嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)α-半乳糖苷酶影響因素的研究

韋陽(yáng)道，易　弋，石征宇，鄧　春，伍時(shí)華，黎　婭*（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)α-半乳糖苷酶影響因素的研究

韋陽(yáng)道，易弋，石征宇，鄧春，伍時(shí)華，黎婭*
（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

該文對(duì)前期篩選出的嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響因素進(jìn)行了初步的研究，通過(guò)測(cè)定α-半乳糖苷酶酶活，探究了培養(yǎng)基成分（包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽）及培養(yǎng)條件（初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間）對(duì)該嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)α-半乳糖苷酶能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)該菌產(chǎn)酶最有效的碳源為3%豆粕，氮源為0.5%硝酸鉀，附加氮源為0.5%酵母浸出物；添加0.5%氯化鈉和0.1%磷酸氫二鉀有助于該菌產(chǎn)酶。另外，該菌最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度為60℃，培養(yǎng)基最適初始pH在7.0～8.0，培養(yǎng)時(shí)間為65 h。

嗜熱脫氮芽孢桿菌；α-半乳糖苷酶；酶活；影響因素

α-半乳糖苷是由一個(gè)蔗糖單位（果糖-葡萄糖）與一個(gè)或多個(gè)α-D-半乳糖分子以α-D-1，6-糖苷鍵連接構(gòu)成的低聚糖類物質(zhì)，主要有三糖棉子糖（raffinose）、四糖水蘇糖（stachyose）和五糖毛蕊花糖（verbascose）等。α-半乳糖苷類物質(zhì)在植物性飼料中廣泛存在，其中在豆類飼料中含量最高［1］。由于其不能被動(dòng)物所利用，間接影響了飼料的利用率，同時(shí)會(huì)在消化道后端由微生物發(fā)酵作用，而引起動(dòng)物消化不良、氣脹等不良的影響，這些都比較大大的降低了飼料的飼用價(jià)值［2-5］。α-半乳糖苷酶（α-galactosidase）E.C. 3.2.1.22是一種生物催化劑，它能夠特異性催化α-半乳糖苷類物質(zhì)末端的α-1，6-半乳糖苷鍵的水解從而釋放出半乳糖被動(dòng)物所利用［6］，大大降低豆類飼料引發(fā)的幼齡動(dòng)物腹瀉現(xiàn)象，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能和抗病能力，減輕了消化器官代償性增生和肥大，對(duì)于提高飼料能量效價(jià)有非常大的作用，因此被認(rèn)為是第三代飼料酶。由于飼料加工過(guò)程中有高溫工藝，會(huì)導(dǎo)致酶失活，因此，熱穩(wěn)定性好的α-半乳糖苷酶因其特殊性逐漸引起了飼料工業(yè)的關(guān)注。在前期的工作中，課題組分離出一株嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5，其具有產(chǎn)α-半乳糖苷酶的特性，并且酶的熱穩(wěn)定性較好［7］。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽）及培養(yǎng)條件（初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間）對(duì)菌株YWX5產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響，為該菌株的工業(yè)化應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

嗜熱脫氮芽孢桿菌（Geobacillus thermodenitrificans）YWX5：廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究室分離并保藏。

1.1.2化學(xué)試劑

對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)品：科密歐化學(xué)試劑有限公司；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；蛋白胨（99.5%）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；檸檬酸（99.5%）：廣東達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品公司；磷酸氫二鈉（99.0%）：天津博迪化工股份有限公司。

檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 7.0）：0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液16.47 mL和0.1 mol/L檸檬酸溶液3.53 mL混合，稀釋至80 mL。

1.1.3培養(yǎng)基

初始發(fā)酵培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)［8］略做修改：2%豆粕加水沸水煮1 h后冷卻，4 000 r/min離心除去沉淀得上清，0.5% KNO3，0.1%K2HPO4；使用1mol/L的氫氧化鉀溶液和1mol/L的硝酸溶液調(diào)pH值為7.0，于121℃滅菌20 min。

