殼聚糖納米磁性微球固定脂肪氧合酶的研究

夏云空 魏煒 楊帆

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都 610000）

殼聚糖納米磁性微球固定脂肪氧合酶的研究

夏云空 魏煒 楊帆2

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都 610000）

實驗采用溶膠凝膠法制備了納米磁性Fe3O4，并用殼聚糖對顆粒2四川大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，四川成都表面進行了表面修飾得到殼聚糖納米磁性微球復(fù)合載體，再以戊二醛為交聯(lián)劑將脂肪氧合酶固定在復(fù)合載體上，并測定了不同因素對游離酶和固定化酶活性的影響；實驗表明，微粒在電鏡觀察下呈亮黑色球狀，直徑約為150nm，并具有良好的磁性，固定在載體上酶的含量約為7.6%，游離酶的最適溫度為30℃，最適pH8.0，而固定化酶的最適溫度為30℃，最適pH9.0，當(dāng)H2O2濃度為12.0 g/L時，游離酶和固定化酶的活性最強；實驗結(jié)果表明通過交聯(lián)的方法成功將脂肪氧合酶固定在了納米磁性四氧化三鐵顆粒上，并表現(xiàn)出了較好的活性。

納米磁性Fe3O4固定酶 脂肪氧合酶 酶活

酶的固定化過程是指以化學(xué)或物理的手段，將酶束縛在一定區(qū)域內(nèi)，限制酶分子在此區(qū)域內(nèi)的催化作用，在應(yīng)用過程中，固定化酶能夠克服游離酶無法回收的缺點，可以提高酶的利用率，減低生產(chǎn)成本。目前用于固定化酶的載體種類很多，磁性物質(zhì)作為一種綠色材料是近年來研究較多的材料。目前，用于固定化酶的主要載體之一是納米Fe3O4，其制備方法也有多種，如水熱法，溶膠凝膠法和共沉淀法等［6］，磁性微球固定化酶的研究成為許多研究者青睞的課題。

脂肪氧合酶是一類較為常見的酶，應(yīng)用前景廣闊，可用于染料、涂料和洗滌劑等工業(yè)化生產(chǎn)。然而，脂肪氧合酶的穩(wěn)定性差、回收困難等缺點限制了其在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，酶的固定化可以顯著改善酶的熱穩(wěn)定性，因此，對尋找一種適宜與脂肪氧合酶的固定化載體和方法的研究是一項令人感興趣的工作。

本研究通過溶膠凝膠法制備納米磁性Fe3O4，并用殼聚糖對粒子進行了表面修飾得到納米磁性載體，然后用交聯(lián)法固定脂肪氧合酶，研究了影響酶活的因素，以期獲得一種較好的酶固定化方法，并為固定化脂肪氧合酶的進一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖1 Fe3O4納米粒子電鏡圖Fig.1 TEM image of naked Fe3O4nanoparticles

圖2 Fe3O4載體及固定化酶的的磁滯回線Fig.2 Magnetic curves of Fe3O4composite carrier and immobilized enzyme

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料與試劑

實驗所用七水合硫酸亞鐵、氫氧化鉀、硝酸鉀、氨水、無水乙醇、亞油酸等都為分析純，殼聚糖為生化試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋，DK-S28，上海森信儀器有限公司；pH計，PHS-25CW，上海般特儀器制造有限公司；雙光束紫外可見分光光度計，TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 納米磁性載體的制備

向圓底燒瓶中加入180mL濃度為3.0moL/L KNO3溶液和100 mL濃度為1.5moL/L KOH溶液，混勻后將溶液置于90℃的水浴中，在不斷攪拌和N2的保護下向溶液中滴加1.0mol/L FeSO4·7H2O溶液100mL；滴加完畢后，停止攪拌并靜置4 h，然后用磁鐵分離懸浮液，并將得到的黑色物質(zhì)用去離子水充分洗滌3次。之后，室溫下，將2%的乙酸溶液、300mL水、0.15mL Tween-80、1.5 g殼聚糖、12 g硫酸鈉、5.5 g納米Fe3O4加入到500mL三口燒瓶，冰水浴超聲10 min后，置于40℃水浴中，并通入N2保護2h，將47g硫酸鈉加入到100 mL40℃水中，快速滴加入三口燒瓶中沉降4h后，磁鐵分離殼聚糖包裹納米Fe3O4，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脂肪氧合酶的固定化

