基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測江蘇省中部地區(qū)小麥赤霉病病菌的種群組成

許 苗，馮 慧，王淑琛，馬家新，葉文武，鄭小波

(南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/農(nóng)業(yè)部作物病蟲害監(jiān)測與防控重點開放實驗室，江蘇南京 210095)

小麥赤霉病是由鐮孢菌(Fusarium)的多個種引起的一種毀滅性病害。該病在我國主要發(fā)生于溫暖濕潤和半濕潤地區(qū)[1]，在長江中下游地區(qū)發(fā)生尤為嚴重，一般年份因該病害造成的小麥產(chǎn)量損失高達13%左右，嚴重時損失過半[2]。江蘇省是長江中下游重要冬麥區(qū)，其溫暖濕潤的氣候條件有利于病原菌在小麥揚花期侵入，導(dǎo)致小麥穗部發(fā)病，進而引起小麥赤霉病的流行。

不同國家或地區(qū)，引起小麥赤霉病的鐮孢菌種類有所不同。據(jù)報道，有17個種的鐮孢菌可引起小麥赤霉病，其中最主要的有5個種[3]。在中國有15個種的鐮孢菌是小麥赤霉病的致病菌，但是在一個省區(qū)一般只有一到數(shù)個種[4-7]，主要是亞細亞鐮孢(F.asiaticum)和禾谷鐮孢(F.graminearum)[8-10]。小麥赤霉病病菌的種群組成與地理分布有關(guān)，不同地區(qū)的主要致病菌種類因地理生態(tài)環(huán)境差異而有所不同[11]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在引起中國小麥赤霉病的兩種主要致病菌中，亞細亞鐮孢主要分布在年平均氣溫高于15 ℃的溫暖地區(qū)，禾谷鐮孢則大多分布在年平均氣溫低于15 ℃的寒冷地區(qū)。徐 飛等[13]發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢和亞細亞鐮孢是河南省小麥赤霉病的優(yōu)勢種群；假禾谷鐮孢(F.pseudograminearum)、黃色鐮孢(F.culmorum)、木賊鐮孢(F.equiseti)和擬輪枝鐮孢(F.verticillioides)為次要種群。潘曉靜等[14]報道，引起東北地區(qū)小麥赤霉病的鐮孢有7個種，即禾谷鐮孢、藤倉鐮孢(F.fujikuroi)、燕麥鐮孢(F.avenaceum)、尖孢鐮孢(F.oxysporum)、木賊鐮孢(F.equiseti)、銳頂鐮孢(F.acuminatum)和擬輪枝鐮孢(F.verticillioides)。Qiu等[15]和Dong等[16]報道，亞細亞鐮孢是江蘇省小麥赤霉病的主要致病菌，其次是禾谷鐮孢，但對該省赤霉病病菌的其他種類知之甚少。

傳統(tǒng)上對小麥赤霉病病菌的種群組成主要依據(jù)組織分離法進行病原菌鑒定，該方法對多病原病害的鑒定存在檢出率低且耗時、費力的缺點。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，分子檢測技術(shù)已成功應(yīng)用于小麥赤霉病病菌種群組成與結(jié)構(gòu)的分析[17-18]，使小麥赤霉病病菌種類檢測、鑒定較傳統(tǒng)方法更為快速準確，但這些檢測、鑒定方法依舊存在檢測周期長或特異性偏低等缺點。引起小麥赤霉病的鐮孢菌種類多，不同種類病原菌形態(tài)特征相似，所致病害癥狀相近，但不同種類鐮孢菌在發(fā)病麥穗組織中產(chǎn)生的毒素類型有差異[16,19-20]，基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立的特異性檢測技術(shù)[21]，具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、檢測時間短、結(jié)果可肉眼觀察判斷等優(yōu)點。

本研究采用本課題組研發(fā)的可以分別特異性檢測7種小麥赤霉病主要病原菌的LAMP檢測技術(shù)，對江蘇省中部地區(qū)小麥赤霉病樣本進行檢測，旨在了解該地區(qū)小麥赤霉病致病鐮孢菌種類及其地理分布，并為小麥赤霉病病菌種群與結(jié)構(gòu)分析提供新的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 小麥赤霉病樣本的采集

