菠蘿潔粉蚧響應(yīng)殺撲磷基因差異表達(dá)分析①

何衍彪 吳婧波 趙艷龍③

(1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所 廣東湛江 524091;2 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 湖南婁底 417000)

菠蘿潔粉蚧Dysmicoccus brevipes（Cock‐ erell） 隸屬于半翅目 （Hemiptera）、粉蚧科（Pseudococcidae），在世界各菠蘿產(chǎn)區(qū)均有分布［1-3］。菠蘿潔粉蚧是菠蘿重要病害—菠蘿凋萎病的主要傳播媒介，已在國內(nèi)外引起廣泛關(guān)注［4-6］?；瘜W(xué)防治是控制菠蘿潔粉蚧的重要措施，種苗浸泡處理效果尤其明顯［7］。殺撲磷（methidathion）又名速撲殺，由瑞士汽巴嘉基公司開發(fā)的廣譜、高效有機(jī)磷農(nóng)藥，具有較強(qiáng)的觸殺和胃毒作用，是園林植物、果樹等經(jīng)濟(jì)作物介殼蟲常見的防治藥劑［8］。有機(jī)磷類殺蟲劑進(jìn)入生物體后，所發(fā)生的生物轉(zhuǎn)化主要是初級(jí)代謝中的氧化反應(yīng)和水解反應(yīng)，以及一些次級(jí)代謝（軛合代謝），這些代謝需要細(xì)胞色素P450 酶系（P450s）、羧酸酯酶（CarEs）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）等解毒酶的參與［9-10］。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是從整體轉(zhuǎn)錄水平系統(tǒng)研究基因轉(zhuǎn)錄圖譜并揭示復(fù)雜生物學(xué)通路和性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制的學(xué)科［11］。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-Seq）可以全面快速地獲取某一物種個(gè)體、特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本，反映出它們的表達(dá)水平，是分析生物對(duì)不同外部環(huán)境分子響應(yīng)機(jī)制的重要手段。鑒于菠蘿潔粉蚧目前無公布基因組圖譜，本研究采用RNA-seq 高通量測序的方法分別對(duì)清水處理和殺撲磷藥液處理的菠蘿潔粉蚧的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序，并利用生物信息學(xué)的方法對(duì)所得unigene進(jìn)行功能注釋和功能分類，以便獲得殺撲磷藥劑處理和非處理的菠蘿潔粉蚧轉(zhuǎn)錄組信息，研究菠蘿潔粉蚧在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑的響應(yīng)，為深入研究昆蟲的解毒機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx：在廣東省農(nóng)墾豐收糖業(yè)發(fā)展有限公司菠蘿生產(chǎn)基地，從植株根部采集菠蘿潔粉蚧，用“南瓜＋蛭石”的方法進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng)［3］；動(dòng)物RNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

參照何衍彪［12］毒力測定結(jié)果，分別取致死中濃度（LC50）藥液和清水浸泡30 s 的菠蘿潔粉蚧雌蟲50 頭（2 齡若蟲、成蟲各25 頭），用濾紙吸干蟲體表面的水分，24 h 后置于液氮中，用動(dòng)物RNA 提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將樣品管置于干冰中送廣州基迪奧生物科技有限公司測序。

1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序

用帶有Oligo（dT）的磁珠富集樣品mRNA，向得到的mRNA 中加入Fragmentation Buffer 使其片斷化，再以片斷化的mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA 第一鏈，隨后通過DNA 聚合酶I、RNase H、dNTPs 及緩沖液合成cDNA 第二鏈，再用QiaQuick PCR 試劑盒純化，加EB 緩沖液洗脫，經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A、連接序接頭，最后用瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建好的文庫用Illumina HiSeqTM4000進(jìn)行測序。

