人工周期凍融胚胎移植后黃體支持中添加HCG的前瞻性隨機(jī)對照研究

黃愈，師娟子，李娜*

(1.西安醫(yī)學(xué)院，西安 710003；2.西安交通大學(xué)附屬西北婦女兒童醫(yī)院輔助生殖中心，西安 710003)

在凍融胚胎移植(FET)周期中，人工周期(HRT)準(zhǔn)備內(nèi)膜由于使用外源性雌孕激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增殖與轉(zhuǎn)化，使用方便，可控性強(qiáng)，因此成為了常用的準(zhǔn)備內(nèi)膜方式。但由于HRT周期無黃體生成，胚胎移植后需要足量、全程的黃體支持[1]。

既往的研究認(rèn)為HCG是利用其與LH相似的結(jié)構(gòu)作用于LH受體，刺激黃體細(xì)胞產(chǎn)生雌孕激素進(jìn)行黃體支持。隨著對HCG及其受體研究的深入，發(fā)現(xiàn)HCG在人類生殖的每一步均起著重要的作用[2]。目前對于黃體支持中使用HCG是否可以改善妊娠結(jié)局仍存在爭議。考慮到HRT-FET周期無黃體形成，排除了HCG刺激黃體對妊娠的積極作用，可以反映HCG是否是通過改善母胎界面的交互作用從而改善臨床結(jié)局，進(jìn)而為HCG在臨床中的合理應(yīng)用提供依據(jù)，因此對我中心行HRT-FET周期的患者進(jìn)行前瞻性隨機(jī)對照研究。

資料與方法

一、研究對象

本研究自2018年11月1日至2019年10月31日選取在西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心行FET的患者進(jìn)行前瞻性隨機(jī)對照研究。

1.納入/排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<40歲；FET第一周期；HRT準(zhǔn)備內(nèi)膜(包括GnRH-a+HRT方案)；排除子宮內(nèi)膜異位癥、子宮畸形、轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度<8 mm以及進(jìn)入其他研究的患者。

2.樣本量計(jì)算：研究設(shè)計(jì)為非劣性檢驗(yàn)，把握度β 80%，取α雙側(cè)0.05，臨床妊娠率差異15%，得到樣本量每組150例。

3.隨機(jī)化方案：計(jì)算機(jī)隨機(jī)產(chǎn)生300個隨機(jī)號碼，分為A、B兩組，每組各150個。制作隨機(jī)分組表，計(jì)算機(jī)保存并隱藏。將上述獲得的300個隨機(jī)號碼，再次隨機(jī)分配給300個序列號。每入組一例患者，根據(jù)入組序列，輸入姓名、病歷號后獲得一個隨機(jī)號碼，由計(jì)算機(jī)揭盲分組組別，不能更改。

4.依從性分析：對納入患者進(jìn)行依從者分析。依從者分析是指在分析中除去部分依從性不足的患者，僅對執(zhí)行方案者進(jìn)行分析。

本研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過并備案(倫理審批編號：2018027)。本研究臨床試驗(yàn)注冊號：ChiCTR1800020342。每位患者在入組前均簽署書面知情同意書。

研究流程見圖1。

圖1 研究流程圖

二、研究方法

1.促排卵方案：根據(jù)患者的年齡、bFSH、竇卵泡情況選擇GnRH激動劑(GnRH-a)、拮抗劑(GnRH-ant)、其他方案進(jìn)行促排卵。當(dāng)平均直徑≥17～18 mm的卵泡占到平均直徑≥14 mm卵泡數(shù)量的60%以上時(shí)使用HCG扳機(jī)，常用劑量為HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)4 000～10 000 U肌肉注射或艾澤(默克雪蘭諾，瑞士)250 μg皮下注射，注射后36 h取卵。

2.受精、胚胎培養(yǎng)及胚胎質(zhì)量評價(jià)：根據(jù)患者丈夫精液情況，選擇IVF/ICSI授精。評分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級胚胎為可用胚胎，Ⅰ級和Ⅱ級為優(yōu)質(zhì)胚胎。繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)者在D5或D6，應(yīng)用Gardner評分法對囊胚進(jìn)行評分[3]，3～4CC及以上為可用囊胚，3～4BB及以上為優(yōu)質(zhì)囊胚。

