不同溫度處理對(duì)疏序黃荊種子萌發(fā)的影響

李昭華，郭超凡，劉 婕，殷 麗，龍左卿，沙 月，周紹齊，蘇文華，周 睿

(云南大學(xué)生態(tài)學(xué)與地植物學(xué)研究所，昆明 650500)

干熱河谷是對(duì)又干又熱的河谷地區(qū)的統(tǒng)稱[1]，是一類主要分布于中國(guó)西南地區(qū)(云南、四川)的特殊氣候地貌類型。在云南境內(nèi)，干熱河谷主要分布于怒江、金沙江、瀾滄江、紅河等流域[1,2]。其中比較典型的如元謀干熱河谷、元江干熱河谷等[3]。干熱河谷地區(qū)典型的氣候特征是全年干濕季分明，熱量高、降水少，水熱嚴(yán)重失衡，蒸發(fā)作用強(qiáng)烈[2,4-7]，全年蒸發(fā)量是降水量的3～6倍,年均溫大于20 ℃，而年積溫大于7 000 ℃[8]。這種特殊的氣候條件使得干熱河谷地區(qū)呈現(xiàn)出以稀樹灌草叢占優(yōu)勢(shì)的植被類型，由于與非洲稀樹草原的植被類型相似，因此被稱為“河谷型”薩瓦那植被類型(Savanna of valley type)[9]。

由于氣候干熱，導(dǎo)致干熱河谷地區(qū)成為全球最容易發(fā)生火災(zāi)的區(qū)域之一[10,11]。火災(zāi)是幾乎跟陸地植物同時(shí)出現(xiàn)在地質(zhì)記錄中的一種世界性自然現(xiàn)象，影響著全球生態(tài)系統(tǒng)的分布和生態(tài)過(guò)程，如植物的分布、結(jié)構(gòu),物質(zhì)循環(huán)如碳循環(huán)、氮循環(huán)等[12]。不同強(qiáng)度和頻率的火災(zāi)，往往會(huì)造成不同程度的生態(tài)影響[12]。Alves等[13]通過(guò)遙感監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，一定強(qiáng)度的周期性燃燒對(duì)物質(zhì)循環(huán)、植物更新有著重要的意義。而過(guò)高的燃燒強(qiáng)度或頻率則不利于維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡[14,15]。

在火的長(zhǎng)期干擾下，植物也由此進(jìn)化出了一系列適應(yīng)機(jī)制。與易火生境有關(guān)的植物特性稱為火相關(guān)性狀(fire-related traits)[16,17]。此外，Lamont等[17]，Zuloaga-Aguilar等[18]，He等[19]發(fā)現(xiàn)，促使火相關(guān)性狀產(chǎn)生的因素不僅是火，還有燃燒過(guò)程中產(chǎn)生的煙霧、熱量、灰分等都能導(dǎo)致植物產(chǎn)生一系列相關(guān)性狀。這些適應(yīng)性狀包括厚樹皮、萌生、枝下自疏、高溫或煙霧刺激種子萌發(fā)、硬質(zhì)種皮、火后開花等[16,17,20-23]。

在易火生境中，種子的萌發(fā)常常與火密切相關(guān)[21]?；鹂梢詼p少土壤和凋落物中的抑制物質(zhì)、木炭中所含物質(zhì)的化學(xué)刺激、破壞硬質(zhì)種皮等[24]。通常將經(jīng)過(guò)40 ℃以上溫度處理后種子萌發(fā)率或萌發(fā)速度提高的現(xiàn)象稱為熱沖擊效應(yīng)[25-27]。研究表明，火燃燒時(shí)產(chǎn)生的高溫對(duì)土壤種子庫(kù)等具有熱沖擊效應(yīng)[28,29]。熱沖擊可以打破種子休眠,改變種皮結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)種子吸水與萌發(fā)[20,30,31]。

結(jié)合干熱河谷地區(qū)易火的特性及植物對(duì)火干擾的適應(yīng),對(duì)干熱河谷地區(qū)的主要植物群落物種進(jìn)行熱沖擊等火適應(yīng)相關(guān)性實(shí)驗(yàn)，對(duì)當(dāng)?shù)氐闹脖换謴?fù)、生態(tài)建設(shè)具有重要意義。金振洲等早期對(duì)干熱河谷地區(qū)植物區(qū)系的調(diào)查研究表明，疏序黃荊(VitexnegundoL.f.laxipaniculataPei)、坡柳(DodonaeaviscosaL.Jacq)、黃茅(Heteropogoncontortus)、余甘子(PhyllanthusemblicaLinn.)等均為當(dāng)?shù)剌^為常見的植物群落成分[3]。