1.2.3 序列組裝與功能注釋

按照無參考基因組的樣本進(jìn)行分析。用Trinity 軟件將過濾后的reads 拼接成轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本去冗余后得到Unigene；利用blastx將組裝出來的 Unigene 序列與 Nr、SwissProt、KOG 和 KO 四個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，以每個(gè)Unigene在數(shù)據(jù)庫中相似度最高的那一條序列為對(duì)應(yīng)的同源序列，并確定同源序列所屬物種，統(tǒng)計(jì)比對(duì)到各個(gè)物種的同源序列數(shù)量［13］。

1.2.4 差異表達(dá)基因分析

根據(jù)樣本基因表達(dá)水平，利用EdgeR軟件進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，篩選受殺撲磷誘導(dǎo)表達(dá)的基因（判斷標(biāo)準(zhǔn)為偽發(fā)現(xiàn)率小于0.05，差異倍數(shù)兩倍以上）。然后對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類和KEGG代謝通路富集分析［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與序列組裝

構(gòu)建文庫用Illumina HiSeqTM4000 測序，殺撲磷藥液處理組（NN-Y）和對(duì)照組（NN27）測序分別獲得9.30 G 和10.04 G 數(shù)據(jù)量，GC 含量分別為39.17%和39.22%，其Q30（錯(cuò)誤率小于0.1%的堿基占比）分別為94.98%和94.99%。對(duì)測序得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行de novo組裝，獲得了52 806 Unigene （其 中 15 890 個(gè) Unigene 在 Nr、 Swis‐sProt、KOG和KO四個(gè)數(shù)據(jù)庫中有注釋），平均長度分別為1 007 bp，N50為2 270 bp。

2.2 差異表達(dá)基因分析

通過差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)分析，與清水處理的對(duì)照組（NN27）相比，殺撲磷藥液處理組（NN-Y）中共發(fā)現(xiàn)8 389 個(gè)差異基因（DEGs），其中表達(dá)量上調(diào)的有3 068 個(gè)，下調(diào)的有5 321 個(gè)（圖1）。與抗逆、解毒相關(guān)的差異表達(dá)基因中，下調(diào)的基因數(shù)量明顯多于上調(diào)的基因數(shù)量。其中乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase）相關(guān)差異表達(dá)基因下調(diào)和上調(diào)的基因數(shù)量分別為4 個(gè)和1 個(gè)，細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）相關(guān)差異表達(dá)基因下調(diào)和上調(diào)的基因數(shù)量分別為25 個(gè)和11 個(gè)，羧酸酯酶（Carboxylesterase）相關(guān)差異表達(dá)基因下調(diào)和上調(diào)的基因數(shù)量分別為12 個(gè)和3 個(gè)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase）相關(guān)差異表達(dá)基因下調(diào)的基因數(shù)量和上調(diào)的基因數(shù)量分別為13個(gè)和4個(gè)（表1）。

表1 部分與抗逆、解毒相關(guān)的差異表達(dá)基因

續(xù)表1 部分與抗逆、解毒相關(guān)的差異表達(dá)基因

2.3 差異表達(dá)基因富集分析

Gene Ontology 中生物學(xué)可以分為生物學(xué)過程（biological process）、 細(xì) 胞 組 分 （cellular component）和分子功能（molecular function）3部分，某一差異基因可能同時(shí)屬于多個(gè)功能類別。富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因中參與生物學(xué)過程的差異基因有1 125 個(gè)，其中參與細(xì)胞和新陳代謝過程、單組織過程的差異基因所占比例較高；參與細(xì)胞組分的差異基因有552個(gè)，其中細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞膜的差異基因所占比例較高，其余組分比例較低；參與分子功能的差異基因有722 個(gè)，大多數(shù)表現(xiàn)為結(jié)合和催化活性。生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能三部分下調(diào)的差異基因數(shù)量分別為811 個(gè)、436 個(gè)和501 個(gè)，下調(diào)的差異基因數(shù)量明顯多于上調(diào)差異基因數(shù)量（圖2）。

