)的變化大說明PLA/PGA納米纖維膜的降解速率大，這與PGA的降解速率大于PLA相一致。

圖4 體外降解30 d后PLA/PGA納米纖維膜表面的SEM照片F(xiàn)ig.4 Surface SEM images of PLA/PGA nanofiber membrane after 30 days of degradation in vitro

PLA/PGA納米纖維膜在體外降解的質(zhì)量損失情況如圖5所示。從圖5可以看出：在30 d的體外降解過程中，純PLA納米纖維膜(0#試樣)因PLA本身的降解較慢，體外降解的質(zhì)量損失最小，體外降解30 d后質(zhì)量損失只有5.4%，其降解速率也相對恒定；1#～4#PLA/PGA納米纖維膜在體外降解初期(5 d內(nèi))，其降解速率快、質(zhì)量損失大，質(zhì)量損失的趨勢隨PGA含量的增加而更加明顯，1#試樣質(zhì)量損失率為3.36%，4#試樣的質(zhì)量損失率達(dá)5.93%，這是由PGA的快速降解特性所決定；但是，在體外降解后期，1#～4#PLA/PGA納米纖維膜的降解速率明顯低于純PLA納米纖維膜，并且從總體上看PGA含量越高，降解速率越慢，這是由于PGA的存在使PLA的結(jié)晶程度提高、無定形區(qū)含量降低造成的，因為水分子是首先進(jìn)入結(jié)構(gòu)疏松的無定形區(qū)使酯鍵斷裂而引起降解。

圖5 PLA/PGA納米纖維膜體外降解的質(zhì)量損失率隨降解時間的變化Fig.5 Change of mass loss rate of PLA/PGA nanofiber membrane with degradation time in vitro■—0#試樣；●—1#試樣；▲—2#試樣；▼—3#試樣；◆—4#試樣

由于PLA的相對分子質(zhì)量遠(yuǎn)高于PGA，故PLA/PGA復(fù)合納米纖維膜的力學(xué)性能主要取決于PLA。從圖6a可以看出，加入PGA后，PLA/PGA納米纖維膜的拉伸強度均低于純PLA納米纖維膜，且隨著降解的進(jìn)行，PLA、PGA在水分子的作用下分子鏈逐漸裂解，纖維膜的拉伸強度隨降解時間的增加持續(xù)降低。但進(jìn)一步考察納米纖維膜在降解過程中的強度損失率(見圖6b)，從總體上看，在不同的PGA添加量下，PLA/PGA納米纖維膜的拉伸強度損失率要低于純PLA納米纖維膜。在降解初期(5 d內(nèi))，盡管PLA/PGA納米纖維膜的降解速率快，但其貢獻(xiàn)主要是PGA提供，僅PGA含量最高的4#試樣的拉伸強度損失率為24.4%，略高于純PLA納米纖維膜的14.7%，其他PLA/PGA納米纖維膜的拉伸強度損失率仍低于純PLA納米纖維膜；隨著降解時間的延長，PLA/PGA納米纖維膜的降解速率更低，降解30 d后，4#試樣的拉伸強度損失率為51.7%，也低于0#試樣的60.0%。因此，在PLA中引入PGA，一方面可以調(diào)整PLA的降解速率以利于制件在有效時間內(nèi)維持必要的力學(xué)性能，另一方面可以利用PGA本身的快速降解來保證總體的降解量，提供良好的生物相容性。

圖6 PLA/PGA納米纖維膜體外降解過程中拉伸強度及其損失率隨降解時間的變化Fig.6 Change of tensile strength and its loss rate of PLA/PGA nanofiber membrane with degradation time in vitro■—0#試樣；●—1#試樣；▲—2#試樣；▼—3#試樣；◆—4#試樣

3 結(jié)論

a. 通過靜電紡絲制備5種不同復(fù)合比例的PLA/PGA納米纖維膜，并對纖維膜進(jìn)行體外降解實驗。合理選擇PLA與PGA的共混比例，可以調(diào)控纖維膜的降解行為，獲得生物相容性和力學(xué)性能優(yōu)良的纖維膜。

b. PLA與PGA的相容性良好，有利于發(fā)揮PLA良好的力學(xué)性能。

c. PLA/PGA復(fù)合納米纖維膜均不具有毒性，且隨著PGA含量的提高，纖維膜表現(xiàn)出更好的生物相容性，細(xì)胞生長、黏附形態(tài)更好。

d. PGA的引入提高了PLA的結(jié)晶程度，隨PGA含量的提高，PLA/PGA復(fù)合納米纖維膜的質(zhì)量損失率更高，但拉伸強度損失率反而更低。