2017年5月上旬至下旬從江蘇省鎮(zhèn)江的句容市、揚州的儀征市和廣陵區(qū)、南京的江寧區(qū)和浦口區(qū)小麥田間采集帶有粉紅色霉層的小麥赤霉病樣本151份(1個病穗作為1份樣本)。病樣采集后分別用自封袋裝好，并編號，記錄采集地信息。

1.2 檢測的目標病原菌

檢測的7種病原菌均為小麥赤霉病的常見致病菌，包括亞細亞鐮孢、禾谷鐮孢、藤倉鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢、擬輪枝鐮孢和木賊鐮孢。

1.3 病穗組織DNA提取

每份樣本各取新鮮病穗上1～2個帶有粉紅色霉層的小穗，剪掉麥芒，于滅菌的研缽中加入液氮充分研磨，DNA提取采用中國北京天根公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒DNAsecure Plant Kit，方法參見說明書。提取的DNA作為LAMP檢測的模板，于-20 ℃保存。

1.4 小麥赤霉病病菌的LAMP檢測

7種目標病原菌的LAMP特異性檢測擴增條件、靈敏度及引物序列見表1和表2。所列7個LAMP檢測技術(shù)的反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×Thermo Pol Buffer，4 μL MgSO4(50 mmol·L-1)，4 μL betaine(5 mmol·L-1)，3.5 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，內(nèi)引物FIP、BIP(20 μmol·L-1)各2 μL，外引物F3、B3(10 μmol·L-1)各0.5 μL，環(huán)引物 LF、LB(10 μmol·L-1)各1 μL，2 μL 羥基萘酚藍(hydroxynaphthol blue，HNB)(2.4 mmol·L-1)，1 μL Bst DNA 聚合酶(8 U·μL-1)，2 μL模板DNA，滅菌水補至26 μL。

以1.3節(jié)中提取的DNA為模板，按照上述LAMP反應(yīng)體系分別進行7種病原菌的檢測，以相應(yīng)病原菌標準菌株的DNA為陽性對照(藤倉鐮孢標準菌株為CBS183.29，其他6種鐮孢菌標準菌株參見表1對應(yīng)參考文獻)，以ddH2O為陰性對照。擴增反應(yīng)前加入羥基奈酚藍(HNB)為反應(yīng)指示劑，反應(yīng)結(jié)束后，通過肉眼觀察指示劑羥基奈酚藍顏色變化判定擴增結(jié)果，反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物呈天藍色為陽性，呈紫色為陰性。

表17種小麥赤霉病病菌的LAMP檢測技術(shù)體系

Table1LAMPassayusedfordetectingsevenFusariumspeciescausingwheatscab

檢測技術(shù)LAMP目標病原菌Objectivespecies擴增條件LAMPreaction靈敏度Sensitivity/(pg·μL-1)引物PrimerCYP51C?F．a(chǎn)sia?LAMPF．a(chǎn)siaticum60minat63℃70[22]CYP51C?Fg?LAMPF．graminearum60minat62℃100[23]IGS?Ff?LAMPF．fujikuroi70minat62℃100表2Table2CYP51C?Fc?LAMPF．culmorum60minat63℃83[24]Esyn1?F．a(chǎn)ven?LAMPF．a(chǎn)venaceum70minat63℃100[25]Pgk?Fv?LAMPF．verticillioides70minat62℃100[26]CYP51C?Fe?LAMPF．equiseti60minat62℃10[23]

表2用于檢測藤倉鐮孢的LAMP引物

Table2LAMPprimersusedforspecificdetectionofFusariumfujikuroi

目標病原菌Objectivespecies引物名稱Primername序列Sequence(5′→3′)藤倉鐮孢菌Ff?FIPTCAGCCTACCCTAGACCCTCGCCCTTACCTTTGCTTGAF．fujikuroiFf?BIPAGCTAGACTACTCTAAGGGTAGGTACAACTTCCACCAATTGCAFf?F3AGACACCGTTTTGTTTTGCFf?B3CTTTTCTCCAACTTCACAGCFf?LFATCCGGCCAAGACCGTC

