細(xì)胞間質(zhì)液壓升高對肝星狀細(xì)胞的影響

黃子圣 黃迪,3 黃宇,3 何志翔, 李佩霖 翁杰鋒,3 李桃生,3 古維立,,3

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院 肝膽外科(廣州 510180) 2 華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肝膽外科(廣州 510180) 3 廣州消化疾病中心 (廣州 510180)

肝纖維化(hepatic fibrosis， HF)目前是世界上常見的疾病之一，是導(dǎo)致其他肝病如肝硬化和肝癌的主要原因。肝纖維化是一個動態(tài)的過程，其特征是任何病因的慢性肝損傷，包括病毒感染、酒精性肝病等引起細(xì)胞微環(huán)境變化[1-2]。長期以來，生物力學(xué)一直是肝病學(xué)研究和治療的重點(diǎn)。既往研究表明，門靜脈高壓癥，膽管梗阻等機(jī)械動力學(xué)變化，可能激活肝星狀細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝纖維化，其中門靜脈高壓被認(rèn)為是決定患者功能狀態(tài)的關(guān)鍵因素[3]。細(xì)胞間質(zhì)液壓力(interstitial fluid pressure，IFP)作為生物力的關(guān)鍵部分，對細(xì)胞的分化，生長和存活有著重要影響[4]。然而，細(xì)胞間質(zhì)液壓力對肝星狀細(xì)胞激活和增殖的影響和以及是否影響肝細(xì)胞的表型變化目前仍然模糊不清[5-6]。我們擬通過模仿細(xì)胞間質(zhì)液壓力的升高，對肝星狀細(xì)胞給予不同程度的機(jī)械性壓力性刺激，觀察壓力刺激對肝臟組織細(xì)胞特性的影響效果。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人肝星狀細(xì)胞(HSC)購自Sciencell(#5300)；Triton X-100購自SIGMA(美國)，α-SMA抗體，ROCK抗體，RhoA抗體購自CST公司(美國)，藥物ROCK抑制劑Y-27632購自ATCC公司(美國)；共聚焦顯微鏡OLYMOUS，日本。Roche LightCycler 480# PCR 儀(美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人肝星狀細(xì)胞隨機(jī)分為3組，每組3皿，其中模型組：將其置于壓力箱中施加恒定的高于大氣壓50 mmHg壓力；實驗組：加入ROCK抑制劑Y-27632(濃度10 μmol)置于與實驗組相同條件；對照組：不加壓置于相同培養(yǎng)箱中。模型組及實驗組分別加壓1 h和12 h后取細(xì)胞于光鏡觀察。

1.2.2 肝纖維化相關(guān) PCR 檢測

實時熒光定量PCR法檢測各組HSC細(xì)胞中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA的表達(dá)量：收集處理過12 h各組HSC細(xì)胞，加入Trizol裂解液，參照 Trizol 試劑 說明書提取各組細(xì)胞的總RNA。 以超微量蛋白核 酸定量檢測儀測定 RNA純度和濃度， 選取合格RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以稀釋的 cDNA 為模板，使用實時熒光定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行檢測。α-SMA 的正向引物序列為5′GTGACGAAGCACAGAGCAAA 3′；反向引物序列為5′CTTTTCCATGTCGTCCCAGT 3′；RhoA的正向引物序列為5′CAGAAAAGGGACCCCAGAA 3′，反向引物序列為 5′GCAGCTGCTCTCGTAGCCATTTC 3′；ROCK1的正向引物序列為5′AACATGCTGCTGGATAAATCTGG 3′，反向引物序列為5′AGGAAGGCATGGTACGATGTGATACA 3′。GAPDH的正向引物序列為 5′GACTCATGACCACAGTCCATGC 3′；反向引物序列為 5′AGAGGCAGGGATGATGTTCTG 3′。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以 GAPDH為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCT法計算各組HSC 細(xì)胞中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA基因的相對表達(dá)水平。

1.2.3 免疫熒光染色檢測α-SMA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)

免疫熒光檢測α-SMA、ROCK1、ROCK2的表達(dá)：各組細(xì)胞按實驗條件處理12 h，然后應(yīng)用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%Triton-X100通透10 min，封閉液室溫下封閉1 h，一抗4 ℃過夜，熒光二抗室溫避光孵育2 h；DAPI染色10 min，滴加封片劑封片，熒光顯微鏡下拍照。實驗重復(fù)3次，見表1。