目前，對(duì)坡柳、黃茅的熱沖擊研究已有報(bào)道，霍冬芳等[32]、余嬌娥等[33]先后發(fā)現(xiàn)坡柳、黃茅種子經(jīng)過(guò)高溫處理后萌發(fā)率較常溫對(duì)照組有明顯提高,表現(xiàn)出較強(qiáng)的熱沖擊效應(yīng)。而對(duì)疏序黃荊的研究目前主要集中在藥用價(jià)值方面。因此,探究疏序黃荊這一干熱河谷地區(qū)植物群落的常見物種是否具有熱沖擊效應(yīng)很有必要，這對(duì)“河谷型”薩瓦那植被的保護(hù)與恢復(fù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)概況

元謀干熱河谷位于云南省楚雄彝族自治州北部(25°23′～26°06′N，101°35′～102°06′E)。區(qū)域內(nèi)熱量、光照充足，蒸發(fā)量大，降水少[6]，年均降雨量約613.7 mm，年均蒸發(fā)量約3 426.3 mm，年均相對(duì)濕度54%，降水主要集中于5—10月[34]，屬于亞熱帶干熱季風(fēng)氣候。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

疏序黃荊(V.negundoL.f.laxipaniculataPei)是馬鞭草科(Verbenaceae)牡荊屬(Vitex)黃荊的一個(gè)變型，小喬木；小枝被灰褐色絨毛，小葉片橢圓形，全緣，兩面有絨毛；圓錐花序大而開展，側(cè)枝明顯地分出小枝，第一回側(cè)枝長(zhǎng)可達(dá)21 cm；果實(shí)頂端有毛，花果期5—8月。產(chǎn)四川、云南，生于海拔450～1 400 m的河邊密林或山坡灌叢中[35]。

于2019年1月在元謀縣城西南方向法那禾村附近的陽(yáng)坡面(25°42′N，101°51′E)隨機(jī)選取生長(zhǎng)良好的植株，采集植株≥30株，每株≥30粒種子。所有種子采集后進(jìn)行混合并風(fēng)干保存，篩選大小均勻、顆粒飽滿、色澤一致的種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1材料處理

為了讓實(shí)驗(yàn)效果具有可比較性，對(duì)種子進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)前的熱沖擊處理，主要參照Ribeiro等[27]的方法進(jìn)行。從篩選后的疏序黃荊種子中隨機(jī)選擇，分別采用60 ℃(10，20，40 min)、80 ℃(5，10，20 min)、100 ℃(2.5，5，10 min)共9種方式在烘箱中進(jìn)行干熱處理。每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含隨機(jī)選出的30粒種子。另設(shè)置10個(gè)重復(fù)進(jìn)行常溫(25 ℃)處理作為對(duì)照組，每個(gè)重復(fù)包含隨機(jī)選擇的30粒種子；整個(gè)熱沖擊實(shí)驗(yàn)共使用隨機(jī)選出的種子3 000粒。

在烘箱中先放入10個(gè)平面玻璃培養(yǎng)皿，按60 ℃(10，20，40 min)、80 ℃(5，10，20 min)、100 ℃(2.5，5，10 min)共9種處理方式分別設(shè)定好處理溫度，待達(dá)到設(shè)定溫度后，迅速將種子放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放30粒種子，避免種子疊放；達(dá)到處理時(shí)間后，迅速將種子取出，放入預(yù)備好的其他培養(yǎng)皿中，9種處理方式依次進(jìn)行。待所有處理的種子自然冷卻至室溫后，進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

此外，為檢驗(yàn)各處理對(duì)種子活性的影響，再另外隨機(jī)挑選1 000粒大小均勻、色澤一致的飽滿種子，分別采用60 ℃(10，20，40 min)、80 ℃(5，10，20 min)、100 ℃(2.5，5，10 min)共9種方式在烘箱中進(jìn)行干熱處理。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含隨機(jī)選擇的20粒種子。冷卻至室溫后，連同常溫對(duì)照組將種子在蒸餾水中浸泡48 h。然后用0.3%的TTC溶液對(duì)種子活力進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