LB種子液培養(yǎng)基：1%NaCl，1%蛋白胨，0.5%酵母浸出液，于121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1100紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；ZFD-5250全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱、HWY-2112全溫度恒溫調(diào)速搖床柜：上海智城分析儀器制造有限公司；Micro 220R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)HETTICH公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1酶活的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

α-半乳糖苷酶的測(cè)定采用紫外可見(jiàn)分光光度法。

（1）對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確配制一系列濃度梯度（0.05 μmol/L、0.10 μmol/L、0.15μmol/L、0.20μmol/L、0.25μmol/L）的對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)品，取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品加入1.6 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 7.0），再加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3，混合均勻后于波長(zhǎng)405 nm處測(cè)OD405nm值［9］。

（2）α-半乳糖苷酶酶活的測(cè)定方法

將嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5培養(yǎng)液于4℃、4 500 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液0.1 mL，加入0.2 mL 5 mmol/L的底物p-NPG，加入1.8 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 7.0）使反應(yīng)體系體積為2.1 mL，于65℃精確反應(yīng)10 min，立即加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液中止反應(yīng)。對(duì)照組先加入Na2CO3溶液中止反應(yīng)再加入底物，其他同實(shí)驗(yàn)組?；旌暇鶆蚶鋮s至室溫于波長(zhǎng)405 nm處測(cè)OD405nm值［10］，再按照對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算對(duì)硝基酚的量，從而計(jì)算酶的活力，其計(jì)算公式如下：

式中：A為α-半乳糖苷酶酶活，U/mL；y是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程所得的對(duì)硝基苯酚濃度，μmol/L；N為酶液稀釋倍數(shù)；V為反應(yīng)所用的酶量，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

酶活力單位定義：在標(biāo)準(zhǔn)條件下（pH值為4.5、37℃），每分鐘釋放出1 μmol產(chǎn)物對(duì)硝基酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.3.2碳源對(duì)嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)酶能力的影響

（1）不同種類的碳源對(duì)產(chǎn)酶能力的影響

分別以含量為2%的蔗糖、棉子糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、1%葡萄糖+1%的棉子糖為碳源代替初始發(fā)酵培養(yǎng)基中2%的豆粕，將菌株（20μL的種子接種于10mLLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h）按2%接種量接種于各培養(yǎng)基中于60℃培養(yǎng)2 d，以未接種的培養(yǎng)基為對(duì)照測(cè)定培養(yǎng)液OD600nm及上清液酶活，考察不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

（2）豆粕含量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力影響

將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中2%的豆粕含量設(shè)置為1%～5%，將菌株等量接種于各培養(yǎng)基中于60℃培養(yǎng)2 d，以未接種的培養(yǎng)基為對(duì)照測(cè)定培養(yǎng)液OD600nm及上清液酶活，考察豆粕質(zhì)量濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

（3）附加碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力影響

在最優(yōu)豆粕含量培養(yǎng)基中加入0～4%的棉子糖作為附加碳源，其他操作同上，考察附加碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

1.3.3氮源對(duì)嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)酶能力的影響

（1）不同種類的氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

分別以0.5%蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白、大豆蛋白、（NH4）2SO4為氮源代替初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的0.5%的KNO3，其他組分不變，考察不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

（2）硝酸鉀含量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

將初始培養(yǎng)基中的0.5%的KNO3設(shè)置為0.3%～1.5%含量范圍，其他組分不變，考察不同硝酸鉀含量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

（3）附加氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中加入含量0～1%的酵母浸出物，其他組分不變，考察不同的酵母提取物對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

1.3.4無(wú)機(jī)鹽對(duì)嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)酶能力的影響

分別以0.5%NaCl、0.1%K2HPO4、0.01%CaCl2、0.01% MgSO4、0.001%MnSO4、0.001%FeSO4代替初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸氫二鉀（各無(wú)機(jī)鹽含量參考文獻(xiàn)［11］），以不加無(wú)機(jī)鹽的初始培養(yǎng)基作為對(duì)照組，其他組分不變，考察不同含量無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