表1 間質(zhì)液壓變化對各組肝星狀細(xì)胞α-SMA、ROCK1、ROCK2 熒光值比較

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 間質(zhì)液壓變化對人肝星狀細(xì)胞的形態(tài)影響

隨著間質(zhì)液壓的增加，經(jīng)過1 h或12 h 50 mmHg 壓力加壓后，HSC細(xì)胞的大小和形態(tài)在光鏡下并未出現(xiàn)明顯改變。說明50 mmHg壓力對細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化影響不大，見圖1。

圖1 光鏡下間質(zhì)液壓變化對肝星狀細(xì)胞的形態(tài)影響

2.2 間質(zhì)液壓變化對人肝星狀細(xì)胞中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA的表達(dá)量影響

通過 qRT-PCR 檢測各組肝星狀細(xì)胞α-SMA、RhoA、ROCK mRNA表達(dá)水平，可見在各組肝臟中均有表達(dá)(見圖2)。通過比較對照組與模型組細(xì)胞各種細(xì)胞因子的表達(dá)，在1 h壓力組中，α-SMA、RhoA mRNA的表達(dá)量均比對照組表達(dá)量增加，而 ROCK mRNA的表達(dá)量無明顯變化；12 h組中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA的相對表達(dá)量分別為6.14±0.69、0.95±0.22、1.13±0.22，12 h組中α-SMA mRNA的表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 間質(zhì)液壓變化對各組肝星狀細(xì)胞α-SMA、RhoA、ROCK mRNA表達(dá)量比較ns P>0.05， **P<0.01(α-SMA 1h P=0.001 5，12h P=0.000 5；RhoA 1h P=0.000 1，12h P=0.065 6；ROCK 1h P=0.084 6,12h P=0.106 8)

2.3 免疫熒光染色檢測間質(zhì)液壓變化對肝星狀細(xì)胞中α-SMA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)

在人肝星狀細(xì)胞中，α-SMA主要在細(xì)胞骨架上表達(dá)(見圖3)，ROCK1蛋白主要在人肝星狀細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，ROCK2蛋白在人肝星狀細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，免疫熒光表現(xiàn)為綠色。免疫熒光染色結(jié)果顯示：經(jīng)壓力處理后的肝星狀細(xì)胞α-SMA、ROCK1蛋白水平增加，而ROCK2蛋白表達(dá)水平無明顯改變，提示間質(zhì)液壓變化處理可引起肝星狀細(xì)胞表達(dá)更多的α-SMA及 ROCK1蛋白。經(jīng)ROCK抑制劑Y-27632處理后，各組的蛋白表達(dá)均有下降，且能降低肝星狀細(xì)胞的α-SMA的表達(dá)。(見圖3)

肝星狀細(xì)胞的α-SMA蛋白在間質(zhì)液壓變化處理后表達(dá)明顯，而在用ROCK抑制劑Y27632處理后，其表達(dá)明顯減少。ROCK1蛋白在人肝星狀細(xì)胞主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)少許表達(dá)，在間質(zhì)液壓變化處理后顯著表達(dá)，使用ROCK抑制劑Y27632處理后，與模型組相比其表達(dá)明顯減少，而與對照組差異不大。ROCK2蛋白在人肝星狀細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有所表達(dá)(見圖3)，在對照組中ROCK2蛋白表達(dá)量較高， 其在經(jīng)壓力處理后的星狀細(xì)胞表達(dá)與對照組相比無明顯差異，而在用ROCK抑制劑Y27632處理后，與模型組相比其表達(dá)明顯減少(P<0.01)，而與對照組差異不大。

圖3 間質(zhì)液壓變化對各組肝星狀細(xì)胞α-SMA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)ns P>0.05， **P<0.01(α-SMA pre P=0.000 1，Y27 P=0.078 9；ROCK1 pre P=0.000 1，Y27 P=0.000 6；ROCK2 pre P=0.370 9，Y27 P=0.000 1)