在直徑7 cm的培養(yǎng)瓶底部鋪上雙層濾紙，用蒸餾水潤(rùn)濕，而后將不同溫度和時(shí)間處理的種子均勻放入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

培養(yǎng)條件：溫度25 ℃恒溫,光照強(qiáng)度1 250 lx，光照時(shí)間每天14 h。每天對(duì)種子的萌發(fā)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并記錄(種子萌發(fā)以胚根突破種皮2 mm為準(zhǔn))。同時(shí)適當(dāng)補(bǔ)充水分，保持培養(yǎng)瓶底部濕潤(rùn)，以種子周圍不出現(xiàn)水膜為宜，連續(xù)觀察3周(21 d)。

1.3.3種子活力測(cè)定

用解剖刀將浸泡好的種子沿胚的中線切成兩半，將其中一半置于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中并加入0.3%的TTC溶液浸沒種子，而后在40 ℃恒溫條件下染色40 min，最后用蒸餾水沖洗2～3次，并將種子置于解剖鏡下觀察染色情況，同時(shí)記錄種子空殼、壞死、著色情況，以探究不同溫度和時(shí)間處理對(duì)種子活力的影響。種子著色越深，則活力越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

參照余嬌娥等[33]、董沁方等[36]、常云霞等[37]的方法，計(jì)算種子萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)以及熱沖擊效應(yīng)指數(shù)(RI)公式如下：

萌發(fā)率(%)=(n/N)× 100%；

萌發(fā)勢(shì)(%)=(m/N)× 100%；

其中，n為萌發(fā)種子數(shù)；m為萌發(fā)實(shí)驗(yàn)開始前7 d內(nèi)的萌發(fā)種子數(shù)；N為供試種子數(shù)。

當(dāng)T≥C時(shí)，RI=1-C/T；

當(dāng)T

其中，C為對(duì)照值，T為處理值。當(dāng)RI>0時(shí)，為促進(jìn)作用，當(dāng)RI<0時(shí)為抑制作用。RI的絕對(duì)值代表作用強(qiáng)度的大小。

種子活力(%)=(染成紅色的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)和作圖，用SPSS 22.0軟件通過(guò)95%水平上進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析，采用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較及差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)，并進(jìn)行主效應(yīng)方差分析，圖表數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)前高溫處理對(duì)疏序黃荊種子萌發(fā)率的影響

2.1.1萌發(fā)率的變化

經(jīng)過(guò)60 ℃(10，20，40 min)、80 ℃(5，10，20 min)、100 ℃(2.5，5，10 min)以及常溫對(duì)照10種方式處理后,疏序黃荊種子萌發(fā)率在80 ℃(5 min)處理時(shí)達(dá)到最大，為(62.33±3.13)%；100 ℃(10 min)處理時(shí)萌發(fā)率最低,為0(圖1)。從整體上來(lái)看，隨著處理溫度和時(shí)間的變化，種子萌發(fā)率呈先上升后下降的趨勢(shì)。除100 ℃(5 min)和100 ℃(10 min)2種處理方式萌發(fā)率低于常溫對(duì)照外，其余各組萌發(fā)率均高于常溫對(duì)照組，萌發(fā)率分別提高了14.00%，3.97%，14.33%，19.63%，18.67%，3.63%，9.00%。其中，60 ℃(10 min)、60 ℃(40 min)、80 ℃(5 min)、80 ℃(10 min)4組的萌發(fā)率顯著高于常溫對(duì)照組；而100 ℃(5 min)和100 ℃(10 min)2組的萌發(fā)率顯著低于包括常溫對(duì)照在內(nèi)的其余各組。

圖1 高溫處理對(duì)疏序黃荊種子萌發(fā)率的影響

2.1.2熱沖擊效應(yīng)指數(shù)

可以用熱沖擊效應(yīng)指數(shù)(RI)來(lái)表示熱沖擊對(duì)疏序黃荊種子萌發(fā)率的影響，熱沖擊效應(yīng)指數(shù)大于0，表明熱沖擊對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用；小于0，則表明熱沖擊對(duì)種子萌發(fā)有抑制作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明，60 ℃(10，20，40 min)、80 ℃(5，10，20 min)、100 ℃(2.5，5，10 min)9種處理方式的熱沖擊效應(yīng)指數(shù)分別為0.257 7，0.135 7，0.262 2，0.352 9，0.316 4，0.316 4，0.182 4，-0.652 9，-1.000 0。除100 ℃(5 min)和100 ℃(10 min)2組熱沖擊效應(yīng)指數(shù)RI小于0，抑制了種子萌發(fā)外，其余各組均大于0，在不同程度上促進(jìn)了種子萌發(fā)。80 ℃(5 min)時(shí)熱沖擊效應(yīng)指數(shù)達(dá)到最大。熱沖擊效應(yīng)指數(shù)在整體上呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。