1.3.5培養(yǎng)溫度對(duì)嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)酶能力的影響

將菌株按2%的接種量接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后分別于40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃培養(yǎng)2 d，以未接種的培養(yǎng)基為對(duì)照測(cè)定培養(yǎng)液OD600nm及上清液酶活，考察不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

1.3.6培養(yǎng)基初始pH值對(duì)嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)酶能力的影響

將菌株按2%的接種量接種于初始pH值為5、6、7、8、9的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中于60℃培養(yǎng)2 d，以未接種的培養(yǎng)基為對(duì)照測(cè)定培養(yǎng)液OD600nm及上清液酶活，考察不同培養(yǎng)初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

1.3.7培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

將菌株按2%的接種量接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后分別在60℃培養(yǎng)5 h、8 h、16 h、22 h、25 h、30 h、32 h、41 h、45 h、50 h、55 h、65 h、70 h、75 h、80 h、90 h，以未接種的培養(yǎng)基為對(duì)照測(cè)定培養(yǎng)液OD600nm及上清液酶活，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度（y）為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)405 nm處的吸光度值（x）為橫坐標(biāo)，繪制對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of p-nitrophenol

由圖1可知，對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y= 0.227 7x+0.004 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9，表明二者線性關(guān)系良好。

2.2碳源對(duì)產(chǎn)酶能力的影響

2.2.1不同碳源對(duì)產(chǎn)酶能力的影響

圖2　不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on α-galactosidase production and strain growth

菌株YWX5在相應(yīng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后測(cè)定OD600nm及酶活所得的結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖2可知，不同種類的碳源對(duì)嗜熱脫氮芽孢桿菌的產(chǎn)酶及生長(zhǎng)能力的影響有很大差異。該菌在以棉子糖為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)酶能力較強(qiáng)（0.018U/mL），以蔗糖及葡萄糖為碳源時(shí)也能產(chǎn)生一定的α-半乳糖苷酶，分別為0.002 U/mL和0.001 U/mL。其他糖類如乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、葡萄糖+棉子糖作為碳源并不能誘導(dǎo)該菌產(chǎn)酶。使用糖類作為唯一碳源即使培養(yǎng)2 d后菌株的最高酶活也僅有0.019U/mL，最高生物量OD600nm值也只有0.112，這說(shuō)明僅僅利用單一糖類作為碳源并不能滿足嗜熱脫氮芽孢桿菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的營(yíng)養(yǎng)需求，故本實(shí)驗(yàn)以豆粕（酶活為0.161 U/mL，OD600nm值為0.483）作為碳源的基礎(chǔ)成分。

2.2.2不同含量的豆粕對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同含量的豆粕對(duì)產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖3，由圖3可知，當(dāng)豆粕含量1%～3%，隨著豆粕含量的增加酶活也相應(yīng)的增加；當(dāng)豆粕含量為3%時(shí)，酶活及生物量達(dá)到最高（平均酶活=0.215 U/mL，OD600nm=0.530）；當(dāng)豆粕含量＞3%時(shí)，生物量隨豆粕含量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。故該菌在豆粕含量為3%的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力最佳。

圖3　不同豆粕添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different soybean meal addition on the α-galactosidase production and strain growth

2.2.3附加碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖4　不同棉子糖添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different raffinose addition on the α-galactosidase production and strain growth