1.5 小麥赤霉病病原菌的分離、驗證

為進一步驗證小麥赤霉病病原菌的LAMP檢測結(jié)果，選擇部分LAMP呈陽性樣本，采用組織分離法進行病菌分離[27]。將發(fā)病小麥穗剪成約0.5 cm × 0.5 cm的組織塊，在超凈工作上經(jīng)70%酒精(v/v)表面消毒1 min，移至2%(v/v)NaClO中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次；用滅菌的濾紙片吸取殘存在組織塊表面的水分，并在超凈工作臺上吹干；將病組織置于PDA(potato dextrose agar)平板上，于黑暗條件下25 ℃培養(yǎng)3 d 后，挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)入新的PDA培養(yǎng)基上純化病原菌。通過病原菌形態(tài)觀察，進行鐮孢菌屬的種類鑒定。參照許 娟[28]描述的CTAB(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide)法提取分離純化的菌絲體DNA，通過TEF-1a基因序列比對分析鑒定小麥赤霉病病菌的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測結(jié)果

7個LAMP檢測體系對某被測樣本的檢測結(jié)果(圖1)顯示，可特異性識別亞細亞鐮孢(試管編號2號，下同)、禾谷鐮孢(3號)和擬輪枝鐮孢(8號)的LAMP檢測結(jié)果呈陽性。判定該樣本病組織中包含亞細亞鐮孢、禾谷鐮孢和擬輪枝鐮孢3種病原菌。其他4種病原菌的LAMP檢測結(jié)果(4、5、6和7號)呈陰性，表明該樣本中不存在這4種小麥赤霉病病菌。151份小麥赤霉病樣本檢測結(jié)果(圖2)表明，所有樣本中共檢測到6種小麥赤霉病病菌，亞細亞鐮孢的檢出率最高，達100%；其次為藤倉鐮孢，檢出該種病菌的樣本有15份，檢出率為10.0%；隨后依次為禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢和擬輪枝鐮孢，檢出樣本數(shù)分別為10、4、3和1，檢出率依次為6.0%、2.6%、2.0%和0.6%。所有樣本均未檢測到木賊鐮孢。

1:陽性對照;2～8:被測樣品分別對亞細亞鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、藤倉鐮孢、燕麥鐮孢、木賊鐮孢、擬輪枝鐮孢的檢測結(jié)果;9:陰性對照

1:Positive control;2-8:Sample tested result forFusariumasiaticum,F.graminearum,F.culmorum,F.fujikuroi,F.avenaceum,F.equisetiandF.verticillioides,respectively;9:Negative control

圖1小麥赤霉病菌的LAMP檢測結(jié)果

Fig.1DetectionofFusariumspeciescausingwheatscabusingLAMPassays

不同地點的病原菌種類分布有所差異(表3)。151份樣本中有122份樣本僅檢測到亞細亞鐮孢，表明被測樣本由亞細亞鐮孢單獨侵染引起。另有29份樣本檢測到2種或3種鐮孢菌，占被測總樣本數(shù)的19.2%，表明這些樣品所在地區(qū)小麥赤霉病存在復(fù)合侵染狀況，且均由亞細亞鐮孢與藤倉鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢或擬輪枝鐮孢復(fù)合侵染引起。由此可見，江蘇中部地區(qū)引起小麥赤霉病的優(yōu)勢種為亞細亞鐮孢，藤倉鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢和擬輪枝鐮孢的也有零星分布。

F.asia:Fusariumasiaticum;Ff:F.fujikuroi;Fg:F.graminearum;Fc:F.culmorum;F.aven:F.avenaceum;Fv:F.verticillioides;Fe:F.equiseti. 下同. The same in table 3 and 4.

圖2引起小麥赤霉病的7種鐮孢菌的LAMP檢測結(jié)果

Fig.2LAMPdetectionofFusariumspeciescausingwheatscab

表3江蘇中部地區(qū)引起小麥赤霉病的鐮孢菌種類及分布

Table3FusariumspeciescausingwheatscabandtheirdistributioninthemiddleareaofJiangsu

