HPLC法測定鐵甲草中大黃素的含量

趙 瑩，黎翠英，蘇璐丹，張聲源,3，聶 華,3

(1.嘉應學院醫(yī)學院 客家藥用生物資源研究所，廣東 梅州 514031；2.江門市蓬江區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院，廣東 江門 529030；3. 嘉應學院 廣東省山區(qū)特色農業(yè)資源保護與精準利用重點實驗室，廣東 梅州 514031)

鐵甲草(CassiamimosoidesLinn.)為豆科(Leguminosae)決明屬植物含羞草決明的全草，主要分布于廣東、福建、臺灣、貴州、廣西和云南等地，以全草入藥，味甘、微苦，性涼，歸肝、腎和肺經，具有清熱解毒、清肝明目、祛濕、利水、解酒、化積通淋、散疲消癰等功效，可用于濕熱黃疽、暑熱吐瀉，毒蛇咬傷，便秘水腫和癰腫療瘡等的治療[1]。近年來已有研究表明，鐵甲草具有抑制脂肪酶[2]、抑制肝纖維化[3]、保護損傷肝細胞[4]和抗氧化活性[5]的藥理作用。此外，國內外學者對其化學成分也進行了研究，發(fā)現其含有香草酸、木犀草素、槲皮素、(R)-鷹爪三醇、齊墩果酸、大黃素、胡蘿卜苷和β-谷甾醇等[5-6]。但是，對鐵甲草藥材質量控制方面的研究卻很少，亦無對其成分進行定量分析的研究報道。

本文選取鐵甲草中具有抗肝癌作用的大黃素[7-8]，作為定量檢測指標成分，采用高效液相色譜法，建立鐵甲草中大黃素的含量測定方法，為鐵甲草質量標準的制定奠定基礎，有利于鐵甲草的資源培育及潛在經濟價值的實現。

1 儀器與材料

Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀(Waters公司)；Waters 2998PDA光電二極管陣列檢測器(Waters公司)；Waters XBridge Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)； WJX-A1000型高速多功能粉碎機(浙江省永康市紅太陽機電有限公司)；JP-100S型超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設備有限公司)；MING-CHE 24UV超純水機(法國Merck Millipore公司)。

大黃素對照品(批號：110756-201512)，購于中國藥品生物制品檢定研究院；鐵甲草采于廣東省梅州市蕉嶺縣，經嘉應學院醫(yī)學院生藥學翟明老師鑒定為豆科決明屬植物鐵甲草(Cassiamimosoides)的全草；其他試劑均為分析純。

2 方法及結果

2.1 對照品溶液的制備

稱取1.00 mg的大黃素標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制得0.1 mg/mL的大黃素對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取鐵甲草粗粉2.00 g，藥材中加入2 mol/L的鹽酸10 mL，充分浸潤后，60℃水浴2 h進行酸水解，濾渣用超純水水洗至中性，烘箱干燥。藥材干燥處理后加入10倍量的90%的乙醇溶液和0.5%NaOH溶液，使乙醇溶液pH值=8，于50℃下超聲30 min，放置至室溫，補足損失的質量，抽濾得樣品濾液，水浴濃縮成浸膏。

浸膏用甲醇進行超聲溶解，離心處理后，取上清液定容至10 mL，溶液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液注入液相瓶中，制備成供試品溶液以備進樣。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge? Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相∶甲醇∶0.1%甲酸=85∶15；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL，柱溫：35℃。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.1”項下的大黃素對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得濃度為5，10，20，30，40，50 μg/mL系列濃度的大黃素對照品溶液，于“2.3”項的色譜條件下，以大黃素對照品溶液色譜峰面積Y為縱坐標，大黃素對照品濃度 X(μg/mL)為橫坐標，進行線性擬合，得大黃素標準曲線，求得回歸方程為Y=38315X-16555，R2=0.9994，結果表明，在5～50 μg/mL的濃度范圍內，大黃素對照品溶液的峰面積與濃度的線性關系良好，結果見圖1。

圖1 大黃素標準曲線

2.5 專屬性考察

取項目“2.1”和“2.2”所制備的對照品溶液和供試品溶液，在“2.3”的色譜條件下進樣，大黃素的保留時間為6.19 min左右，峰型穩(wěn)定，分離度良好，有較好的基線分離，未見雜質峰干擾，具有良好的專屬性。

2.6 儀器精密度試驗

表1 精密度試驗結果

精密吸取對照品溶液1.0 mL，于“2.3”的色譜條件下，連續(xù)重復進樣6次，每次10 μL，檢測得到大黃素峰面積的RSD為0.81% ，表明儀器精密度良好，結果見表1。

2.7 樣品穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h于“2.3”色譜條件下，檢測大黃素的峰面積，得RSD為1.65% ，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定，結果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結果

2.8 樣品重復性試驗

稱取6份等質量的鐵甲草粗粉2.00 g，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，于“2.3”項色譜條件下，檢測得大黃素峰面積的RSD為1.42%，表明該方法重復性良好，結果見表3。

表3 重復性試驗結果

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的等質量鐵甲草粗粉6份，每份2.00 g，分別精密加入同一濃度的大黃素黃素對照品，按上述“2.2”的提取方法平行制備成供試品溶液，于“2.3”項色譜條件下測定，計算得到平均回收率結果為98.94%，RSD為1.98%。表明該方法測得的結果有良好準確性，結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.10 樣品含量測定

表5 鐵甲草中大黃素含量測定結果(n=3)

精密稱取3份不同批樣品，按照“2.2”項的制備方法制備成供試品溶液，每份樣品分別在“2.3”項的色譜條件下進樣三次，記錄峰面積，計算樣品中大黃素的含量，結果見表5。

3 討論

采用已有報道的鐵甲草的提取方法[9]進行提取，發(fā)現經HPLC檢測時，結果不理想，考慮到大黃素為弱酸性成分，以游離形態(tài)或結合形態(tài)存在，易與鈉、鉀、鈣、鎂等金屬離子結合成鹽存于植物體內，因此，本實驗將鐵甲草提取方法進行改進，在溶劑提取前進行酸水解處理，利于大黃素以游離形式存在；考慮到硫酸的氧化性容易使藥材在水解過程中產生碳化反應，造成藥材的損失，故選擇鹽酸作為水解介質。并且，在考察大黃素的色譜條件時發(fā)現，在流動相中加入適量酸能夠抑制成分解離，使峰型更穩(wěn)定、分離度更好且出峰時間適宜。

大黃素具有保肝護肝作用，有助于改善肝損傷，與鐵甲草的功效相吻合，同時，大黃素也是中藥材常用的檢測指標成分。本研究建立的鐵甲草中大黃素的含量檢測方法，精密度高，穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率均良好，操作簡便，測得鐵甲草含量在0.026%～0.032%，重現性較好，可為鐵甲草含量測定和質量評估提供參考依據。