據(jù)報(bào)道，在培養(yǎng)基中加入一定質(zhì)量濃度的棉子糖可以進(jìn)一步提高α-半乳糖苷酶的產(chǎn)量［9］。許堯興等［12］在研究中發(fā)現(xiàn)在麩皮和豆粕粉（質(zhì)量比為7∶3）的培養(yǎng)基中加入2%的棉子糖可以進(jìn)一步使黑曲霉變種α-半乳糖苷酶的的產(chǎn)量提高16%。但是在本實(shí)驗(yàn)中，3%豆粕的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上加入0～4%的棉子糖并不能促進(jìn)該菌產(chǎn)α-半乳糖苷酶（見(jiàn)圖4），反而呈現(xiàn)略微抑制的現(xiàn)象。這可能是因?yàn)槎蛊芍幸呀?jīng)含有大量的棉子糖，該菌對(duì)棉子糖的需求已經(jīng)達(dá)到飽和，所以再加入棉子糖已經(jīng)不能再對(duì)該菌產(chǎn)酶產(chǎn)生促進(jìn)作用。因此培養(yǎng)基中不再加入棉子糖。

2.3氮源對(duì)產(chǎn)酶能力的影響

2.3.1不同氮源對(duì)產(chǎn)酶能力的影響

不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，可以看出氮源對(duì)菌株YWX5產(chǎn)酶的促進(jìn)能力由高到低依次為KNO3（0.161 U/mL）、酵母浸出物（0.099 U/mL）、蛋白胨（0.073 U/mL）、（NH4）2SO4（0.069 U/mL）、大豆蛋白（0.055 U/mL）、酪蛋白（0）。故以KNO3為氮源。從生物量明顯可以看出也是KNO3（OD600nm=0.482）的效果最佳，其次是大豆蛋白（OD600nm=0.347）。另外，嗜熱脫氮芽胞桿菌在酪蛋白培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)（OD600nm=0.198）卻不能產(chǎn)生α-半乳糖苷酶。由此可見(jiàn)，以KNO3為氮源最佳。

圖5　不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on the α-galactosidase production and strain growth

2.3.2硝酸鉀含量對(duì)產(chǎn)酶能力的影響

圖6　不同硝酸鉀含量對(duì)菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of different KNO3addition on the α-galactosidase production and strain growth

硝酸鉀含量對(duì)產(chǎn)酶能力的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，當(dāng)硝酸鉀含量為0.5%時(shí)產(chǎn)酶最佳，酶活達(dá)到0.153 U/mL，此時(shí)菌液OD600nm為0.436，繼續(xù)增加硝酸鉀的含量只有輕微的刺激菌體生長(zhǎng)的作用，且產(chǎn)酶量會(huì)有所下降。因此0.5%的硝酸鉀是最佳含量。

2.3.3附加氮源對(duì)產(chǎn)酶能力的影響

在以0.5%硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基中加入0～1%的酵母浸出物，隨著其添加量增高，菌株產(chǎn)酶能力也相應(yīng)提高，直至酵母浸出物添加量為0.5%（0.263 U/mL）時(shí)，酶活不再升高（見(jiàn)圖7）。但是生物量卻是先升高后下降，這可能是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)增加后菌株的生長(zhǎng)加快，以致檢測(cè)時(shí)菌株的生長(zhǎng)周期已進(jìn)入衰亡期。因此培養(yǎng)基中添加0.5%的酵母浸出物有利于菌株產(chǎn)酶能力的提高。

圖7　不同酵母浸出物添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of different yeast extracts addition on the α-galactosidase production and strain growth

2.4無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶能力的影響

圖8　不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effect of different inorganic salts on the α-galactosidase production and strain growth

無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響見(jiàn)圖8。由圖8可知，當(dāng)培養(yǎng)基中加入NaCl和K2HPO4時(shí)產(chǎn)酶有所提高，加入其他無(wú)機(jī)鹽（如CaCl2、MgSO4、MnSO4、FeSO4）時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶能力作用影響較小，LEE J等［11］在研究芽孢桿菌LX-1產(chǎn)α-半乳糖苷酶時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入一定濃度無(wú)機(jī)鹽幾乎都可以在一定程度上加強(qiáng)產(chǎn)酶，尤其加入硫酸錳可以大幅度提高酶產(chǎn)量，但是本實(shí)驗(yàn)并未得到類似的結(jié)果，這說(shuō)明不同微生物產(chǎn)α-半乳糖苷酶所需要的無(wú)機(jī)鹽的種類有所差別。因此培養(yǎng)基中加入NaCl和K2HPO4有利于YWX5產(chǎn)酶能力的增強(qiáng)。