大豆經(jīng)粉碎去皮并以石油醚浸提得到脫脂大豆粉后，取一定質(zhì)量脫脂大豆粉，加水（固液比為1：5（w/v））攪拌1 h后，在4000r/min條件下，離心20min，取上清液即為粗酶液；將1.5g納米磁性載體和50 mL粗酶液加入到燒瓶中，超聲使其分散后，加入1.0 g戊二醛（占體系總量2%），常溫攪拌2 h后，磁鐵分離洗滌后獲得固定化脂肪氧合酶微粒，然后密封冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 底物溶液配制及酶活測定

酶活測定方法遵循有關(guān)文獻的基本步驟進行。

1.2.4 酶活影響因素的測定

pH值影響：將粗酶液（或固定化酶）加入到不同pH的反應(yīng)體系中，恒溫反應(yīng)后，進行酶活測定；溫度的影響：將粗酶液（或固定化酶）置于不同溫度的水浴環(huán)境中反應(yīng)后，進行酶活測定；雙氧水濃度的影響：將粗酶液（或固定化酶）加入含有一定濃度的雙氧水反應(yīng)體系中，恒溫反應(yīng)后進行酶活測定。

圖3 固定化酶的熱失重分析Fig.3 TGA of immobilized enzyme

圖4 pH對游離酶和固定化酶的活性影響Fig.4 Effect of pH on free and immobilized enzyme activity

圖5 溫度對游離酶和固定化酶的活性影響Fig.5 Effect of temperature on free and immobilized enzyme activity

圖6 H2O2濃度對游離酶和固定化酶的活性影響Fig.6 Effect of H2O2concentration on free and immobilized enzyme activity

2 結(jié)果與分析

2.1 納米Fe3O4形貌分析

用于固定化酶的材料以及性質(zhì)對酶活和酶的應(yīng)用具有非常重要的意義，好的固定化酶材料可以減少傳質(zhì)傳熱的影響，提高酶的催化效率。實驗制備的納米Fe3O4形貌如圖1所示。從圖中可以看出，所制備的納米Fe3O4為亮黑色球狀粒子，平均直徑約為150nm，粒子呈現(xiàn)出一定的團聚現(xiàn)象，這可能是由于粒子的磁性較強，且粒子的粒徑在納米范圍，具有很大的比表面積而擁有很高的表面自由能，因此需要團聚以降低降低表面自由能從而使體系趨于穩(wěn)定。

2.2 納米磁性顆粒的磁性能表征

Fe3O4載體及固定化酶的磁滯回線分別通過振動樣品磁強計測定得到，如圖2所示。Fe3O4載體的飽和磁強度為61.2 emu/g，固定化酶的飽和磁強度為53.4emu/g。固定化酶的飽和強度和Fe3O4載體相比有所下降，這是由于飽和磁強度與物質(zhì)的含量有關(guān)，隨著酶的固定化，F(xiàn)e3O4的含量相對減少，從而使其飽和磁強度有所下降；另一方面，固定在在Fe3O4載體表面的酶等物質(zhì)，也阻礙了磁場對粒子的取向作用而導(dǎo)致了其飽和磁強度的下降。

2.3 熱失重分析

固定化酶的熱失重分析如圖3所示。由圖可以看出，溫度在0-200℃時，磁性載體和固定化酶的曲線都有所下降，表示這兩種樣品都有失重，其值分別大約為7.2%和7.4%，這部分失重是由載體上的水分和可揮發(fā)物損失造成的，隨著加熱溫度的進一步升高，曲線進一步下降，表示載體上的包裹物和固定上去的酶逐漸被燒掉，兩種樣品在這一階段的失重分別為22.8%和30.6%，當(dāng)溫度達(dá)到600℃左右時，曲線逐漸趨向水平，表示剩下不能被燒掉的Fe3O4，由此可以計算出，載體上固定的脂肪氧合酶的量約為固定化酶樣品質(zhì)量的7.6%。