3.胚胎冷凍及復(fù)蘇按我中心常規(guī)進(jìn)行。

4.內(nèi)膜準(zhǔn)備及胚胎移植：單純HRT方案于月經(jīng)周期第3～5天行B超檢查后采用雌激素遞增方案，口服雌二醇(拜耳醫(yī)藥，德國)4～6 mg/d起始，雌激素遞增方案，B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜>8 mm時(shí)，予黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，根據(jù)胚齡選擇移植時(shí)機(jī)。GnRH-a+HRT方案在月經(jīng)周期第2～5天給予GnRH-a(博福益普生，法國)3.75 mg肌肉注射1～3周期，末次注射后30 d左右開始準(zhǔn)備內(nèi)膜，方法同上。

卵裂胚的解凍在下午進(jìn)行，培養(yǎng)過夜后次日移植，在移植前行輔助孵化；囊胚期胚胎的解凍在早上移植前進(jìn)行，過程與胚胎解凍步驟相同，解凍后行輔助孵化。解凍后卵裂胚及囊胚的評分方法同前。根據(jù)患者條件移植1～2枚卵裂胚或囊胚。

5.黃體支持：所有入組患者均在轉(zhuǎn)化內(nèi)膜日隨機(jī)分為 2組，并簽署知情同意書。(1)常規(guī)黃體支持(B組)：自胚胎移植日起黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)60 mg/d肌肉注射+地屈孕酮(雅培，荷蘭)20 mg/d口服。內(nèi)膜準(zhǔn)備階段的雌激素同前繼續(xù)使用。(2)添加HCG黃體支持(A組)：在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日的第3天開始，給予HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)2 000 U肌肉注射，隔日一次，連續(xù)4次。其余同常規(guī)黃體支持。

胚胎移植后根據(jù)患者意愿可將肌肉注射黃體酮換為陰道用黃體酮軟膠囊(法杏，法國)0.2 g陰道置入，3次/d或黃體酮緩釋凝膠(默克雪蘭諾，瑞士)1.125 g，1次/d，口服地屈孕酮改為10 mg口服，3次/d。黃體支持至孕70 d逐漸減量并停藥。

6.隨訪：卵裂胚移植后14 d測血HCG≥50 U/L、囊胚移植后9 d測血HCG≥25 U/L為HCG陽性。血HCG陽性者根據(jù)患者情況雌激素逐漸減量停藥，黃體酮繼續(xù)用藥至孕70 天逐漸減量停藥。移植后4周行陰道B超確定臨床妊娠。定期通過電話隨訪患者。臨床妊娠是指B超可見孕囊樣回聲(包括異位妊娠)；自然流產(chǎn)是指妊娠小于28周發(fā)生的流產(chǎn)。

7.統(tǒng)計(jì)指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)：D3可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/2PN卵裂胚胎數(shù)×100%；D3優(yōu)胚率=優(yōu)胚數(shù)/2PN卵裂胚胎數(shù)×100%；囊胚形成率=可用囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎總數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=B超確定有孕囊的的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組基線情況比較

本研究共納入300例患者，其中A組150例，B組150例。兩組完成胚胎復(fù)蘇移植及隨訪者分別為124例及121例。兩組患者間年齡、不孕年限、不孕類型、不孕因素、AFC、BMI、bFSH相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

二、控制性促排卵(COH)方案及實(shí)驗(yàn)室情況

兩組患者間COH方案、授精方式、HCG日E2水平、獲卵數(shù)、D3可用胚胎率、D3優(yōu)胚率、囊胚形成率相比也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者基線資料[(-±s)，n(%)]

表2 兩組患者COH方案及實(shí)驗(yàn)室情況[(-±s)，n(%)]

三、FET周期臨床結(jié)局

在FET周期中，A組平均移植胚胎數(shù)多于B組，A組移植囊胚比例低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組胚胎種植率及臨床妊娠率低于B組(分別為58.97% vs. 70.07%，66.94% vs. 74.38%)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；兩組自然流產(chǎn)率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(8.43% vs.8.89%，P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者FET周期妊娠結(jié)局[(-±s)，n(%)]