2.5培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶能力的影響

溫度對(duì)嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響如圖9所示。由圖9可知，該菌在50～70℃內(nèi)都能夠生長(zhǎng)及產(chǎn)酶，并且隨著培養(yǎng)溫度的改變，菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的變化趨勢(shì)幾乎一致。40℃時(shí)幾乎不生長(zhǎng)不產(chǎn)酶，隨著溫度的升高該菌生物量及產(chǎn)酶均增長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為60℃時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)酶量0.156 U/mL，最大OD600nm為0.462。繼續(xù)升高培養(yǎng)溫度，產(chǎn)酶量及生物量均有所下降。因此，該菌產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的最佳溫度條件為60℃。

圖9　培養(yǎng)溫度對(duì)菌株酶活及生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect of culture temperature on α-galactosidase production and strain growth

2.6培養(yǎng)基初始pH值對(duì)嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)酶能力的影響

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響見(jiàn)圖10。由圖10可知，隨著pH值的改變，該菌產(chǎn)酶及生物量的變化趨勢(shì)幾乎一致，呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在pH值為7.0～8.0時(shí)，該菌產(chǎn)α-半乳糖苷酶的酶活和生物量相差無(wú)幾，達(dá)到最大（pH7.0（0.158 U/mL，OD600nm=0.45）～8.0（0.158 U/mL，OD600nm=0.48）），所以最適初始pH值應(yīng)在7.0～8.0。

圖10　初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.10 Effect of initial pH on α-galactosidase production and strain growth

2.7培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響見(jiàn)圖11，由圖11可知，菌株在8～32h生物量迅速增長(zhǎng)，之后變得緩慢，在45～55 h基本維持穩(wěn)定，其中在50h時(shí)菌株生物量達(dá)到最大。而酶活在8～50 h增長(zhǎng)迅速，之后增長(zhǎng)變得緩慢，在55～70 h基本維持穩(wěn)定，其中在65 h時(shí)酶活達(dá)到最大（0.215 U/mL）。因此，培養(yǎng)時(shí)間65 h為菌株產(chǎn)酶的最佳時(shí)間。

圖11　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶及生長(zhǎng)的影響Fig.11 Effect of culture time on α-galactosidase production andstrain growth

2.8討論

α-半乳糖苷酶是一種誘導(dǎo)酶，誘導(dǎo)物通常是底物或底物類似物。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于α-半乳糖苷酶的分子調(diào)控機(jī)制已有一定的研究［13-14］，雖然不同來(lái)源的α-半乳糖苷酶的表達(dá)及調(diào)控模式是不同的，但都是通過(guò)一個(gè)或多個(gè)操縱子（分別）調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的，誘導(dǎo)物通過(guò)與阻遏蛋白作用而使阻遏蛋白不能發(fā)揮功能，進(jìn)而使α-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因可以正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在已報(bào)道的研究中葡萄糖對(duì)α-半乳糖苷酶的產(chǎn)生有一定的抑制作用［15］，研究者認(rèn)為葡萄糖通過(guò)分解代謝物阻遏的方式來(lái)抑制α-半乳糖苷酶的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)利用葡萄糖與另一誘導(dǎo)物（棉子糖）一起作為碳源來(lái)培養(yǎng)該嗜熱脫氮芽孢桿菌，得到的結(jié)果與已報(bào)道的研究結(jié)果類似，即葡萄糖對(duì)α-半乳糖苷酶的的產(chǎn)生有抑制作用，但是其對(duì)該酶的抑制程度要比已報(bào)道的酶強(qiáng)很多，產(chǎn)酶量甚至不如單一加入葡萄糖的情況。在黑曲霉等真菌中，蔗糖是很好的誘導(dǎo)因子［16］，也有報(bào)道指出麥芽糖對(duì)部分菌種產(chǎn)α-半乳糖苷酶有較好的誘導(dǎo)作用［11］，而在本實(shí)驗(yàn)中蔗糖和麥芽糖的誘導(dǎo)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上棉子糖，這可能是因?yàn)槲⑸锊町愒斐傻?。在生長(zhǎng)方面，蔗糖促進(jìn)該菌生長(zhǎng)的情況相對(duì)較優(yōu)，其次是棉子糖。除了碳源外，氮源對(duì)微生物的生長(zhǎng)、生理等也是至關(guān)重要的。已有報(bào)道指出有機(jī)和無(wú)機(jī)混合氮源通常都能在一定程度上提高菌株的產(chǎn)α-半乳糖苷酶能力［11］，本實(shí)驗(yàn)也得到類似的結(jié)果，當(dāng)KNO3與酵母浸出物混合使用時(shí)，菌株YWX5的產(chǎn)酶能力進(jìn)一步提高。此外，該菌的耐熱性較好，在70℃條件下培養(yǎng)仍然能夠生長(zhǎng)及產(chǎn)酶，最適培養(yǎng)及產(chǎn)酶溫度為60℃，這大大降低了細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)雜菌污染的危險(xiǎn)。但菌株YWX5在40℃時(shí)不生長(zhǎng)，高溫培養(yǎng)所需的能耗也阻礙了該菌的應(yīng)用。

