固態(tài)發(fā)酵法制備羅非魚皮膠原蛋白肽及其抗氧化活性研究

邢瀚文，韓瑋，施文正,2,3，李曉暉,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白含量的25%[1]。膠原蛋白肽，是膠原蛋白適度降解后形成的一種多肽，具有抗氧化、抑菌、免疫調(diào)節(jié)和降血糖等多種生理活性[2]。陸生生物組織曾是獲取天然膠原肽的主要來源，但由于禽流感、瘋牛病等疾病的潛在威脅和宗教習(xí)俗等原因，使得陸源性膠原肽無法大范圍應(yīng)用，開發(fā)水產(chǎn)膠原蛋白活性肽成為國(guó)內(nèi)外熱門課題之一[3-5]。羅非魚是我國(guó)重要的養(yǎng)殖魚類，其魚皮中氨基酸組成合理且膠原蛋白含量較高，但在粗加工中通常被當(dāng)作下腳料丟棄或制成廉價(jià)飼料，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[6]。充分利用現(xiàn)有的水產(chǎn)資源，最大限度地提高產(chǎn)品附加值，是水產(chǎn)品綜合開發(fā)利用的一個(gè)重要方向，因此尋找新型加工技術(shù)突破產(chǎn)業(yè)發(fā)展瓶頸，對(duì)于羅非魚和膠原蛋白肽產(chǎn)業(yè)具有極大的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，制備膠原肽最常用的是微生物發(fā)酵法和酶法。與酶法相比，采用微生物發(fā)酵法制備膠原蛋白肽，微生物產(chǎn)酶和提取水解膠原得到膠原蛋白肽可以同步完成，無需使用化學(xué)試劑和昂貴的酶制劑，并且能夠去除魚皮中的腥臭味，提高樣品感官質(zhì)量，極大節(jié)約生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率[7]。固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation,SSF)相對(duì)于液態(tài)發(fā)酵而言，能耗低，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求不高，不易被雜菌污染，目標(biāo)產(chǎn)物濃度高，對(duì)環(huán)境友好，具有大規(guī)模生產(chǎn)活性肽的優(yōu)勢(shì)[8-9]。

天然膠原分子具有獨(dú)特的三股螺旋結(jié)構(gòu)，只能經(jīng)膠原酶水解破壞超螺旋結(jié)構(gòu)后才可被其他蛋白酶裂解[10]。因此，本研究以膠原酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化確定枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮產(chǎn)酶的最佳條件，并對(duì)制備的膠原粗肽進(jìn)行了超濾分離，研究不同分子質(zhì)量肽段的膠原肽體外抗氧化活性，以期為水產(chǎn)品的深入開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮,雷州市龍之潤(rùn)水產(chǎn)品有限公司；BacillussubtilisCCTCC AB 90008,中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar,NA),青島海博生物有限公司；甘氨酸,Sigma公司；截流分子5、10 kDa Millipore再生纖維素超濾膜及其他分析純?cè)噭?國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Heraeus Pico 17高速離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；UV-1800 PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀，日本Hitachi公司；Free Zone 2.5真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 魚皮的預(yù)處理

將魚皮去鱗除雜，洗凈后充分瀝干，切分成約1 cm×1 cm×1 cm的碎塊并經(jīng)打粉機(jī)粉碎，冷凍至-20 ℃，密封備用。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵及粗酶液的制備

將B.subtilisCCTCC AB 90008從甘油保藏管接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，將活化好的菌種接至種子培養(yǎng)基(牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.2～7.4)中，于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)一定時(shí)間，制得種子液。將10 g處理后魚皮裝入250 mL錐形瓶中，121 ℃高溫滅菌20 min，在無菌條件下加入一定量的滅菌蒸餾水，作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH，按菌種接種量50 g/L 接入培養(yǎng)好的發(fā)酵種子液，恒溫靜置培養(yǎng)，并每隔5 h搖瓶翻動(dòng)1次，相應(yīng)的發(fā)酵條件按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)施。

發(fā)酵結(jié)束后，向魚皮培養(yǎng)基中加入50 mL 0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.2)，于5 000 r/min離心15 min，取上清液作為膠原酶粗酶液。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)膠原酶條件的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)以膠原酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，逐級(jí)優(yōu)化，先后考察培養(yǎng)基初始pH(6、6.5、7、7.5和8)、菌齡(6、10、14、18、22和26 h)、加水量(5、10、15、20和25 mL)、發(fā)酵溫度(20、25、30、35和40 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(12、18、24、30和36 h)5個(gè)因素對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取菌齡、加水量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮制備膠原蛋白肽的工藝條件。

1.3.4 羅非魚皮膠原蛋白肽的制備工藝

羅非魚皮粉→高溫滅菌(121 ℃，20 min)→加水并調(diào)節(jié)pH→接種→發(fā)酵→加水過濾(紗布)→滅酶(90 ℃，10 min)→離心(8 000 r/min，15 min)→收集上清液→過濾(0.45 μm濾膜)→收集濾液凍干→固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮膠原蛋白粗肽(SSF-TSCP)