2.4 pH對酶活性能的影響

pH值通過影響酶分子活部位上的有關(guān)基團而對酶活產(chǎn)生影響，從而進一步對酶與底物的結(jié)合與催化產(chǎn)生影響。如圖4所示，固定化酶的最適pH為9.0，游離酶的最適pH為8.0，脂肪氧合酶經(jīng)固定化后，其最適pH值向堿性方向發(fā)生了移動，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是納米磁性微粒作為一種復(fù)合的堿性氧化物，對酸的耐受性較差，需要在更的堿性環(huán)境下對酶的活性中心構(gòu)想產(chǎn)生一定影響。

2.5 溫度對酶活性能的影響

溫度對酶活的影響由圖5所示，由圖可知溫度對酶活影響較大，游離酶和固定化酶的最適溫度為都為30℃。從圖中可以看到，固定化酶的酶活變化比游離酶要平緩，說明載體對酶有一定的保護作用，降低了其對溫度的敏感性，而且固定化酶在25℃-35℃內(nèi)都保持了較

高的活力，擴大溫度應(yīng)用范圍，這可能是因為交聯(lián)后酶活中心部分活化降低了反應(yīng)所需的活化能所致，因此將脂肪氧合酶固定化有利于降低酶對溫度的要求而有利于其進一步應(yīng)用。

2.6 雙氧水對酶活性能的影響

過氧化物對脂肪氧合酶的活性可以起到誘發(fā)的作用，在反應(yīng)液中添加適量的過氧化物有利于脂肪氧合酶活性的提高。因此，實驗測定了H2O2對脂肪氧合酶活性的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖可以看出，當(dāng)H2O2的濃度達(dá)到12g/L時，游離酶和固定化酶的活性達(dá)到了最大，而且游離酶和固定化酶的活性都隨著H2O2濃度的增加而增加，酶的活性達(dá)到最高后，H2O2濃度繼續(xù)增加時，酶的活性反而開始下降，出現(xiàn)這種現(xiàn)象是原因可能是，反應(yīng)液中過多的H2O2會改變酶的結(jié)構(gòu)而抑制了酶的活性。

3 結(jié)論

實驗采用溶膠凝膠法制備了納米磁性四氧化三鐵，然后用殼聚糖對納米顆粒表面進行了修飾得到了復(fù)合載體，再以戊二醛為交聯(lián)劑，將脂肪氧合酶固定了在復(fù)合載體上；合成的納米磁性四氧化三鐵呈亮黑色球狀粒子，酶固定化載體仍表現(xiàn)出較好磁性，載體上酶的含量占載體質(zhì)量的7.6%；當(dāng)溫度為30℃、pH8.0、H2O2濃度達(dá)到12.0g/L時，游離酶的酶活達(dá)到最大；當(dāng)溫度30℃、pH9.0、H2O2濃度達(dá)到12.0g/L時，固定化酶的酶活達(dá)到最大；實驗結(jié)果表明通過交聯(lián)的方法成功將脂肪氧合酶固定在了納米磁性四氧化三鐵顆粒上，并表現(xiàn)出了較好的活性。

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Immobilization of Lipoxygenase onto Chitosan Nanometer Magnetic Microspheres

Nanometer Fe3O4was prepared by sol-gel method and modified with chitosan to obtained composite carriers of magnetic microspheres. Lipoxygenase was immobilized onto the composite carriers by glutaraldehyde. The influence factors on enzyme activity for free and immobilized enzyme were studied. The TEM results showed that the nanoparticles were black and the shape of sphere. The diameters of the nanoparticles were about 150 nm. The mass of enzyme immobilized on the composite carriers was about 7.6% of the immobilized enzyme mass. The optimum temperature and pH of free enzyme were 30℃and 8.0 while the parameters of immobilized enzyme were 30℃ and 9.0. The free and immobilized enzyme exhibited the highest enzyme activity when H2O2concentration reached 12.0 g/L. The results indicated that the lipoxygenase was successfully immobilized onto the nanoparticles and showed higher activity.

nanometer magnetic Fe3O4， immobilized enzyme， lipoxygenase， enzyme activity

Q5

A

1674-2060（2016）02-0003-03

夏云空（1982—），男，漢族，河北邯鄲人。現(xiàn)從事于血液制品行業(yè)，就職于成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，具有9年的生產(chǎn)工作經(jīng)驗，同時為四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2012級在職研究生。