病菌種數(shù)No．ofspecies鐮孢菌種類Fusariumspp．樣本數(shù)No．ofsamples采集地點Samplingsite一種OnespeciesF．a(chǎn)sia122句容、江寧、浦口、儀征、廣陵Jurong，Jiangning，Pukou，Yizheng，Guangling兩種TwospeciesF．a(chǎn)sia+Ff13句容、江寧 Jurong，JiangningF．a(chǎn)sia+Fg6句容、江寧、浦口 Jurong，Jiangning，PukouF．a(chǎn)sia+Fc4江寧、儀征 Jiangning，YizhengF．a(chǎn)sia+F．a(chǎn)ven2廣陵 Guangling三種ThreespeciesF．a(chǎn)sia+Fg+Ff2句容、江寧 Jiangning，JurongF．a(chǎn)sia+Fg+Fv1句容 JurongF．a(chǎn)sia+Fg+F．a(chǎn)ven1廣陵 Guangling合計Total151

檢測結(jié)果(表3)表明，亞細亞鐮孢在江蘇中部5個采集地區(qū)均有分布，而藤倉鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢和擬輪枝鐮孢5種小麥赤霉病病菌僅在局部地區(qū)被檢測到。例如，禾谷鐮孢在句容、江寧、浦口和廣陵有分布，而黃色鐮孢和燕麥鐮孢僅在揚州的廣陵區(qū)被檢測到。

2.2 陽性樣本的病原菌分離驗證

為了驗證LAMP檢測結(jié)果的準確性和可靠性，選擇34份LAMP陽性樣本，包含僅單獨檢測到亞細亞鐮孢以及同時檢測到2或3種鐮孢菌的樣本，對其進行病原菌分離與鑒定。結(jié)果(表4)表明，從僅檢測到亞細亞鐮孢的10份陽性樣本，以及檢測到亞細亞鐮孢與其他種類鐮孢菌復(fù)合侵染的24份陽性樣本中均分離出亞細亞鐮孢，進一步證實亞細亞鐮孢為江蘇中部地區(qū)引起小麥赤霉病的優(yōu)勢種。在24份檢測到2種或3種鐮孢菌的陽性樣本中，除燕麥鐮孢外，其余4個種均被分離出來，該結(jié)果進一步證實藤倉鐮孢、禾谷鐮孢、黃色鐮孢和擬輪枝鐮孢是該地區(qū)小麥赤霉病發(fā)生的病原菌種類。除亞細亞鐮孢外，LAMP檢測結(jié)果與分離結(jié)果存在一定差異，例如，從9份同時檢測到亞細亞鐮孢和禾谷鐮孢的陽性樣本中，僅4份分離出禾谷鐮孢(表4)(表4中將一份樣本中分離到的同1種病原菌記載為該病原菌的1個菌株)。

本研究未能從3份檢測到燕麥鐮孢的陽性樣本中分離出該病原菌，可能與該病菌生長速度較其他鐮孢菌慢，其菌落被其他病原菌覆蓋故未能獲得純培養(yǎng)所致。陽性樣本的病原菌分離驗證結(jié)果表明，本研究采用的LAMP檢測技術(shù)具有準確性和可靠性，可作為小麥赤霉病菌種群組成研究的新技術(shù)。

表4LAMP檢測陽性樣本的分離與鑒定

Table4IsolationandidentificationofFusariumspp.frompositivesamplesdetectedbyLAMPassay

ALMP檢測結(jié)果ResultdetectedbyLAMP樣本數(shù)No．ofsample分離到鐮孢菌種類Fusariumspp．isolated鐮孢菌Fusariumspp．數(shù)量NumberF．a(chǎn)sia10F．a(chǎn)sia10F．a(chǎn)sia+Ff9F．a(chǎn)sia9Ff1F．a(chǎn)sia+Fg5F．a(chǎn)sia5Fg2F．a(chǎn)sia+Fc4F．a(chǎn)sia4Fc1F．a(chǎn)sia+F．a(chǎn)ven2F．a(chǎn)sia2F．a(chǎn)ven0F．a(chǎn)sia+Fg+Ff2F．a(chǎn)sia2Fg1Ff0F．a(chǎn)sia+Fg+Fv1F．a(chǎn)sia1Fv1Fg0F．a(chǎn)sia+Fg+F．a(chǎn)ven1F．a(chǎn)sia1Fg1F．a(chǎn)ven0

