HPLC-MS/MS 法同時測定口服液保健食品中非法添加的降壓和壯陽抗疲勞類藥物

曾 羲，戚 平，汪 寧，林子豪，錢振杰，周慶瓊，蔡偉誼，彭名軍

（廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511400）

0 引言

保健食品是指具有特定保健功能或以補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)為目的的食品[1]。近年來，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，保健食品比藥品更安全、更健康且無副作用，口服液類保健食品也因其食用方便、吸收率高等優(yōu)勢備受消費(fèi)者青睞，使得保健品行業(yè)呈現(xiàn)出飛速發(fā)展的態(tài)勢[2]。目前，我國批準(zhǔn)的保健食品功能有27 種[3]，其中降壓類和壯陽抗疲勞類保健食品對消費(fèi)者的吸引力較大，且添加的可能性也較大[4-5]。一些商家為牟取暴利，在保健食品中添加目的性藥物，以達(dá)到見效快的目的，從而增加了保健食品的安全隱患[6-9]。

近年來，保健食品中非法添加藥物常用的方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、超高效液相色譜法[6，11]、（超） 高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[9，12-13]、QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、超高液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中，氣質(zhì)法需要衍生化處理，較繁瑣費(fèi)時；液相法對基質(zhì)復(fù)雜的樣品定性時易出現(xiàn)假陽性；液相質(zhì)譜法的掃描方式選擇性強(qiáng)、靈敏度高、定量及定性能力強(qiáng)，可以檢測出多組分超低含量的化合物。

基于近年來保健食品中易檢出的項目，選擇了22 種降壓類和壯陽抗疲勞類非法添加藥物，綜合檢測成本、提取效率和同分異構(gòu)體分離鑒定等因素，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測口服液保健食品中非法添加的22 種降壓類和壯陽抗疲勞藥物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

口服液保健食品，購于當(dāng)?shù)厥袌?；實驗室?2 種藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于98%），北京振翔科技有限公司提供；乙腈和甲醇（色譜純），美國Thermo Fisher Scientific 公司提供；實驗室用水為超純水；其他化學(xué)試劑均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠提供。

1.2 儀器與設(shè)備

API4000 型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國ABSCIEX 公司產(chǎn)品；2600TH 型超聲清洗器，上海安譜科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SECURA224-1CN 型電子天平，美國Sartorious 公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

（1） 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇振蕩溶解，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃下避光密封貯存。分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量用甲醇定容，使用前用樣品基質(zhì)提取液稀釋成6 個標(biāo)準(zhǔn)濃度的工作液。工作液的標(biāo)曲范圍為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 ng/mL。

（2） 樣品溶液的配制。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 樣品于50 mL 容量瓶中，加入約40 mL 甲醇- 水溶液（50∶50，V/V），超聲提取10 min，取出冷卻至室溫后，再定容至50 mL，過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜后待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore aQ C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A：乙腈；流動相B：0.1%甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～1.5 min，90% B；1.6～3.0 min，90%～65% B；3.1～8.0 min，65%～10% B；8.1～9.0 min，10% B；9.1～10.0 min，90% B。柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.3 mL/min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子（ESI+） 源，噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度550 ℃，霧化氣壓0.38 MPa，輔助加熱氣壓0.38 MPa，氣簾氣0.17 MPa。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）質(zhì)譜。

22 種非法添加違禁藥物的質(zhì)譜參數(shù)及保留時間見表1。

表1 22 種非法添加違禁藥物的質(zhì)譜參數(shù)及保留時間

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

由于目標(biāo)化合物的數(shù)量較多，故選用較長的Thermo Accucore aQ C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）柱進(jìn)行分離。分別考查了以0.1% 甲酸（V/V）-10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈、10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈、0.1% 甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇和10 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇等4 種體系作為流動相，觀察各流動相的分離效果。結(jié)果表明，0.1% 甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈作為流動相時，各目標(biāo)化合物的響應(yīng)均較優(yōu)，且檢測靈敏度和離子化效率最高。

目標(biāo)化合物阿替洛爾的極性較大，保留時間較短，故0～3 min 采用較高比例的水相延緩出峰時間，3～8 min 不斷提高有機(jī)相的比例能較好地分離出其他21 種化合物，且同分異構(gòu)體（羥基豪莫西地那非和代艾地那非、豪莫西地那非和伐地那非、偽伐地那非和那莫西地那非） 均能夠較好地分離。故綜合以上因素得到1.3.2 中的色譜條件。