1.3.5 水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法測(cè)定SSF-TSCP中氨基氮的含量[11]，參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[12]測(cè)定預(yù)處理好的羅非魚皮中總氮含量，水解度(degress of hydrolysis,DH)計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：h1，氨基態(tài)氮含量，mg/mL；h2，總氮含量，mg/mL。

1.3.6 多肽含量的測(cè)定

稱取樣品2 g，加入10 mL 150g/L三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置5 min，在3 000 r/min下離心10 min后，取全部上清液，參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[12]測(cè)定上清液中多肽含量。

1.3.7 氨基酸分析

采用GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》[13]的方法，測(cè)定分析樣品中氨基酸組成及含量。

1.3.8 膠原蛋白肽的分離制備

1.3.9 膠原酶活力的測(cè)定

將甘氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，以Ⅰ型膠原蛋白為底物，采用茚三酮顯色法[14]測(cè)定膠原酶活力。酶活力定義為：在37 ℃，pH 7.5的條件下，每分鐘水解膠原蛋白產(chǎn)生1 μg甘氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.10 還原能力的測(cè)定

參考OYAIZU[15]的方法并略作改動(dòng)，以谷胱甘肽(glutathione,GSH)作為陽性對(duì)照。

1.3.11 ·OH清除能力的測(cè)定

參考SMIRNOFF等[16]的方法并略作改動(dòng)：向2 mL樣品溶液中加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和2 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合，最后加入2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃水浴保溫20 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，即為樣品組的吸光度?？瞻讓?duì)照組以蒸餾水代替樣品溶液，本底組以蒸餾水代替H2O2溶液，以GSH作為陽性對(duì)照?！H清除率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A，樣品組的吸光度；A1，本底組的吸光度；A0，空白組的吸光度。

(3)

式中：A，樣品組的吸光度；A1，本底組的吸光度；A0，空白組的吸光度。

1.3.13 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH可在有機(jī)溶劑中形成穩(wěn)定的自由基[18]。參考NURDIANI等[19]的測(cè)定方法并略作改動(dòng)，以GSH作為陽性對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 20、Origin 8.5等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

如圖1所示，隨著起始pH的增大，膠原酶酶活力和菌體生物量先升高后緩慢降低。環(huán)境偏酸或偏堿時(shí)，均不利于菌體生長(zhǎng)，影響膠原酶的合成與積累。在初始pH接近7的中性環(huán)境中，菌株生長(zhǎng)良好且產(chǎn)膠原酶活性最高，故本試驗(yàn)選擇pH 7為培養(yǎng)基的最適pH。

圖1 初始pH對(duì)菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.1 Effect of initial pH on the production of collagenase

2.1.2 菌齡對(duì)產(chǎn)酶的影響

如圖2所示，接入的種子液菌齡<18 h時(shí)，在培養(yǎng)一定時(shí)間后，檢測(cè)到酶活力較低，生物量也偏低。當(dāng)菌齡>18 h時(shí)，雖然菌體生長(zhǎng)旺盛但衰老迅速，產(chǎn)膠原酶活性有下降趨勢(shì)，故本試驗(yàn)選擇18 h為種子液最適培養(yǎng)時(shí)間。

圖2 菌齡對(duì)菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.2 Effect of cell age on the production of collagenase

2.1.3 加水量對(duì)產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵中，含水量過高會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基質(zhì)多孔性降低，發(fā)酵系統(tǒng)難以換氣、降溫，從而增加被雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)；而含水量過低時(shí)，基質(zhì)膨脹程度低，菌體生長(zhǎng)代謝受到抑制，導(dǎo)致目標(biāo)物產(chǎn)量下降[20]。如圖3所示，當(dāng)加水量為10 mL時(shí)，菌株固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮產(chǎn)膠原酶活性最高，故本試驗(yàn)選擇10 mL為最適加水量。

圖3 加水量對(duì)菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.3 Effect of water addition on the production of collagenase

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

最佳發(fā)酵溫度受菌株生長(zhǎng)狀態(tài)和培養(yǎng)基理化性質(zhì)等因素的影響而改變，適合微生物生長(zhǎng)繁殖的溫度不一定有利于某種代謝產(chǎn)物的合成[21]。如圖4所示，在發(fā)酵溫度<35 ℃時(shí)，菌體生物量較多，但產(chǎn)酶活性偏低。在35 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)代謝旺盛，膠原酶分泌增多，酶活力達(dá)到最大，此后溫度繼續(xù)上升，菌體生長(zhǎng)受到抑制，酶活力也迅速下降，說明該菌最適生長(zhǎng)溫度與最適產(chǎn)酶溫度不同，故本試驗(yàn)選擇35 ℃為最適發(fā)酵溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the production of collagenase