3 討 論

小麥赤霉病病菌種類的檢測與鑒定是研究小麥赤霉病發(fā)生發(fā)展及其預(yù)防和抗病育種的基礎(chǔ)。由鐮孢菌引起的小麥赤霉病的檢測診斷主要依據(jù)病害癥狀和病原菌的形態(tài)學特征。近年來已報道的基于PCR的分子生物學鑒定技術(shù)也逐步應(yīng)用于小麥赤霉病菌的檢測[17,18,28-30]。已有的檢測方法大多需要先分離獲得病原菌的純培養(yǎng)，然后提取病原菌DNA進行基因序列比對，整個檢測鑒定過程費時、費工，操作比較繁瑣，且效率低。張 林等[31]采用 Chelex-100法從病害標樣材料上直接提取DNA與特異性分子標記檢測相結(jié)合的方法快速檢測小麥赤霉病病菌，較之以往的PCR技術(shù)更為簡便、快速，但該方法對于發(fā)病癥狀不明顯病組織的檢測效果欠佳。本研究采用的LAMP技術(shù)特異性強，所設(shè)計的4條引物可識別6個靶標區(qū)段，其特異性較普通PCR有較大提升，靈敏度高，本研究應(yīng)用的7個LAMP檢測體系的靈敏度均能達到pg(picogram，1 g=109 pg)級水平；對DNA模板質(zhì)量要求低，可從病組織中提取的包含有寄主植物、病原菌和其他腐生微生物的DNA中直接檢出目標病原菌；檢測所需時間短，完成一次檢測(從病組織DNA提取至獲得LAMP檢測結(jié)果)僅需2 h左右；操作簡單，經(jīng)濟實用，不需要昂貴的儀器設(shè)備。值得指出的是，本實驗室研發(fā)的7個LAMP檢測技術(shù)是分別特異性針對7種小麥赤霉病病菌的，因而病原菌的檢測與種的鑒定可同步完成。

本研究確定亞細亞鐮孢為江蘇省中部地區(qū)小麥赤霉病的優(yōu)勢致病菌，與前人的研究結(jié)果基本一致[12,15,16,30,32]。本研究發(fā)現(xiàn)由該鐮孢菌引起的小麥赤霉病比重顯著上升。假禾谷鐮孢(F.pseudograminearum)是引起小麥莖基腐病的主要致病菌[33]，在河南省分布較廣泛，同時該鐮孢菌也是部分地區(qū)小麥赤霉病的致病菌[13,34]。本研究也應(yīng)用本實驗室研發(fā)的假禾谷鐮孢的LAMP檢測技術(shù)對該病原菌進行了檢測，151份小麥赤霉病樣本的檢測結(jié)果均為陰性(結(jié)果未顯示)，表明該鐮孢菌對目前江蘇中部地區(qū)小麥赤霉病的發(fā)生可能不起作用。雖然本研究基本涵蓋了小麥赤霉病的主要致病菌種類，但是由于本實驗室研發(fā)的LAMP技術(shù)體系檢測的病原菌種類數(shù)量有限，還需進一步研發(fā)其他小麥赤霉病病菌的LAMP檢測體系，以補充完善小麥赤霉病病菌的快速檢測技術(shù)。

綜上所述，本研究應(yīng)用LAMP技術(shù)明確了江蘇省中部地區(qū)小麥赤霉病菌的種群組成和地理分布，對小麥赤霉病的田間防治有一定的參考價值，并為小麥赤霉病菌的快速檢測和鑒定提供了新的方法。

致謝：南京農(nóng)業(yè)大學王秀娥老師、揚州大學陳孝仁老師為本研究采集部分小麥赤霉病樣本，謹此致謝！

參考文獻：

[1] GOSWAMI R S,KISTLER H C.Heading for disaster:Fusariumgraminearum on cereal crops [J].MolecularPlantPathology,2004,5(6):515.

[2] 黃 昌,牟建梅,劉敬陽,等.小麥赤霉病抗性鑒定和新抗源篩選 [J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2000(2):24.

HUANG C,MOU J M,LIU J Y,etal.Resistant identification and screening new sources of wheat head blight [J].JiangsuAgriculturalSciences,2000(2):24.

[3] PARRY D W,JENKINSO P J,MCLEOD L.Fusariumear blight(scab) in small grain cereals-a review [J].PlantPathology,1995,44(2):207.

[4] 陸維忠,程順和,王裕中.小麥赤霉病研究[M].北京:科學出版社,2001:15.