圖2 不同溫度和時(shí)間處理疏序黃荊種子的熱沖擊效應(yīng)指數(shù)

2.1.3主效應(yīng)方差分析

為了研究不同溫度和時(shí)間處理對(duì)疏序黃荊種子萌發(fā)率的影響，采用SPSS軟件中的一般線性模型，對(duì)萌發(fā)前不同溫度和時(shí)間處理的疏序黃荊種子萌發(fā)率進(jìn)行單變量雙因素方差分析。

數(shù)據(jù)分析結(jié)果(表1)表明，溫度和時(shí)間對(duì)疏序黃荊種子萌發(fā)率的主效應(yīng)均達(dá)到極顯著水平。根據(jù)各因素F值的大小，萌發(fā)前的處理溫度影響最大(F=148.092，p<0.001)，其次是處理時(shí)間的影響(F=32.553，p<0.001)，最后是溫度和時(shí)間互作的影響(F=1.346，p=0.226)。

表1 萌發(fā)率主效應(yīng)方差分析結(jié)果

2.1.4萌發(fā)前高溫處理對(duì)疏序黃荊種子活力的影響

從種子的解剖和染色情況來(lái)看，除100 ℃(5 min)和100 ℃(10 min)2種處理方式外，其余處理組之間以及他們與常溫對(duì)照之間活性種子數(shù)無(wú)顯著性差異(圖3)。經(jīng)100 ℃(5 min)和100 ℃(10 min)處理后，活性種子數(shù)顯著低于常溫對(duì)照組(圖3)。在100 ℃(10 min)處理時(shí)活性種子數(shù)最低，為(41±0.84)%。表明種子對(duì)高溫具有一定的耐受性限度，過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致種子活力下降，從而影響種子萌發(fā)率。在實(shí)驗(yàn)中，種子萌發(fā)率與種子活力隨不同高溫處理表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)(圖4)。

圖3 高溫處理對(duì)疏序黃荊種子活力的影響

圖4 不同高溫處理下疏序黃荊種子萌發(fā)率和種子活力的變化趨勢(shì)

2.2 萌發(fā)前高溫處理對(duì)疏序黃荊種子萌發(fā)勢(shì)的影響

實(shí)驗(yàn)采取前1/3期間(7 d)內(nèi)的萌發(fā)數(shù)占供試種子數(shù)的百分比計(jì)算萌發(fā)勢(shì)。經(jīng)過(guò)60 ℃(10，20，40 min)、80 ℃(5，10，20 min)、100 ℃(2.5，5，10 min)以及常溫對(duì)照10種方式處理后，除100 ℃(5 min)和100 ℃(10 min)外，其余各組萌發(fā)勢(shì)均高于常溫對(duì)照組(圖5)。萌發(fā)勢(shì)在80 ℃(5 min)處理時(shí)達(dá)到最高；100 ℃(10 min)處理時(shí)萌發(fā)勢(shì)達(dá)到最低。

圖5 高溫處理對(duì)疏序黃荊種子萌發(fā)勢(shì)的影響

在一定的溫度范圍內(nèi)，短時(shí)高溫處理可以明顯提高疏序黃荊種子的萌發(fā)速度。萌發(fā)勢(shì)整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，在80 ℃(5 min)處理時(shí)達(dá)到最大，而溫度過(guò)高則不利于種子的萌發(fā),反而出現(xiàn)抑制效應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

余嬌娥等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)60 ℃和80 ℃處理后，黃茅種子萌發(fā)率顯著提高[33]；霍冬芳等發(fā)現(xiàn)，坡柳種子經(jīng)過(guò)40 ℃以上的高溫處理后，具有明顯的熱沖擊效應(yīng)，在80 ℃(10 min)處理時(shí)萌發(fā)率達(dá)到最大[32]；Williams等研究發(fā)現(xiàn)，80～100 ℃的短時(shí)高溫處理可以打破Chamaecristamimosoides,Crotalariacalycina,Crotalariamontana,Indigoferahirsuta,Tephrosiajuncea等植物的種子休眠，從而促進(jìn)種子萌發(fā)[20]；Gashaw等對(duì)埃塞俄比亞西部的稀樹草原進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，一些植物種子在短時(shí)高溫處理后表現(xiàn)出萌發(fā)率提高的現(xiàn)象[26]。

