纖維素酶降解纖維素的機(jī)制及其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

寧俊平，孫玲利，孫如玉，徐瑩，張旭陽，張淑芳

（1.汝州市畜牧局，河南 汝州 467500；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院；3.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所）

1 纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)及作用特征

1906 年，Seilliere 發(fā)現(xiàn)蝸牛的消化液能夠水解棉花纖維素并產(chǎn)生葡萄糖，這是人類首次發(fā)現(xiàn)纖維素酶；1933年，Grassman等研究了一種真菌的纖維素酶系，分離出兩個(gè)組分，這是人們首次從真菌中分離出纖維素酶，此后纖維素酶的研究和應(yīng)用便逐步受到世界各國的普遍關(guān)注。

纖維素分解酶是一種多組分的復(fù)合酶系，是能夠?qū)⒗w維素降解轉(zhuǎn)化生成葡萄糖的一組酶的總稱。纖維素酶主要通過水解作用，使連接葡萄糖分子的β-l，4-糖苷鍵斷裂，最終將纖維素分解成單個(gè)的葡萄糖分子。諸多研究普遍表明，纖維素的完全降解至少需要三種酶，根據(jù)其催化作用不同，分為：①內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶（endo-β-1，4-glucanase，EG）：該酶是纖維素酶系中最重要的酶，由于此酶的活性經(jīng)常由CMC 作為底物測量，因此也稱CMCase、Cx 酶。這類酶主要作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-l，4-糖苷鍵，從而將纖維素長鏈分子截短，產(chǎn)生大量具有還原性末端的小分子纖維素。②外切-β-1，4-葡聚糖酶（exo-β-1，4-glucanase，CBH）：這類酶可從纖維素分子的還原或非還原端切割糖苷鍵，每作用一次可生成一個(gè)纖維二糖分子，但是經(jīng)過該酶充分作用的微晶纖維素則最終生成纖維糊精和纖維二糖，所以也叫纖維二糖水解酶（簡稱CBH）或C1 酶。③β-1，4-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG）：它能水解纖維二糖生成單個(gè)的葡萄糖分子，由于該酶不直接作用于纖維素，可以消除上述兩種酶產(chǎn)物對(duì)水解反應(yīng)的抑制作用，因此可快速水解纖維二糖和纖維三糖。這三種酶功能雖不同，但具有互補(bǔ)作用的活性酶組分，三者以接力方式把長鏈纖維素逐步降解成短鏈，再降解成二糖結(jié)構(gòu)，最后生成單糖，整個(gè)反應(yīng)過程需要各種酶之間相互配合作用，缺一不可。當(dāng)然實(shí)際的纖維素酶系遠(yuǎn)不止三種，一些纖維素酶也不僅僅只參與纖維素降解的單個(gè)步驟。

2 纖維素酶的催化機(jī)制

目前，關(guān)于纖維素酶的降解機(jī)制普遍接受的是協(xié)同作用模型，該酶在降解過程中，首先由CX酶在纖維素聚合物的內(nèi)部起作用，在纖維素的非結(jié)晶部位進(jìn)行切割產(chǎn)生新的末端，然后再由C1 酶以纖維二糖為單位，從末端進(jìn)行水解，后由β-1，4-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解為葡萄糖，如圖1。

圖1 纖維素酶系協(xié)同降解纖維素的過程

3 纖維素酶活性的測定

3.1 總酶活力的測定方法

纖維素酶是多組分酶，各組分間有協(xié)同作用，會(huì)形成多種產(chǎn)物和涉及多種反饋控制機(jī)理，這就使得酶活力測定方法非常困難，國內(nèi)外報(bào)道過的測定纖維素酶活力的方法很多，其中運(yùn)用較廣泛、有代表性的有以下幾種。

3.1.1 濾紙崩潰法

由于濾紙所含纖維素結(jié)構(gòu)與天然纖維素相似，以濾紙為底物測定酶活力更有代表性。通常采用恒溫振蕩器，將一定規(guī)則的濾紙片作為底物浸入裝有酶液的試管中，在最佳溫度和最佳pH 值條件下微振蕩，直至濾紙崩潰。計(jì)算濾紙完全崩潰所需的時(shí)間，求得酶活力。在此基礎(chǔ)上發(fā)展的測定濾紙失重情況來測定酶活力，克服了由于測定濾紙的崩潰時(shí)間較難確定而造成誤差大的問題。在一定溫度和最佳pH 值條件下，讓酶液與濾紙保溫反應(yīng)一段較長的時(shí)間，一般需要兩個(gè)星期以上，然后將濾紙條水洗、烘干，測量出濾紙前后的質(zhì)量變化，算出濾紙失重率，求得酶活力。

3.1.2 棉線切斷法

將細(xì)棉線的一端浸入含有適量酶液的試管中，在一定溫度和最佳pH 值條件下微振蕩，測定棉線被切斷所需的時(shí)間，求得酶活力。

3.1.3 分光光度計(jì)法

當(dāng)酶促反應(yīng)發(fā)生，生成的糖類物質(zhì)與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，用分光光度計(jì)在500 nm 左右的波長范圍內(nèi)測定吸光度，換算成還原糖含量，然后計(jì)算出酶活力。德國的萃取化學(xué)公司率先開發(fā)出了用CMC 鈉鹽作底物，以2-羥基-3，5-二硝基苯甲酸作顯色劑的分光光度計(jì)法。分光光度計(jì)法可大大縮短酶活力測定所需要的時(shí)間，而且精確度高，得到了廣泛應(yīng)用。國內(nèi)外許多科研機(jī)構(gòu)根據(jù)自己的研究目的，采用不同的顯色劑和底物，又由此衍生出更多的方法。日本受就此啟發(fā)，開發(fā)出了濁度法，用0.03%微晶纖維素（Avicel）在最佳溫度和pH 值條件下經(jīng)過酶液作用后，通過分光光度計(jì)來測定溶液濁度的減少來代表酶活力。