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

如圖5所示，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，菌體生物量隨之增多，膠原酶的酶活力也逐漸增大，在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，膠原酶酶活力達(dá)到最大值。隨著該菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，有害產(chǎn)物積累抑制菌株產(chǎn)酶，酶活力呈下降趨勢(shì)。在生產(chǎn)實(shí)踐中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，雜菌污染的機(jī)會(huì)相應(yīng)增加，綜合考慮生產(chǎn)成本和發(fā)酵效率，故本試驗(yàn)選擇24 h為最適發(fā)酵時(shí)間。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the production of collagenase

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)產(chǎn)酶活性影響較顯著的菌齡(A)、加水量(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵時(shí)間(D)4個(gè)因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

2.2.2 正交試驗(yàn)方差分析

由表1可知，各因素對(duì)膠原酶酶活力的影響程度大小依次是C>D>A>B，固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮產(chǎn)膠原酶的最優(yōu)方案為A1B2C2D2，即種子液菌齡14 h，加水量10 mL，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h。采用該條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得膠原酶的酶活力為90.05 U/mL，與優(yōu)化前的64.27 U/mL相比，酶活力提高約40.1%。方差分析(表2)顯示，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)膠原酶活性具有顯著影響(P<0.05)。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 Design scheme and results of orthogonal test

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of the orthogonal test

2.3 氨基酸組成分析

表3 SSF-TSCP的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of SSF-TSCP

2.4 體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 還原能力

還原力是通過評(píng)價(jià)多肽得失電子和穩(wěn)定自由基的能力來衡量抗氧化活性的重要指標(biāo)[28]。如圖6所示，SSF-TSCP及其分離組分TSCP-a、TSCP-b、TSCP-c均有一定的還原能力，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，各組分還原能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)，組分TSCP-c的還原能力為0.962，高于SSF-TSCP(0.783)，TSCP-a和TSCP-b的還原能力在該質(zhì)量濃度下較弱，分別為0.588和0.621。馬華威等[29]制備的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽在質(zhì)量濃度10 mg/mL時(shí)測(cè)定還原能力，其OD700 nm僅為0.676。

圖6 不同膠原肽組分和GSH的還原能力Fig.6 Reducing power of different collagen peptide fractions and GSH

2.4.2 ·OH清除能力

·OH作為生物體內(nèi)最活躍的活性氧自由基，可以降解DNA和細(xì)胞膜等，造成重要細(xì)胞的死亡和突變，危害機(jī)體健康[28]。如圖7所示，在質(zhì)量濃度為1～4 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的提高，樣品的·OH清除能力增強(qiáng)趨勢(shì)明顯，若質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，其變化趨于平緩。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，組分TSCP-c的清除率為59.24%，低于GSH。對(duì)質(zhì)量濃度和清除率之間作回歸方程并計(jì)算半抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)，得到SSF-TSCP、TSCP-a、TSCP-b和TSCP-c 4種樣品的IC50值分別為9.01、7.41、7.92和3.83 mg/mL。MW<5 kDa的多肽組分TSCP-c清除·OH效果最好，其IC50值低于虎斑烏賊生殖腺多肽(19.4 mg/mL)[30]和金槍魚多肽(28.81 mg/mL)[31]。

圖7 不同膠原肽組分和GSH的·OH清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging abilities of different collagen peptide fractions and GSH

圖8 不同膠原肽組分和GSH的清除能力Fig.8 Superoxide anion radical scavenging abilities of different collagen peptide fractions and GSH

2.4.4 DPPH自由基清除能力

如圖9所示，SSF-TSCP及其分離所得的3個(gè)多肽組分均有較好的DPPH自由基清除能力，清除率與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，TSCP-c的清除率最高，可達(dá)到70.23%，TSCP-a的清除活性最低，為48.13%。這與2者還原能力的表現(xiàn)相同，可能是由于這2種判定抗氧化能力的方法均是基于多肽給電子能力的原理測(cè)定。

圖9 不同膠原肽組分和GSH的DPPH自由基清除能力Fig.9 DPPH radical scavenging abilities of different collagen peptide fractions and GSH

對(duì)質(zhì)量濃度和清除率之間作回歸方程并計(jì)算得到SSF-TSCP、TSCP-a、TSCP-b和TSCP-c 4種樣品的IC50值分別為5.26、7.81、6.47和2.37 mg/mL。田裕心等[34]報(bào)道的鮑魚內(nèi)臟多肽(4.61 mg/mL)和CHI等[35]報(bào)道的綠鰭?cǎi)R面鲀魚皮膠原肽(5.22 mg/mL)對(duì)DPPH自由基的清除活性均小于TSCP-c。SSF-TSCP的還原力高于TSCP-a、TSCP-b，但其清除DPPH自由基的能力卻低于這兩者，可能是由于多肽的自由基清除活性較還原力而言受到的影響因素更多也更為復(fù)雜，如pH、分子質(zhì)量等[36]。

3 結(jié)論