對(duì)NN27、NN-Y 兩個(gè)種群樣本差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)在脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism）、淀粉與蔗糖的代謝（Starch and sucrose metabolism）、 溶 酶 體（Lysosome）、甘油酯代謝（Glycerolipid metab‐olism）、神經(jīng)活性配體受體相互作用（Neuroac‐tive ligand-receptor interactiom）和類固醇生物合成（Steroid biosynthesis）等代謝通路顯著富集（圖3）。

與清水處理的對(duì)照組（NN27）相比，殺撲磷藥液處理組（NN-Y）關(guān)于類固醇生物合成通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為34 個(gè)和3 個(gè)，關(guān)于神經(jīng)活性配體受體相互作用通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為28 個(gè)和1 個(gè)，關(guān)于甘油酯代謝通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為34 個(gè)和2 個(gè)，關(guān)于溶酶體通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為9 個(gè)和39個(gè)，關(guān)于淀粉與蔗糖的代謝通路上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為13 個(gè)和27 個(gè)，關(guān)于脂肪酸代謝上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為10個(gè)和18個(gè)。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組分析為挖掘昆蟲功能基因提供了有效方法，促進(jìn)了昆蟲食性轉(zhuǎn)化、生理適應(yīng)、協(xié)同進(jìn)化等分子機(jī)制研究［15］。本研究利用RNA-Seq 高通量測序技術(shù)，研究了殺撲磷藥液處理和清水處理菠蘿潔粉蚧的差異表達(dá)基因，并對(duì)差異基因的蛋白的分類、功能及代謝通路做了初步的解析。發(fā)現(xiàn)參與分子功能的基因大多體現(xiàn)在結(jié)合和催化活性方面，在脂肪酸代謝、淀粉與蔗糖的代謝、溶酶體、甘油酯代謝、神經(jīng)活性配體受體相互作用和類固醇生物合成等代謝通路顯著富集。

與清水處理組相比，殺撲磷藥液處理組菠蘿潔粉蚧表達(dá)量下調(diào)的總差異基因數(shù)明顯多于表達(dá)量上調(diào)的與乙酰膽堿酯酶、細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等抗逆、解毒相關(guān)的下調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)也明顯多于上調(diào)基因的，但關(guān)于類固醇生物合成和神經(jīng)活性配體受體相互作用通路中上調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)明顯多于下調(diào)基因。

昆蟲對(duì)殺蟲劑的應(yīng)激反應(yīng)有助于昆蟲抗藥性的研究，但昆蟲對(duì)殺蟲劑的應(yīng)激反應(yīng)有別于昆蟲抗藥性，是昆蟲在短時(shí)間內(nèi)的一種動(dòng)態(tài)反應(yīng)，而昆蟲抗藥性是在長期的自然選擇過程形成的對(duì)殺蟲劑的適應(yīng)性。前人研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲對(duì)殺蟲劑的應(yīng)激反應(yīng)跟殺蟲劑的處理劑量有關(guān)。乙酰膽堿酯酶活性隨甲維鹽處理劑量增加時(shí)，對(duì)斑翅果蠅和黑腹果蠅成蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性均具有一定的抑制作用，低劑量甲維鹽處理斑翅果蠅成蟲后，乙酰膽堿酯酶活性明顯升高［16］。本研究中乙酰膽堿酯酶等相關(guān)抗逆、解毒基因表達(dá)量以下調(diào)為主，這可能與以致死中濃度（LC50）殺撲磷藥液浸泡30 s 的處理方式有關(guān)。殺撲磷對(duì)菠蘿潔粉蚧處理時(shí)間相對(duì)較長，使菠蘿潔粉蚧得以與殺撲磷藥液充分接觸，導(dǎo)致試蟲承載的藥劑劑量相對(duì)較高。殺撲磷藥液浸泡處理不同時(shí)間對(duì)菠蘿潔粉蚧相關(guān)基因應(yīng)激反應(yīng)的影響有待于進(jìn)一步研究。