四、不同移植胚胎類型的FET周期妊娠結(jié)局

1.卵裂胚移植：兩組間內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的選擇無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，均以單純HRT周期方案為主；A組平均移植胚胎數(shù)略高于B組，胚胎種植率及臨床妊娠率均略低于B組，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；A組自然流產(chǎn)率略高于B組，亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表4)。

2.囊胚移植：兩組間內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的選擇中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，均以單純HRT周期方案為主；A組平均移植胚胎數(shù)略高于B組，胚胎種植率、臨床妊娠率、自然流產(chǎn)率均略低于B組，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表5)。

表4 兩組患者卵裂胚FET妊娠結(jié)局[(-±s)，n(%)]

表5 兩組患者囊胚FET妊娠結(jié)局[(-±s)，n(%)]

五、二元Logistic 回歸分析

通過前向法構(gòu)建二元Logistic回歸模型，該模型的Hosmer和Lemeshow檢驗(yàn)擬合度χ2統(tǒng)計(jì)值為1.758(P=0.972)，說明該模型能夠很好地?cái)M合數(shù)據(jù)(P>0.05)。結(jié)果顯示：平均移植胚胎數(shù)[OR=0.343，95%CI(0.140，0.840)，P<0.05]及移植胚胎類型[OR=2.391，95%CI(1.051，5.439)，P<0.05]對是否臨床妊娠影響顯著；排除平均移植胚胎數(shù)及移植胚胎類型等混雜因素，黃體支持中添加HCG對臨床妊娠的影響并不顯著[OR=1.466，95%CI(0.826，2.604)，P>0.05](表6)。

表6 二元Logistic回歸分析

討 論

自從1983年人類第一次通過FET技術(shù)獲得妊娠以來，F(xiàn)ET技術(shù)已經(jīng)成為了輔助生殖中重要的一部分[4]。如何改善FET周期子宮內(nèi)膜發(fā)育與胚胎發(fā)育的同步性，從而提高臨床結(jié)局成為了臨床中研究的熱點(diǎn)。隨著對HCG及其受體的研究深入，發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育至2PN階段即可在胚胎培養(yǎng)液中檢測到HCG，且其濃度與妊娠率呈正相關(guān)[5]。目前的研究發(fā)現(xiàn)HCG對胚胎種植及子宮內(nèi)膜容受性均起著重要的作用[6-7]。但HCG是否可以改善FET周期子宮內(nèi)膜發(fā)育與胚胎發(fā)育的同步性從而改善妊娠結(jié)局仍存在爭議。

在本研究中，HRT-FET周期黃體支持中添加HCG對妊娠結(jié)局的改善并未起到明顯的促進(jìn)作用?？赡苄缘慕忉尰蛟S有：(1)HCG的黃體支持作用是刺激黃體細(xì)胞產(chǎn)生更多內(nèi)源性激素改善黃體功能。但在HRT-FET周期，并無黃體細(xì)胞，無HCG作用的靶細(xì)胞。(2)胚胎來源的HCG在局部植入位點(diǎn)表達(dá)的HCG量或許就足以支持母胎界面的分子對話。

Fazleabas等[8]在HRT周期中給狒狒宮腔內(nèi)灌注HCG后可以誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞和腺上皮蛋白的表達(dá)從而改善子宮內(nèi)膜環(huán)境[8]；Licht等[9]發(fā)現(xiàn)HCG宮腔灌注后不利于胚胎植入的因子水平被顯著抑制，而促進(jìn)胚胎植入的因子水平顯著增加。在胚胎植入時(shí)，HCG等激素的調(diào)控胚胎及子宮內(nèi)膜進(jìn)行信號釋放及應(yīng)答，通過信號途徑，不斷調(diào)整自身，調(diào)節(jié)母胎界面的交互作用[10]，促進(jìn)胚胎植入。但張樂等[11]的Meta分析顯示，胚胎移植前宮腔灌注HCG僅在移植卵裂胚，且HCG濃度>500 U時(shí)可改善妊娠結(jié)局。以上研究提示了HCG濃度及胚胎發(fā)育程度對妊娠結(jié)局的重要作用。以上研究提示了HCG宮腔灌注對妊娠結(jié)局起著積極的作用。目前臨床中使用的HCG藥物制劑(包括尿源性或基因重組來源者)中在胚胎植入過程中起著重要作用的高糖基化HCG(H-HCG)含量少，大部分為常規(guī)HCG；并且，HCG兼具內(nèi)分泌和旁分泌作用，HCG肌肉注射后子宮內(nèi)膜局部的H-HCG濃度可能更低，這也可能是宮腔灌注HCG可通過旁分泌起到促進(jìn)胚胎著床的作用，而肌肉注射用藥效果不佳的可能原因之一。