LU W Z,CHENG S H,WANG Y Z.Study of wheat head blight [M].Beijing:Science Press,2001:15.

[5] 全國小麥赤霉病研究協(xié)作組.我國小麥赤霉病穗部鐮刀菌種類、分布及致病性 [J].上海師范學院學報(自然科學版),1984(3):72-74.

National Cooperation Group for Wheat Head Blight Research.Distribution and pathogenicity ofFusariumspecies causing wheat scab [J].JournalofShanghaiNormalUniversity(NatureSciences),1984(3):72-74.

[6] 李克昌.小麥赤霉病及其防治[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社,1982:20.

LI K C.Study of wheat head blight and its prevention [M].Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Publishers,1982:20.

[7] 陳利鋒,趙燕駒,馬國良,等.青海省小麥赤霉病致病菌的鑒定 [J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,1996,19(2):117.

CHEN L F,ZHAO Y J,MA G L,etal.Identification of pathogen causing wheat head blight in Qinghai Province [J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity,1996,19(2):117.

[8] O'DONNELL K,WARD T J,GEISER D M,etal.Genealogical concordance between the mating type locus and seven other nuclear genes supports formal recognition of nine phylogenetically distinct species within theFusariumgraminearumclade [J].FungalGeneticsandBiology,2004,41(6):600-601.

[9] O'DONNELL K,WARD T J,ABERRA D,etal.Multilocus genotyping and molecular phylogenetics resolve a novel head blight pathogen within theFusariumgraminearumspecies complex from Ethiopia [J].FungalGeneticsandBiology,2008,45(11):1514.

[10] QU B,LI H P,ZHANG J B,etal.Geographic distribution and genetic diversity ofFusariumgraminearumandF.asiaticumon wheat spikes throughout China [J].PlantPathology,2008,57(1):15.

[11] DAAMEN R A,LANGERAK C J,STOL W.Surveys of cereal disease and pests in the Netherlands.Ⅲ.Monographella nivalis andFusariumspp.in winter wheat fields and seed lots [J].NetherlandsJournalofPlantPathology,1991,97:106.

[12] ZHANG J B,LI H P,DANG FJ,etal.Determination of the trichothecene mycotoxin chemotypes and associated geographical distribution and phylogenetic species of theFusariumgraminearumclade from China [J].MycologicalResearch,2007,111(8):967.

[13] 徐 飛,楊共強,王俊美,等.河南省小麥赤霉病菌種群組成及致病力分化[J].植物病理學報,2016,46(3):294.

XU F,YANG G Q,WANG J M,etal.Composition and variation in aggressiveness ofFusariumpopulations causing wheat head blight in Henan Province [J].ActaPhytopathologicaSinica,2016,46(3):294.

[14] 潘曉靜,陳 楠,姚 遠,等.東北地區(qū)小麥赤霉病鐮孢菌種群及其致病性測定 [J].華北農(nóng)學報,2015,30(3):205.

PAN X J,CHEN N,YAO Y,etal.Population and pathogenicity ofFusariumspp.causing wheat head blight in northeast of China [J].ActaAgriculturaeBoreali-sinica,2015,30(3):205.

[15] QIU J B,XU J H,SHI J R,etal.Molecular characterization of theFusariumgraminearumspecies complex in Eastern China [J].EuropeanJournalofPlantPathology,2014,139(4):811.

[16] DONG F,QIU J B,XU J H,etal.Effect of environmental factors onFusariumpopulation and associated trichothecenes in wheat grain grown in Jiangsu Province,China [J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2016,230:58.

[17] O'DONNELL K,KISTLER H C,TACKE B K,etal.Gene genealogies reveal global phylogeographic structure and reproductive isolation among lineages ofFusariumgraminearumthe fungus causing wheat scab [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2000,97(14):7905-7910.

[18] CONSOLO V F,ORTEGA L M,GRACIELA S,etal.Genetic diversity ofFusariumgraminearumsensu lato isolates from wheat associated with Fusarium head blight in diverse geographic locations of Argentina [J].RevistaArgntentinadeMicrobiologia,2015,47(3):245.

[19] LI F Q,WANG W,MA J J,etal.Natural occurrence of masked deoxynivalenol in Chinese wheat and wheat-based products during 2008-2011 [J].WorldMycotoxinJournal,2012,5(3):221.