3 討 論

細(xì)胞是受牛頓力學(xué)定律控制的動態(tài)物理結(jié)構(gòu)，具有精確感知和施加機(jī)械力的能力。它們將機(jī)械信號與化學(xué)信號整合在一起，并根據(jù)各種外部機(jī)械信號改變行為[1]。肝纖維化是一個動態(tài)的過程，其特征是任何病因的慢性肝損傷，包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等引起細(xì)胞微環(huán)境改變而導(dǎo)致的。由于體內(nèi)所有細(xì)胞液體微環(huán)境會受到一些常見的機(jī)械力的影響，不同類型的細(xì)胞的機(jī)械敏感性也會有所不同，對特定機(jī)械刺激的閾值不同。既往研究表明[2]，門靜脈高壓癥，膽管梗阻等機(jī)械動力學(xué)變化，可能激活肝星狀細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝纖維化，但細(xì)胞間質(zhì)液壓對肝星狀細(xì)胞激活和增殖的影響和以及是否影響肝細(xì)胞的表型變化目前仍然模糊不清。細(xì)胞骨架從細(xì)胞外基質(zhì)接收到的機(jī)械力信號不僅改變細(xì)胞本身的功能形態(tài)，而且還通過鈣黏著蛋白-細(xì)胞粘附復(fù)合物轉(zhuǎn)移到了相鄰的細(xì)胞。細(xì)胞通過改變其微環(huán)境的組成，組織的彈性，并響應(yīng)于這種抗張性互相調(diào)節(jié)。因此，通過模仿細(xì)胞間質(zhì)液壓的升高，我們試圖對肝星狀細(xì)胞給予不同程度的機(jī)械性壓力性刺激，觀察壓力刺激對肝臟組織細(xì)胞特性的影響。

轉(zhuǎn)化蛋白RhoA是Rho GTP酶家族中的一種小GTP酶蛋白。其功能主要與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)[5]。ROCK最初被認(rèn)為是RhoA的下游效應(yīng)子?？沈?qū)動細(xì)胞收縮，并且是纖維化病理的介質(zhì)。肌成纖維細(xì)胞的ROCK活性可通過纖維化期間增加肺基質(zhì)的剛度，誘導(dǎo)HSC向肌成肌纖維表型的分化，增加α-SMA的表達(dá)，增強(qiáng)肌動蛋白細(xì)胞骨架的聚合活化[7]。在纖維化過程中，ROCK介導(dǎo)的作用是機(jī)械敏感性的[8]。這與我們研究結(jié)果相符，當(dāng)肝星狀細(xì)胞暴露在高間質(zhì)液壓環(huán)境下，α-SMA的表達(dá)升高，且與ROCK1的表達(dá)相聯(lián)系。

在組織纖維化前期，組織內(nèi)部往往有強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，微環(huán)境中的溫度，氧氣利用率，細(xì)胞因子和滲透壓等會出現(xiàn)大幅度波動從而引起間質(zhì)液壓力的變化。這與我們研究發(fā)現(xiàn)間質(zhì)液壓力早期對肝星狀細(xì)胞的影響相符，RhoA mRNA在肝星狀細(xì)胞中只有在加壓早期的表達(dá)上升，在壓力后期表達(dá)與對照組無差異。我們研究發(fā)現(xiàn)，升高的細(xì)胞間質(zhì)液壓通過ROCK1而非ROCK2引發(fā)肝星狀細(xì)胞的活化。在一般環(huán)境下，肝星狀細(xì)胞中的ROCK1和ROCK2蛋白的表達(dá)已有著明顯差異，ROCK1的表達(dá)量少而ROCK2的表達(dá)量高。在間質(zhì)液壓升高情況下，肝星狀細(xì)胞中的α-SMA大量表達(dá)，提示肝星狀細(xì)胞激活，證實了機(jī)械壓力對肝纖維化的促進(jìn)作用。與此同時我們發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞中ROCK1的表達(dá)有著明顯提高，而ROCK2表達(dá)量則幾乎不變，這提示機(jī)械壓力對肝星狀細(xì)胞的刺激主要影響ROCK1，這為我們使用ROCK制劑治療肝纖維化提供了依據(jù)。使用ROCK抑制劑Y27632后ROCK1和ROCK2的表達(dá)明顯較少，同時α-SMA的表達(dá)也明顯減少，證明了ROCK抑制劑對肝纖維化的發(fā)展的抑制效果。我們的研究表明細(xì)胞間質(zhì)液壓升高能通過RhoA/ROCK1信號通路引起肝星狀細(xì)胞的活化，研究RhoA/ROCK1信號通路可能為將來開發(fā)一種新的臨床治療肝纖維化的方法提供實驗基礎(chǔ)。