在本實(shí)驗(yàn)中，除100 ℃(5 min)和100 ℃(10 min)2種處理方式萌發(fā)率低于常溫對(duì)照外，其余各組萌發(fā)率均顯著提高，在80 ℃(5 min)處理時(shí)達(dá)到最大，為(62.33±3.13)%，表現(xiàn)出一定的熱沖擊效應(yīng)。說(shuō)明疏序黃荊種子也有對(duì)高溫的適應(yīng)對(duì)策。熱沖擊不僅提高了疏序黃荊的萌發(fā)率，還在一定程度上提高了其萌發(fā)勢(shì)。除100 ℃(5 min)和100 ℃(10 min)2種處理方式萌發(fā)勢(shì)低于常溫對(duì)照組外，其余各組萌發(fā)勢(shì)均高于對(duì)照，說(shuō)明熱沖擊處理可以縮短種子萌發(fā)所需時(shí)間。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，疏序黃荊種子對(duì)高溫也有一定的耐受性限度，當(dāng)超過(guò)一定的溫度及處理時(shí)間后，就會(huì)對(duì)種子產(chǎn)生損害,從而影響種子萌發(fā)。

就熱沖擊效應(yīng)產(chǎn)生的的機(jī)制而言，Zuloaga-Aguilar等[18]，Jeffery等[30]的研究表明，熱沖擊可以改變種皮結(jié)構(gòu)，使種皮的透水性增強(qiáng)，增加氣體交換，從而促進(jìn)種子吸水萌發(fā)；常云霞等在云南松的熱沖擊實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)短時(shí)高溫處理后，種子中的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性均顯著提高[37]。說(shuō)明熱沖擊可以激活與種子萌發(fā)相關(guān)的酶系統(tǒng)，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。Zuloaga-Aguilar[18]，Nelson[38]等在研究煙霧等化學(xué)信號(hào)對(duì)種子萌發(fā)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，外界的刺激與種子的休眠狀態(tài)密切相關(guān)。也就是說(shuō)，處于深度休眠狀態(tài)的種子對(duì)外界刺激不敏感。而霍冬芳等對(duì)經(jīng)過(guò)不同存儲(chǔ)時(shí)間的坡柳進(jìn)行熱沖擊實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)率并沒有顯著變化[32]。此外，火對(duì)植物種子的影響還與種子的形狀、大小、質(zhì)量等密切相關(guān)[16,20,39,40]。因此，關(guān)于疏序黃荊種子的熱沖擊效應(yīng)是否與內(nèi)部酶系統(tǒng)活性的變化、休眠狀態(tài)、種子質(zhì)量、大小、形狀等因素有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

He等通過(guò)對(duì)木炭等的研究分析表明，火對(duì)植物的干擾歷史在3.5億年以上[19]。所以，在如此長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)，植物必然進(jìn)化出了一系列對(duì)火的適應(yīng)機(jī)制。雖然Lamont等[17]也指出，一些植物的火適應(yīng)性狀可能并非是火誘導(dǎo)的，也可能是由干旱誘導(dǎo)的，干旱對(duì)植物的影響可以看成是火的一種溫和形式。但就強(qiáng)度與時(shí)間而言，干旱造成的高溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可是強(qiáng)度不大；而火造成的高溫持續(xù)時(shí)間雖然沒有干旱的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，但其溫度遠(yuǎn)高于干旱產(chǎn)生的高溫。因此，干旱與火所造成的影響是有區(qū)別的，是否能將易火生境中的植物火適應(yīng)性狀用干旱來(lái)進(jìn)行解釋，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

干熱河谷作為全球最容易發(fā)生火災(zāi)的地區(qū)之一，對(duì)當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)植物進(jìn)行火相關(guān)研究十分必要，可以為干熱河谷地區(qū)的植被恢復(fù)、人工播種等提供必要的參考。在疏序黃荊的播種過(guò)程中，可以采取80 ℃(5 min)的熱沖擊處理,從而提高種子的萌發(fā)率,減少恢復(fù)成本。