[20] JI F,XU J H,LIU X,etal.Natural occurrence of deoxynivalenol and zearalenone in wheat from Jiangsu Province,China [J].FoodChemistry,2014,157:393.

[21] NOTOMI T,OKAYAMA H,MASUBUCHI H,etal.Loop-mediated isothermal amplification of DNA [J].NucleicAcidsResearch,2000,28(12):63.

[22] XU M,YE W W,ZENG D D,etal.Rapid diagnosis of wheat head blight caused byFusariumasiaticumusing a loop-mediated isothermal amplification assay [J].AustralasianPlantPathology,2017,46(2):4.

[23] LU C C,ZHANG H F,WANG Y C,etal.Rapid diagnosis ofFusariumroot rot in soybean caused byFusariumequisetiorFusariumgraminearumusing loop-mediated isothermal amplification(LAMP) assay [J].AustralasianPlantPathology,2015,44(4):440.

[24] ZENG D D,YE W W,XU M,etal.Rapid diagnosis of soya bean root rot caused byFusariumculmorumusing a Loop-mediated isothermal amplification assay [J].JournalofPhytopathology,2017,165(165):252.

[25] 徐 倩.三種果類褐腐病菌及燕麥鐮孢菌的LAMP檢測 [D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學，2017:50.

XU Q.LAMP detection ofFusariumavenaceumand three brown rot pathogens of fruits [D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2017:50.

[26] 曾丹丹.擬輪枝鐮孢、黃色鐮孢、雪松疫霉、栗黑水疫霉及大豆種傳病原菌的LAMP檢測 [D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學，2017:27.

ZENG D D.LAMP detection ofFusariumverticillioides,F.culmorum,Phytophthoralateralis,P.cambivoraand seed-borne pathogens on soybean [D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2017:27.

[27] 方中達.植病研究方法 [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.

FANG Z D.Research methodology of plant diseases [M].Beijing:China Agriculture Press,1998.

[28] 許 娟.安徽小麥赤霉病菌生物學特性及遺傳多樣性研究 [D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學,2012:23.

XU J.The biological characteristics and genetic diversity of wheat scab pathogens in Anhui Province [D].Hefei:Anhui Agricultural University,2012:23.

[29] 方興洲.安徽小麥赤霉病菌菌群分布及產(chǎn)毒類型相關(guān)研究 [D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學,2013:17.

FANG X Z.Distribution and toxin types of wheat scab pathogens in Anhui Province [D].Hefei:Anhui Agricultural University,2013:17.

[30] 胡迎春,李 偉,陳懷谷,等.中國冬小麥主產(chǎn)區(qū)小麥赤霉病菌種群組成及其致病力 [J].江蘇農(nóng)業(yè)學報,2010,26(5):955.

HU Y C,LI W,CHEN H G,etal.Composition and pathogenicity of theFusariumgraminearumspecies complex in main winter wheat production areas of China [J].JiangsuJournalofAgriculturalSciences,2010,26(5):955.

[31] 張 林,張夢雅,康 健,等.一種快速檢測小麥赤霉病菌種類的方法 [J].河南農(nóng)業(yè)科學，2017,46(1):88.

ZHANG L,ZHANG M Y,KANG J,etal.A rapid detection method forGibberellasaubinetii[J].JournalofHenanAgriculturalSciences,2017,46(1):88.

[32] 史文琦,楊立軍,馮 潔,等.小麥赤霉病流行區(qū)鐮刀菌致病種及毒素化學型分析 [J].植物病理學報,2011,41(5):492.

SHI W Q,YANG L J,FENG J,etal.Analysis on the population structure ofFusariumpathogenicspp. and its mycotoxin chemotypes in Fusarium head blight epidemic region [J].ActaPhytopathologicaSinica,2011,41(5):492.

[33] LI H L,YUAN H X,FU B,etal.First report ofFusariumpseudograminearumcausing crown rot of wheat in Henan,China [J].PlantDisease,2012,96(7):1065.

[34] AOKI T.Morphological and molecular characterization ofFusariumpseudograminearumsp.nov. formerly recognized as the group 1 population ofF.graminearum[J].Mycologia,1999,91(4):597.