2017年Shiotani等[12]的研究共納入173例HRT-FET周期的患者，在HRT周期D17和D20移植胚胎，研究組在第17、20、23天給予3 000 U HCG，結(jié)果表明添加HCG并未明顯改善臨床妊娠率、種植率；2012年Eftekhar等[13]對130個HRT-FET周期進(jìn)行了隨機(jī)對照研究，HCG組(在內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日及胚胎移植日各給予HCG 5 000 U)的種植率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率和流產(chǎn)率與對照組相比均無顯著差異。然而，該研究團(tuán)隊(duì)在隨后的研究中增加樣本量(200例)并改變用藥方案，HCG組患者從移植日開始每72 h肌肉注射HCG 5 000 U，共3次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCG組較對照組HCG陽性率、臨床妊娠率明顯增加，且流產(chǎn)率有降低的趨勢[14]。賈學(xué)玲等[15]回顧性分析了156個HRT-FET周期，發(fā)現(xiàn)在HRT周期添加小劑量HCG可以改善FET患者的子宮內(nèi)膜厚度、血流及妊娠結(jié)局。劉燕[16]對97例患者行前瞻性隨機(jī)對照研究，均使用GnRH-a +HRT周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，研究組在內(nèi)膜達(dá)標(biāo)時(shí)單次注射rHCG 250 μg，兩天后予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜；與對照組(直接轉(zhuǎn)化內(nèi)膜)相比，胚胎種植率(42.55% vs. 21.28%，P<0.05)及臨床妊娠率(59.57% vs. 38.30%，P<0.05)均顯著增高，作者認(rèn)為在HRT周期肌肉注射HCG可以改善臨床妊娠結(jié)局。綜上所述，關(guān)于在HRT-FET周期黃體支持中添加HCG的有效性，目前的研究中患者異質(zhì)性很大，結(jié)果及結(jié)論也不盡相同。

我們的研究提示，在HRT-FET周期黃體支持中添加HCG并不能改善妊娠結(jié)局，且胚胎種植率有下降的趨勢。因此，不建議在HRT-FET周期黃體支持中添加HCG。異常的HCG刺激還可能有害于胚胎種植。Evans等[17]比較了輔助生殖技術(shù)受孕婦女與自然受孕婦女的子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)延長使用低劑量HCG可以下調(diào)HCG受體表達(dá)，觸發(fā)HCG受體內(nèi)化，使受體下游傳導(dǎo)信號脫敏，尤其是立即使用模擬囊胚來源的高劑量的HCG后尤其嚴(yán)重，結(jié)果導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞粘附能力和緊密連接調(diào)節(jié)受損。

本研究的優(yōu)勢在于前瞻性隨機(jī)對照研究，有嚴(yán)格納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，患者可比性較好。但本研究同樣有其局限性，包括：最終納入樣本量小，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究；排除了于子宮內(nèi)膜<8 mm、高齡、多周期者等條件較差的患者，可能使得研究結(jié)論的普適性有限；兩組患者間移植胚胎數(shù)目及移植胚胎類型不同，有待擴(kuò)大樣本量細(xì)化分組分析。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HRT-FET周期黃體支持中添加HCG并未明顯改善患者的臨床妊娠結(jié)局，不建議在HRT-FET周期黃體支持中添加HCG。需要有多中心的大樣本前瞻性隨機(jī)對照安慰劑盲法研究，以進(jìn)一步研究添加HCG在HRT-FET周期黃體支持中的有效性(包括適用人群、添加時(shí)機(jī)和方案等)以及相關(guān)機(jī)制，從而為HCG在臨床的合理應(yīng)用提供依據(jù)。