22 種化合物的總離子色譜圖見圖1。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別將22 種非法添加物的標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL） 用甲醇稀釋成100 ng/mL 的對照液，在正離子模式下，直接推針進(jìn)樣，優(yōu)化質(zhì)譜條件。發(fā)現(xiàn)22 種目標(biāo)化合物在正離子模式下均有較好響應(yīng)。確定母離子后，用子離子掃描方式選擇相對離子豐度高的2 個作為二級碎片離子。在這22 種藥物中，有3 組同分異構(gòu)體，分別為羥基豪莫西地那非和硫代艾地那非、豪莫西地那非和伐地那非、偽伐地那非和那莫西地那非，對二級碎片離子進(jìn)行比對分析，通過不同的出峰時間，結(jié)合選擇不同子離子分析鑒別，最終得到1.3.3 中的質(zhì)譜條件。

圖1 22 種化合物的總離子色譜圖

2.3 樣品前處理條件優(yōu)化

參考胡青等人的研究結(jié)論，用純甲醇為提取溶劑，并優(yōu)化提取條件，采用甲醇-水（50∶50，V/V）作為提取溶劑。

2 種提取溶劑的提取回收率比較見圖2。

圖2 2 種提取溶劑的提取回收率比較

由圖2 可知，甲醇為提取溶劑時，有3 種化合物的提取回收率低于80%，且利血平的提取回收率僅有50%，其可能原因是利血平極易溶于水不溶于甲醇。當(dāng)采用甲醇-水（50∶50，V/V） 作為提取溶劑時，各目標(biāo)化合物的提取回收率均在80%～120%，利血平的提取回收率顯著增加。因此，以甲醇-水（50∶50，V/V） 為提取溶劑。

比較了不同超聲時間（5，10，15 min） 對目標(biāo)化合物的提取效率影響，結(jié)果見圖3。從不同超聲時間的提取回收率看，超聲時間在10，15 min 時，22 種目標(biāo)化合物的提取效率均介于80%～120%，當(dāng)超聲時間為5 min 時，有6 種目標(biāo)化合物的提取回收率在80%以下。故在進(jìn)行方法學(xué)驗證和實際樣品檢測時，選用超聲時間為10 min。

超聲時間的提取回收率比較見圖3。

圖3 超聲時間的提取回收率比較

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限的測定

按1.3.1 中標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制方法，在1.3.2 和1.3.3 儀器條件下，依次進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行分析，在1.0～50.0 ng/mL 線性范圍內(nèi)，以目標(biāo)化合物的峰面積為縱坐標(biāo)（y），以質(zhì)量濃度（x，ng/mL） 為橫坐標(biāo)，通過Multiquant 軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，根據(jù)3 倍信噪比（S/N=3） 和10 倍信噪比（S/N=10） 分別計算檢出限（LOD） 和定量限（LQD），各種目標(biāo)化合物在線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)（r） 均大于0.99。

2.4.2 加標(biāo)回收率試驗及精密度

對經(jīng)檢測不含非法添加化學(xué)藥物的空白樣品（紅牛維生素功能飲料） 進(jìn)行加標(biāo)回收率的試驗和精密度試驗。于空白樣品中添加低（0.1 μg/g）、中（0.5 μg/g） 和高（1.0 μg/g） 3 個水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3 中方法進(jìn)行樣品前處理，取6 次試驗結(jié)果的平均值計算加標(biāo)回收率和精密度。

22 種非法添加違禁藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6） 見表2。

22 種非法添加化學(xué)藥物的回收率介于77.15%～117.62%，相對標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為0.05%～10.65%（n=6），滿足日常檢測的要求。

2.5 實際樣品的測定

在市場隨機(jī)購買專項保健食品10 種，利用該方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中一款壯陽類液體保健食品中紅地那非和西地那非有較低劑量檢出，含量分別為0.073 μg/g 和0.10 μg/g。可見保健食品市場非法添加現(xiàn)象較為普遍，市場監(jiān)督管理局應(yīng)予以高度重視。

3 結(jié)論

采用甲醇-水超聲提取，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定液體保健食品中22 種非法添加的違禁藥物。該方法前處理簡單、分析時間短，檢出限、精密度和回收率均能滿足實驗檢驗工作，在快速、準(zhǔn)確地對保健品中常見的降壓藥和壯陽抗疲勞類等非法添加藥物進(jìn)行同時測定，大大提高了日常檢驗的工作效率，為加強(qiáng)保健食品市場的監(jiān)管和檢驗提供了重要的技術(shù)支撐。

表2 22 種非法添加違禁藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）