3.1.4 粘度測定法

由于發(fā)現(xiàn)纖維素酶不僅能液化粘度較大的羧甲基纖維素鈉溶液，而且酶活力與溶液的液化程度成正相關(guān)，因此可以通過測定CMC 粘度降低推算出酶活力，有旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)法和工研法兩種。

3.1.5 平板法

利用磷酸膨脹纖維素制成均勻的雙層平板，纖維素酶能在其上形成清晰的透明圈，利用此法可在平板上對(duì)纖維素酶產(chǎn)生菌進(jìn)行篩選，可以大大提高工作效率。此法廣泛應(yīng)用于產(chǎn)纖維素酶的真菌選育中。

3.2 單一纖維素酶組分活力的測定

近年來國內(nèi)外通用的和新提出的一些纖維素酶活力測定方法大都是采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法來測定還原糖的生成量，該法簡單、靈敏。

3.2.1 外切葡聚糖酶（CBH）活力測定

Desphande 等以合成的PNPC 為底物，以對(duì)硝基苯的生成量用于檢測CBH活力，劉潔等人依據(jù)CBH、EG 和CB三類組分在棉纖維上吸附和脫吸能力不同設(shè)計(jì)出了一種簡易測定CBH 的方法，日本還采用微晶纖維素為底物水解得還原糖量計(jì)算酶活力，同樣可得到CBH活力。

3.2.2 內(nèi)切葡聚糖酶（EG）活力的測定

以無定形纖維素為底物，以還原糖的生成量可表征EG組分活力。Ghose所推薦的測定EG酶活力的方法是：用0.5 mL 2% CMC 于0.05 mol/ L 檸檬酸緩沖溶液中，50 ℃反應(yīng)30 min，加入的酶液量以能形成0.5 mg 葡萄糖為準(zhǔn)，然后DNS法測定糖生成量，然后計(jì)算出酶活力。此外，還可以利用測定高分子溶液粘度來導(dǎo)出其聚合度和分子量的方法來表征EG 活力，此法可測得初速度，因而確切反映EG活力，且靈敏度較高。

3.2.3 纖維二糖酶（CB）活力測定

從纖維素酶解機(jī)制來看，可以纖維素二糖為底物，經(jīng)過酶解后測葡萄糖生成量表征纖維二糖酶活力。由于纖維二糖和葡萄糖都具有還原性，通常的定糖方法不能區(qū)分，常用人工合成的糖苷化合物，如對(duì)硝基酚-β-葡萄糖苷、水楊素等作底物測定產(chǎn)生的對(duì)硝基酚或葡萄糖生成量。而各種β-葡萄糖苷組分對(duì)糖基和糖苷基專一性的要求有差別，因此得到的結(jié)果通稱為β-葡萄糖苷酶活，與纖維素二糖酶活有區(qū)別。

4 纖維素酶在畜牧業(yè)上的應(yīng)用

纖維素酶作為一種新型飼料添加劑，能將麥秸、稻草、玉米芯等粗飼料轉(zhuǎn)化為糖、菌體蛋白等，從而降低飼料中的粗纖維含量，提高粗飼料營養(yǎng)價(jià)值，在畜牧生產(chǎn)中發(fā)揮著極大的作用。其功效體現(xiàn)在：①單胃動(dòng)物如豬、雞等體內(nèi)由于缺乏內(nèi)源性纖維素酶，不能消化纖維素，日糧添加纖維素酶可補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足，改善腸道菌群，提高其對(duì)粗纖維的利用率。②纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶協(xié)同作用可破壞植物的細(xì)胞壁，促使細(xì)胞內(nèi)容物釋放，提高養(yǎng)分的消化和非淀粉多糖的利用率。③添加纖維素酶可去除果膠、半纖維素、β-葡聚糖和戊聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子造成的吸收障礙，增加內(nèi)源酶的擴(kuò)散，并使酶與養(yǎng)分充分接觸，促進(jìn)飼料的良好消化吸收。④可維持小腸絨毛形態(tài)完整，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。大量的試驗(yàn)也證明了飼料中添加纖維素酶對(duì)豬、雞、牛、羊、魚等的飼喂效果十分顯著。匈牙利學(xué)者在豬飼料中按纖維含量的1%添加纖維素酶可提高豬日增重5%，改善飼料轉(zhuǎn)化效率7.8%。日本研究人員證明雞日糧中添加0.2%的纖維素酶，可使雞日增重提高5%～10%。

綜上，近年來，對(duì)纖維素的應(yīng)用研究不斷深入，尤其篩選高效的纖維素酶降解纖維素已成為研究熱點(diǎn)。該文對(duì)纖維素酶的結(jié)構(gòu)特性、催化機(jī)制、酶活測定方法及應(yīng)用進(jìn)行論述，今后可加大對(duì)纖維素酶的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量分析，以確立最佳產(chǎn)酶條件并利于酶系的篩選。