3　結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)YWX5的產(chǎn)酶能力的研究，得出該菌產(chǎn)酶最有效的碳源為3%豆粕、氮源為0.5%硝酸鉀、附加氮源為0.5%酵母浸出物，培養(yǎng)基中添加0.5%氯化鈉和0.1%磷酸氫二鉀有助于該菌產(chǎn)酶。另外，該菌最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度為60℃，培養(yǎng)基最適初始pH在7.0～8.0，培養(yǎng)時(shí)間為65 h。雖然本研究對(duì)于提高該嗜熱脫氮芽孢桿菌YWX5的α-半乳糖苷酶產(chǎn)量有一定成效，但是單位體積（1 mL）內(nèi)的粗酶液活性與其他已報(bào)道菌株相比還是偏低［16］。微生物發(fā)酵的影響因素眾多，要大幅度提高菌株YWX5α-半乳糖苷酶的產(chǎn)量，還需對(duì)其發(fā)酵條件及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入的研究。此外，考慮到該菌不能在低溫條件下生長(zhǎng)，不利于工業(yè)應(yīng)用，采用基因工程手段獲得α-半乳糖苷酶高效表達(dá)的工程菌株可能是該嗜熱酶實(shí)現(xiàn)應(yīng)用的有效手段。

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Influencing factors ofGeobacillus thermodenitrificanson α-galactosidase-production

WEI Yangdao，YI Yi，SHI Zhengyu，DENG Chun，WU Shihua，LI Ya*
（College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

The influencing factors of the preliminarily screenedGeobacillus thermodenitrificansYWX5 on α-galactosidase production were studied. By the α-galactosidase activity determination，the effect of medium composition（including carbon sources，nitrogen sources and initial pH），culture temperature and time on α-galactosidase production ofG.thermodenitrificansYWX5 was investigated.The results showed the most effective carbon source was soybean meal 3%，the most effective nitrogen source was KNO30.5%，and enzyme production was promoted by supplementation with yeast extracts 0.5%as extra nitrogen source；it was also enhanced by supplementation with NaCl 0.5%and K2HPO40.1%.In addition，the optimal culture temperature，time and initial pH of the medium for the α-galactosidase-producing strain were 60℃，65 h and 7.0-8.0，respectively.

Geobacillus thermodenitrificans；α-galactosidase；enzyme activity；influencing factors

TQ920.1

A

0254-5071（2015）11-0113-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.026

2015-10-03

廣西科學(xué)基金（2014GXNSFAA118086）；廣西科學(xué)基金（2015GXNSFBA139068）

韋陽(yáng)道（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锓肿由飳W(xué)。

黎婭（1980-），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。